慢病毒滴度检测 SOP
慢病毒包装和滴度检测方案流程
慢病毒包装、滴度测定方案流程一、背景：四质粒的包装体系1.含有目的基因的转染质粒2.VSV-G：pMD2.G（包膜质粒）3.Rev：pRSV-Rev4.Gag/Pol：pMDLg/pRRE二、包装细胞：293T293T细胞由293细胞通过基因技术派生出的细胞系，是经过腺病毒E1A基因的转染，能表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区。
该细胞贴壁松散，操作时请尽量轻柔；换液时需预热培养基。
培养条件：DMEM ＋10% FBS＋1% P/S三、主要试剂1.93T培养基：高糖DMEM（含丙酮酸钠、谷氨酰胺）+ 10% FBS + GlutaMAX2.病毒收获培养基：取50 ml 293T培养基，加入0.5 g BSA（Sigma A9418）和终浓度为10-15 mM的HEPES，0.22 µm过滤。
3.无内毒素质粒抽提试剂盒4.Polybrene (10 mg/ml)：促转染试剂，提高转染效率。
四、包装步骤1.Day1:汇合度90%的10cm dishs HEK293T细胞（~ 6×107/dish）按1：1比例传代至15cm dishs，第二天细胞汇合度达到90%-95%（~1.5×108/dish），培养基为Gibico高糖DMEM培养基（含10%FBS）。
2.Day2:1)转染前2-3个小时更换培养基（含10%FBS)；2)按照以下比例配制转染试剂：Mix 1体积μlMix 2量DMEM（无FBS）1000μlDMEM（无FBS）1000μl目的基因质粒25μgVGF190μl（1μg/μl）PMD2G7.5μgPSPAX215μgMix 1和Mix 2分别混合后，室温5-10min, 后将Mix 1和Mix 2混合，室温30min，加入至15cm dish中。
（细胞达到汇合度90%，细胞过少会影响转染效率）。
3.Day36h-24h内更换新鲜培养基（含10%FBS），观察转染效率并拍照。
慢病毒滴度测定方法简介
慢病毒滴度测定方法简介(表达荧光的慢病毒)Day 0：将生长状态良好的293T 细胞消化计数后稀释至1⨯105/ml, 加入96孔板，100 μl/孔(1⨯104个细胞)，每种病毒需要6个孔。
放入37℃，5% CO2培养箱中培养过夜。
Day 1: 在EP 管中做10倍梯度稀释，连续6个稀释度。
稀释方法如下：每种病毒准备6个1.5 ml EP 管，每管加入90 μl完全培养基，往第一个管中加入10 μl病毒原液，混匀后，吸取10 μl 加入第二个管混匀。
以此类推。
然后把稀释好的病毒和细胞孵育过夜。
Day 2：吸去带有病毒的培养液，在每个孔中再加入100 μl 完全培养液，以利于细胞的生长。
Day 3：显微镜观察荧光。
此时荧光会有初步表达。
Day 4：在荧光显微镜下观察结果，对荧光比例合适（10-30%之间）的孔进行细胞计数，并计算滴度。
其计算公式如下:滴度（TU/ml）=细胞数⨯荧光百分比⨯103/病毒原液体积(μl)。
举例：③号管对应孔的荧光比例为30%，细胞总数为8⨯104，滴度（TU/ml）=8⨯104⨯30%⨯103/0.1=2.4⨯108如果要感染2×105个细胞，MOI=30（1个细胞对应30个病毒粒子）（见下注），则需要病毒体积为=2×105⨯30/2.4⨯108（ml）=0.025 ml=25 μl.注：MOI值: MOI 是multiplicity of infection的缩写，中文译为感染复数,实际的含义即为每个细胞被多少个有活力病毒所感染。
各种细胞的最适MOI值有差别，请客户正式实验前先进行预实验摸索最适MOI。
慢病毒包装、纯化、滴度测定及感染
慢病毒包装、纯化、滴度测定及感染一、包装1.包装细胞Lenti-X™ Lentiviral Expression Systems User Manual.pdf（P11）; Lenti-X™ shRNA Expression Systems User Manual.pdf(P16)2.病毒载体及包装质粒病毒载体：DNA组构建及中量提取；包装质粒：商品化产品（Lenti-X™ Lentiviral Expression Systems User Manual.pdf（P12）; Lenti-X™ shRNA Expression Systems User Manual.pdf(P17)）或DNA中量提取（目前唯一使用来源）；3.细胞转染方法一：Lenti-X™ Lentiviral Expression Systems User Manual.pdf（P12）;Lenti-X™ shRNA Expression Systems User Manual.pdf(P17)；方法二：按照Lipofectamine™LTX & Plus Reagent (Cat.No.15338,invitrogen)进行，简要中文说明如下：a. 转染前24小时，把4–5 x 106个293T细胞传代至10cm培养皿中，加入完全培养基至终体积10ml，培养过夜，转染时，细胞密度为80–90%；b. 293T细胞转染前2小时换上9ml新鲜的完全培养基；c. 