标记免疫技术

四、均相酶免疫吸测定
基本原理：利用酶标抗体结合抗原形成复 合物后，标记酶的活性发生改变的原理， 在不将复合物与游离酶标抗体分离的情 况下，直接测定系统中总的标记酶活性 的改变，进