用之前充分混匀PLUS Reagent，在EP管中加入15ug的DNA混合物(pLVX-shRNA Plasmid DNA：pMDLg：pRes-Rev：pCMV-VSV-G 的摩尔比为1：1：1：1)，15ul的PLUS Reagent，用Opti-MEM定容到500ul，标记为Tube 1，温和混匀，室温孵育5分钟；d. 充分混匀Mix Lipofectamine LTX，在EP管中加入45ul的Mix LipofectamineLTX和455ul的Opti-MEM，标记为Tube 2，温和混匀；e. 将Tube 1的溶液加到Tube 2中，温和混匀，室温孵育5分钟；Tube 1 (Plasmid DNA) Tube 2 (LTX)15ug DNA MIX(pLVX-shRNA Plasmid DNA：455 µl Opti-MEMpMDLg：pRes-Rev：pCMV-VSV-G=1:1:1:1)15 µl PLUS Reagent 45 µl Mix Lipofectamine LTX Up to 500µl Opti-MEM 500 µl Total V olume500 µl Total Volumef. 将1 ml 转染复合物逐滴加入前一天种好细胞的100mm皿中，边加边摇匀。
关于慢病毒感染的相关知识总结
慢病毒使用操作手册一、慢病毒的储存与稀释:1. 病毒的储存：收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存；如需长期保存请放置于-80℃（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口）①病毒可以存放于-80℃6个月以上；但如果病毒储存时间超过6个月，建议在使用前需要重新滴定病毒滴度②反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%；因此在病毒使用过程中应仅尽量避免反复冻融，为避免反复冻融,建议收到病毒后按照每次的使用量进行分装。
2. 病毒的稀释：如果需要稀释病毒，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)。
混匀分装后4℃保存(请尽量在三天内用完) 分装后使用。
二、慢病毒用于体外（In Vitro）实验：感染培养原代细胞和建系细胞。
慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同，在使用慢病毒之前可以通过查阅相关文献，了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性，感染复数（MOI 值）以及在体（In Vivo）注射所需要的病毒量。
如果没有相关文献支持，可以通过感染预实验得到合适的感染复数（MOI 值）（使用24孔板检测病毒对目的细胞的亲嗜性）。
慢病毒感染目的细胞预实验1. 慢病毒感染目的细胞预实验注意事项：①测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的细胞(HEK293T，Hela）作为平行实验的对照细胞。
②在进行慢病毒感染实验时，可以用完全培养基（培养目的细胞用）稀释；理论上，含有血清，双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。
③一般慢病毒单位为TU/ml，即每毫升中含有具有生物活性的病毒颗粒数。
如：病毒滴度为>1X108 TU/ml 即每毫升病毒液中至少含有1X108个具有生物活性的慢病毒颗粒。
2. 以24孔培养板为例，进行目的细胞和HEK293T 细胞的感染预实验实验前按照不同的MOI设置不同的感染孔，并根据MOI和细胞数量计算所需要的病毒量，如有必要可以使用PBS溶液或者无血清培养基稀释病毒原液。
怎么检测慢病毒滴度呢？
怎么检测慢病毒滴度呢？
滴度（Titer）：单位体积中有感染能力的病毒数目；单位：TU/mL（活性滴度单位）。
通常来说LV滴度检测：越准确，就越花时间；越省事的，就越不准确。
根据并不是所有的实验要求都需要精确检测，例如对于构建基因稳定过表达或干扰表达（shRNA）的细胞株，由于有后续的筛选的过程，就可采取快速检测法（死病毒也会检测出来）。
LV滴度的快速检测包括QPCR，ELISA和试纸法。
其差异在于，QPCR法：检测病毒核酸量；ELISA法：检测病毒衣壳蛋白量；试纸法：检测病毒p24衣壳蛋白含量。
而对于做RNAi-screening或CRISPR-screening等研究，则需要精确检测LV的滴度，包括荧光报告基因法和抗生素筛选法。
吉凯基因慢病毒滴度检测方法
吉凯基因慢病毒滴度检测方法逐孔稀释滴度测定法:一：样品准备1.检测前一天，对293T 细胞传代，每个24 孔中加１×105 个细胞，体积为500μL；2.次日，准备7~10 个无菌的Ep 管，在每个管中加入90 μL 的培养基（DMEM+10%FBS）；3.取待测定的病毒原液10μL 加入到第一个管中，混匀后，取10 μL 加入到第二个管中。
继续相同的操作直到最后一管；4.选取所需的细胞孔，吸去90 μL 培养基。
加入稀释好的病毒溶液。
放入37℃5%CO培养箱中培养；25.48 小时后，加入新鲜培养基500 μL。
小心操作，不要吹起细胞；6. 4 天后，抽提RNA 准备做RT-qPCR。
二：Real time 定量PCR 法测定滴度具体操作内容参考“吉凯基因慢病毒包装手册”14页“2) Real time 定量PCR 法测定滴度”三：滴度计算方法1.加入不同病毒量的细胞样品，通过提取总RNA后反转录为cDNA，然后进行定量PCR检测，通过比较control组和试验组的Ct值差异判断滴度值。
通常情况下，认为Ct值差异2以上存在显著差异。
2.反转录反应所获得的20 μL cDNA中只取了1 μL用于实时定量检测，所以该结果仅表示1/20样品的情况，所以在滴度计算时应该乘以系数20。
3.例如：若某次滴度检测中，1.00E-05 μL组样品和control组样品的Ct值存在2个左右差异，则认为在1.00E-05 μL组样品中存在病毒颗粒。
假定该组样品含有至少有1个病毒颗粒，则病毒的滴度为：1/(1.00E-05) *20＝2.00E+6 TU/μL=2.00E+9 TU/ml。
四：融解曲线说明由于SYBR GreenⅠ与所有的双链DNA相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。
通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产物的影响。
由熔解曲线来分析产物的均一性有助于更准确地分析SYBR Green Real-Time PCR定量结果。
慢病毒收毒及纯化 SOP
慢病毒收毒及纯化标准操作细则1. 目的：规范慢病毒收毒及纯化标准操作程序2. 范围：适用于慢病毒收毒及纯化操作工序3. 操作程序3.1器材准备无菌10ml玻璃吸管、电动移液枪、50ml离心管，移液枪、各种枪头，1.5mL EP管、试管架，酒精灯、荧光显微镜、CO2培养箱、生物安全柜, 15ml超滤管、0.22μm滤膜、50mL无菌注射器、1mL无菌注射器,离心机3.2溶液准备OMEM培养基,1640培养基，FBS（gemini）3.3操作步骤3.3.1收集转染后48小时的细胞上清液于一个50ml离心管中，并更换10mL新的1640培养基，72小时（从转染开始计时）后再收集一次，并混合到一起。
3.3.2 4000rpm，离心5分钟，用0.22μm滤膜过滤收集好的上清液到新的50ml离心管中。
3.3.3准备一个15ml的超滤管，将过滤收集的上清液，根据上清液毫升数，分批次加入超滤管中（每次大约加入5ml）进行离心，4000rpm，离心10-15分钟，根据具体情况调整离心时间。
3.3.4每离心完成一次后，把管底部的废液弃掉，再加入新的上清液继续离心，最后一次离心完后，超滤管中保留500ul左右的病毒液，然后用移液器反复吹悬超滤管中病毒液，转移到无菌的EP管中。
3.3.5收集重悬后的慢病毒浓缩液于1.5mL离心管中，并做好标记，以10000rpm离心5min，以进一步去除其他杂质颗粒。
3.3.6用一支2mL注射器收集离心后的上清液，用0.22μm滤膜过滤于另一支干净的1.5mL EP管中，做好标记。
3.3.7根据需要将过滤后的样品进行小体积（50μL或20μL）分装，保留部分样品～20μL用于滴度检测，并做好标记，贴好标签。
填写入库记录，并将分装好的病毒进行入库，保存于-80℃冰箱。
3.4清场3.4.1物品集中在废液桶中灭菌后清洗。
3.4.2操作室台面用75%酒精擦拭消毒后，开启紫外灯进行灭菌。
慢病毒使用操作手册
慢病毒使用操作手册：1 慢病毒使用操作2 慢病毒安全使用规范3 悬浮细胞感染方法概要4 相关专业术语(详情可参考公司网站FAQ)5 细胞培养器皿的相关参数1、慢病毒使用操作手册1.1 慢病毒的储存与稀释:1.1.1 病毒的储存：用户收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存；如需长期保存请放置于-80℃（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口）A．病毒可以存放于-80℃ 6个月以上；但如果病毒储存时间超过6个月，我们建议在使用前需要重新滴定病毒滴度B．反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%；因此在病毒使用过程中应仅尽量避免反复冻融，为避免反复冻融我们强烈建议客户收到病毒后按照每次的使用量进行分装。
1.1.2 病毒的稀释：用户需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后4℃保存(请尽量在三天内用完) 分装后使用。
1.2 慢病毒用于体外（In Vitro）实验：感染培养原代细胞和建系细胞1.2.1 慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同，用户使用Invabio提供的慢病毒之前可以通过查阅相关文献，了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性，感染复数（MOI 值）以及在体（In Vivo）注射所需要的病毒量。
如果没有相关文献支持，可以通过感染预实验得到合适的感染复数（MOI 值）（使用24孔板检测病毒对目的细胞的亲嗜性）1.2.2 慢病毒感染目的细胞预实验1.2.2.1 慢病毒感染目的细胞预实验注意事项A．测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的细胞(HEK293T，Hela）作为平行实验的对照细胞。
B．在进行慢病毒感染实验时,可以用完全培养基（培养目的细胞用）稀释；理论上，含有血清，双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。
C． Invabio提供的病毒单位为TU/ml, 即每毫升中含有具有生物活性的病毒颗粒数。
慢病毒实验方法
慢病毒包装、浓缩纯化及滴度测定一、试剂、耗材及仪器1.1试剂1.1.1 商品化试剂及试剂盒名称厂家货号Lenti-X 293T Cell Line clontech632180 DMEM Gibco C11995500BTFetal Bovine Serum, Qualified, Australia Origin LifeTechnologies10099-141Lipofectamine™LTX & Plus Reagent invitrogen15338 QIAGEN Plasmid Midi Kit (25)QIAGEN121431.1.2 试剂配制a. 氨苄青霉素储液称取氨苄青霉素10g，加8ml 超纯水，溶解，定容至10 ml，过滤除菌，分装，-20℃保存。
b. LB液体培养基实用文档称取蛋白胨（tryptone）10g、酵母提取物（yeast extract）5g、NaCl 10 g，加800 ml 超纯水，用10M NaOH调节pH至7.0，定容至1, 000 ml，分装，高压灭菌(121℃/20min)，4℃保存。
c. 完全培养基把DEME培养基与血清按照9:1(V/V)进行混合。
d. 50%PEG6000溶液称取125gPEG6000用超纯水溶解，定容到250ml，分装，高压灭菌(121℃/20min)，4℃保存。
e. 4M NaCl溶液称取46.752gNaCl，加超纯水溶解，定容到200ml，分装，高压灭菌(121℃/20min)，4℃保存。
f. PBS缓冲液称取8gNaCl，0.2gKCl，3.58gNa2HPO4.12H2O，0.27gKH2PO4，加800 ml 超纯水，调节pH至7.4，定容至1, 000 ml，分装，高压灭菌(121℃/20min)，4℃保存。
实用文档1.2 耗材名称厂家货号25cm2 Growth Area Flasks corning430639 75cm2细胞培养瓶corning430641 TC表面细胞培养皿，规格：35mm corning430165 TC表面细胞培养皿，规格：60mm corning430196 TC表面细胞培养皿，规格：100mm corning430293 6孔细胞培养板corning3516外旋盖冻存管corning430659 15ml尖底离心管corning430790 50ml尖底离心管corning4558 3毫升吸管Biologix30-0138A1 1.3 仪器名称仪器厂家仪器型号二氧化碳培养箱Thermo371生物安全柜Thermo Forma Class II，B2倒置荧光显微镜OLYMPUS IX71实用文档台式高速冷冻离心机Thermo LEGND MACH 1.6R小型高速离心机Thermo LEGEND MICRO 17小型冷冻高速离心机Thermo LEGEND MICRO 17R超低温冰箱SANYO MDF-U73V冰箱Haier BCD-290W二、方法2.1．包装细胞准备2.1.1.细胞复苏a. 把完全培养基预热至37℃；用清洗洁净的500ml烧杯盛300ml超纯水，然后放入37℃水浴锅中，预热至37℃（至少需30min）；准备好生物安全柜及所需培养耗材（灭菌处理）；b. 快速从液氮罐中取出装有冻存细胞的冻存管并放置于装有液氮的保温杯中，用洁净镊子取出冻存管，并立即放入上述准备好的水浴中（放入之前快速检查盖子是否拧紧，盖子切勿没入水中），用镊子镊好冻存管，快速沿着烧杯内壁转圈，细胞未冻融时切勿取出观察，细胞冻融时间一般为1-2 min，如果超过2 min仍未冻融，应掉弃该管细胞，细胞冻融后把冻存管放入70%酒精中3s，然后立即放入生物安全柜中；实用文档c. 把冻融的细胞立即转移至装有1ml预热完全培养基的15ml离心管中，混匀，立即加入4ml预热完全培养基，混匀；d. 加入5ml预热完全培养基，混匀，离心（100 g，5 min），小心移除上清；e. 加入6 ml预热完全培养基，吹打重悬细胞，然后把细胞悬液转移至T25培养瓶中，并放入二氧化碳培养箱（5% CO2, 37℃）中培养；f. 24小时观察细胞的贴壁情况，并根据细胞的密度进行换液或细胞传代；2.1.2细胞培养a. 当细胞达到80%融合时，移培养液，用PBS洗涤两次，加入1ml胰酶消化液，把培养皿置于倒置显微镜下观察，如大部分细胞变圆，立即移除胰酶消化液（如大部分细胞飘起，可不移除胰酶消化液），加入6ml 预热DMEM完全完全培养基，用吸管取培养液吹打瓶壁细胞，使其脱离瓶壁形成单细胞悬液，离心（100 g，5 min），小心移除上清，加入10ml预热完全培养基，吹打重悬细胞用细胞计数板在显微镜下计算细胞数，取1*106细胞分装入新T75培养瓶，添加基至总体积为20ml，置于37 ℃、5 %CO2 培养箱中培养；每隔2～3天传代1次，实验用第2～3代细胞。
慢病毒包装、浓缩、纯化、滴度实验步骤
资料范本本资料为word版本，可以直接编辑和打印，感谢您的下载慢病毒包装、浓缩、纯化、滴度实验步骤地点：__________________时间：__________________说明：本资料适用于约定双方经过谈判，协商而共同承认，共同遵守的责任与义务，仅供参考，文档可直接下载或修改，不需要的部分可直接删除，使用时请详细阅读内容一、包装细胞293T细胞的培养一、293T细胞的冻存1. 随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降，出现突变等。
所以要在细胞购进时就进行冻存。
2. 在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
3. 倒去细胞上清液，加入D-Hank's液洗去残留的培养基。
4. 加入0.25%的胰酶，消化10-20s后倒去。
5. 镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，加入新鲜培养基吹打混匀。
6. 细胞计数。
7.将细胞离心，1000rpm，2min。
8. 根据计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10% DMSO）重悬细胞，密度为3×106个/ml。
10. 第二天将细胞放入液氮灌，并记录。
二、293T细胞的传代1. 当细胞生长至汇合率达到80~90%需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。
2. 消化细胞，方法同上。
3. 细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。
密度为3×105个/ml。
4. 分到10cm培养皿中，10ml/皿。
三、293T细胞的复苏1. 当细胞传代次数过多（超过50代），细胞状态变差时或细胞出现污染事故时，需要丢弃并对开始冻存的细胞进行复苏。
2. 打开水浴锅，设置温度为40℃。
3. 查看细胞库记录，根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，在1~2 min内使细胞溶液完全溶解。
4. 将1ml细胞溶液加入9 ml完全培养基中并混匀后转入10cm培养皿。
5. 放回37℃、3%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。
慢病毒生产及使用操作手册
慢病毒生产及使用操作手册一、实验流程制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养48和72h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。
以下内容由汉恒生物科技（上海）有限公司精心整理总结。
二、实验材料（一）慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G,pHBLV TM系列质粒。
1、载体信息（见附录）2、细胞株 293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10% FBS)。
贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。
3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。
用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。
三、包装细胞293T细胞的培养（一） 293T细胞的冻存随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降、突变等。
为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。
在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
1、去掉上清液，加入PBS洗去残留的培养基；2、加入0.25%的胰酶，消化1～2min后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。
3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入 3mL 37 ℃预热的 10％ DMEM，用 10mL 移液管进行吹打，较大力吹打 6～8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于15mL 离心管中，取 50ul 混匀后的细胞于 1.5mL eppendorf 管中，加入 450ul 10％ DMEM，即为 10 倍稀释，混匀，取 10ul 细胞于计数板中计数。
计数板上共 4 大格，每大格 16 小格。
计数时，4 大格均计数，总数除以 4（得每大格细胞数），再乘以 10（10 倍稀释），即为实际 n万/mL 细胞浓度。
4、细胞离心，1000rpm，5min。
病毒滴度测定
可以采用倍比稀释来测定病毒的滴度。
第一个Ep管中加入10uL病毒原液，记为1E+1 uL ；第二个Ep管中进行了第一次十倍稀释，所得病毒原液为第一个Ep中的1/10，记为1E+0 uL；第三个Ep管中进行了第二次十倍稀释，所得病毒原液为第二个Ep中的1/10，记为1E-1 uL ；依次类推…第七个Ep管中进行了第六次十倍稀释，所得病毒原液为第六个Ep中的1/10，记为1E-5 uL ；第八个Ep管中进行了第七次十倍稀释，所得病毒原液为第七个Ep中的1/10，记为1E-6 uL ；换句话说：如果在加入1E-5 uL 病毒原液的孔中观察到3个带有荧光的细胞，说明该孔中至少有3个病毒颗粒感染了细胞，则该病毒的滴度等于带有荧光的细胞数除以病毒原液量，本例子中就是3/(1E-5)=3E+5，单位为TU/ uL ，也就等于3E+8 TU/mL。
稀释计数法滴度单位：TU/mL，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。
「TU」为「transducing units」的缩写，中文为「转导单位」，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。
第一天细胞准备将生长状态良好的 293 T 细胞消化计数后稀释至 1×100 000/mL，加入 96 孔板，100 μL/孔，为每个病毒准备 10 个孔。
放入 37℃，5% 二氧化碳培养箱中培养。
第二天加病毒在 EP 管中做 10 倍梯度稀释，连续 10 个稀释度。
稀释方法如下：每种病毒准备 10 个 1.5mL EP 管，每管加入 90 μL 培养液，往第一个管中加入 10 μL 病毒原液，混匀后，吸取 10 μL 加入第二个管混匀。
依此类推，做十个稀释度（10—0.00000001）。
吸取 96 孔板中原有的培养基，加入含稀释好的病毒液。
并做好标记。
第三天追加培养液在每个孔再加入 100 μL 完全培养液，利于细胞的生长。
第四天观察结果并计算滴度在荧光显微镜下观察结果，并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数。
慢病毒生产及使用操作手册
慢病毒生产及使用操作手册一、实验流程制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒,三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基,培养48和72h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液,病毒上清液通过超离心浓缩病毒。
以下内容由汉恒生物科技(上海）有限公司精心整理总结。
二、实验材料(一）慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G,pHBLV TM系列质粒.1、载体信息（见附录）2、细胞株 293T，慢病毒的包装细胞,为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM （含10% FBS).贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。
3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。
用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。
三、包装细胞293T细胞的培养（一） 293T细胞的冻存随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降、突变等。
为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。
在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
1、去掉上清液，加入PBS洗去残留的培养基；2、加入0。
25％的胰酶，消化1~2min后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时,去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中.3、细胞计数，将细胞全部晃下,加入 3mL 37 ℃预热的 10％ DMEM，用 10mL 移液管进行吹打，较大力吹打 6～8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出,置于15mL 离心管中，取 50ul 混匀后的细胞于 1.5mL eppendorf 管中，加入 450ul 10% DMEM，即为 10 倍稀释，混匀，取 10ul 细胞于计数板中计数。
计数板上共 4 大格,每大格 16 小格。
计数时，4 大格均计数，总数除以 4（得每大格细胞数），再乘以 10（10 倍稀释）,即为实际 n万/mL 细胞浓度.4、细胞离心,1000rpm，5min。
通过病毒外壳蛋白ELISA法测定慢病毒滴度
通过病毒外壳蛋白ELISA法测定慢病毒滴度简介根据ZeptoMetrix的p24试验，确定每毫升慢病毒的转导单位（TU/mL）。
通过使用来自Didier Trono的转换因子，将p24的浓度转换为病毒滴度来确定滴度计算方法。
每pgp24抗原中有大约1 x 104个慢病毒的物理微粒。
根据ELISA试验结果，每pg p24抗原中有100个转导单位（TU）。
材料•靶向选定基因的慢病毒•来自ZeptoMetrix的p24 ELISA•计算器或电子表格程序实验方案1. 稀释样品750到3000倍。
2. 使用p24 ELISA试剂盒，并按照制造商的说明进行操作。
3. 永远用空白对照使读版器“归零”。
4. 永远使用p24标准曲线进行校准。
5. 使用两种独立的稀释液用于制作标准曲线，包括五种浓度和浓度为0的p24。
6. 将标准曲线绘制成p24浓度比OD450。
7. 拟合标准曲线应依从R2> 0.95。
8. 确定斜率m和截距b。
（您也可以下载并使用附件中的电子校准表格。
）9. 根据以下公式计算稀释病毒的滴度TU/mL（您也可以下载并使用附件中的电子表格。
）注意事项下载附件中的电子表格（95 Kb）以计算TU/mL。
转换因子推导：a. （2×103个分子）×（每PP的24×103 Da p24）=（48×106）b. 48×106/Avogadro常数=（48×106）/（6×1023）= 8×10-17 g p24/PPc. 每1×10-16克p24约有1PPd. 每pg p24有1×104 PPe. 每1000PP有100TU。
慢病毒操作资料说明
慢病毒操作资料说明慢病毒操作资料说明1、Hexadimethrine bromide.pdf：这是Hexadimethrine bromide（别名Polybrene）的说明书，该试剂用于提高慢病毒的感染效率，在病毒滴度测定和病毒感染实验中均需使用；2、Lenti-X™ Concentrator.pdf：这是Lenti-X Concentrator的说明书，该试剂用于病毒粒子的浓缩纯化；3、Lenti-X™ Lentiviral Expression Systems User Manual.pdf：这是过表达慢病毒（用于基因过表达）的操作说明书4、Lenti-X™ shRNA Expression Systems User Manual.pdf：这是干扰慢病毒（用于基因干扰）的操作说明书5、pLVX-shRNA1 Vector Information.pdf：pLVX-shRNA1慢病毒干扰载体说明书6、pLVX-IRES-Neo Vector Information.pdf：pLVX-IRES-Neo 慢病毒过表达载体说明书7、慢病毒（Lentivirus）载体.pdf：慢病毒载体介绍8、Lenti-X™ Lentiviral Packaging Systems FAQs.pdf：慢病包装系统常见问题介绍9、病毒纯化-PEG6000.doc：病毒纯化方法10、病毒滴度测定-针对没有绿色荧光蛋白标记的病毒.doc：病毒滴度测定-针对没有绿色荧光蛋白标记的病毒；11、病毒滴度测定-针对有绿色荧光蛋白标记的病毒.doc：病毒滴度测定-针对有绿色荧光蛋白标记的病毒；12、Production, concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors.pdf：慢病毒包装、纯化、滴度测定操作指南，供理论学习；13、C0508磷酸钙法细胞转染试剂盒.pdf：磷酸钙转染方法；14、慢病毒实验方法.doc：慢病毒包装报告单；15、慢病毒包装、纯化、滴度测定及感染.doc：慢病毒包装、纯化、滴度测定及感染操作指南；。
慢病毒使用手册
1.慢病毒使用操作手册1.1 慢病毒的储存与稀释:1.1.1 病毒的储存：如果用户收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存；如需长期保存请放置于-80 ℃冰箱（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口）。
A．病毒可以-80 ℃保存6个月，滴度不会明显下降；但如果病毒储存时间超过6个月，我们建议在使用前需要重新滴定病毒滴度。
B．反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%；因此在病毒使用过程中应仅尽量避免反复冻融，为避免反复冻融我们强烈建议客户收到病毒后按照每次的使用量进行分装。
1.1.2 病毒的稀释：用户需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰上融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后4 ℃保存(请尽量在三天内用完) 。
1.2 慢病毒用于体外（In Vitro）实验：感染培养原代细胞和细胞建系1.2.1 慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同，用户使用慢病毒之前可以通过查阅相关文献，了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性，感染复数（MOI 值）以及在体（In Vivo）注射所需要的病毒量。
如果没有相关文献支持，可以通过感染预实验得到合适的感染复数（MOI 值）（使用细胞培养板，如96孔板、24孔板等等检测病毒对目的细胞的亲嗜性）1.2.2 慢病毒感染目的细胞预实验1.2.2.1 慢病毒感染目的细胞预实验注意事项A.测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的细胞(HEK293T，Hela）作为平行实验的对照细胞。
B.在进行慢病毒感染实验时,可以用完全培养基（培养目的细胞用）稀释；理论上，含有血清，双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。
C.我们提供的病毒单位为TU/ml, 即每毫升中含有具有生物活性的病毒颗粒数。
如：病毒滴度为1E8TU/ml 即每毫升病毒液中至少含有1E8个具有生物活性的慢病毒颗粒。
慢病毒滴度怎么检测？
慢病毒滴度怎么检测？
CAR-T技术已经在癌症治疗中显示出广阔的发展前景，这种方法正在引发癌症免疫治疗的革命性转变。
所谓CAR-T，即使用经遗传修饰的原代T细胞来表达嵌合抗原受体（CAR）基因，通过使用质粒转染，mRNA、慢病毒或逆转录病毒将CAR转导到T细胞中稳定表达以构建CAR-T 细胞，回输到人体后靶向识别杀伤肿瘤细胞[1]。
到目前为止，全球已经有五款针对血液性恶性肿瘤的自体型CAR-T上市，他们都是通过慢病毒或逆转录病毒转导的方法将目的基因转导进T细胞稳定表达，慢病毒对T细胞的转导效率是CAR-T技术的关键性步骤。
慢病毒属于逆转录病毒科，为RNA病毒，包括人免疫缺陷病毒（HIV）和猴免疫缺陷病毒（SIV）等。
如今，LV技术已成为在体内外将外源基因传递到各种类型细胞中的最有效工具之一[2-5]。
慢病毒转导基因的优点在于不仅能够感染多种分裂和非分裂细胞，还可以高效的将目的基因整合到宿主基因组并长期稳定表达[6]。
其中,人原代T细胞的高效转导仍然具有挑战性，并且实现有效基因转导的方法通常昂贵且耗时[8]。
为了建立高效稳定的制备高滴度病毒载体的方法及T细胞的高效转导方法，本文主要介绍慢病毒滴度测定的各种方法。
常用的检测方法有免疫染色法、流式细胞术法、荧光定量PCR 法、p24 蛋白酶联免疫法（ELISA）等。
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慢病毒滴度检测标准操作细则
1. 目的：
规范慢病毒滴度检测标准操作程序
2. 范围：
适用于慢病毒滴度检测操作工序
3. 操作程序
3.1器材准备
移液枪、各种枪头，1.5mL EP管、试管架，酒精灯、荧光显微镜、CO2培养箱、生物安全柜
3.2溶液准备
1640培养基，FBS（gemini），
3.3操作步骤
3.3.1检测前一天，对293T细胞传代，每个96孔中加8000个细胞，37度培养过夜，感染时细胞长至30~50％的融合密度；
3.3.2次日，准备10个无菌的Ep管，每个EP管中加入90 μL的培养基（1640培养基+10% FBS），取待测定的病毒原液10 μL加入到第一个管中，混匀（用移液枪反复吹吸混匀，注意不要吹起气泡）后，标记（10-1），取10 μL加入到第二个管中，继续相同的操作直到最后一管（10-8）。
3.3.4选取所需的细胞孔，吸去孔板中培养液，加入梯度稀释为10-3至10-8稀释好的病毒溶液90ul到孔板中，轻轻混匀，放入37℃ 5% CO2培养箱中培养；
3.3.5 24小时后，视具体情况更换新鲜完全培养基90ul。
小心操作，不要吹起细胞。
3.3.6 第四天，在荧光显微镜下观察各孔中荧光细胞数量，病毒滴度为表达荧光的细胞数乘以相应稀释倍数。
3.3.7例如：某一慢病毒感染细胞后96小时部分孔（某一视野）的荧光照片如下：
一号孔：一号稀释液，含有10*10-3ml慢病毒液
二号孔：二号稀释液，含有10 *10-4ml慢病毒液
三号孔：三号稀释液，含有10*10-5ml慢病毒液
四号孔：四号稀释液，含有10*10-6ml慢病毒液
五号孔：五号稀释液，含有10*10-7ml慢病毒液
六号孔：六号稀释液，含有10*10-8ml慢病毒液
七号孔：七号稀释液，含有10*10-9ml慢病毒液
八号孔：八号稀释液，含有10*10-10ml慢病毒液
某一病毒感染细胞293T，六号孔中观察到表达绿色荧光的细胞都至少为10个。
则病毒的滴度为： 10 TU/（10*10-8）ml=1*108TU/ml
3.3.8滴度检测数据分析及结果，统计相关数据制作慢病毒滴度检测报告。
3.4清场
3.4.1物品集中在废液桶中灭菌后清洗。
3.4.2操作室台面用75%酒精擦拭消毒后，开启紫外灯进行灭菌。
3.5 注意事项
3.5.1 梯度稀释过程中，注意及时更换枪头，避免交叉污染。
3.5.2做滴度检测的细胞，铺板前须保持状态良好。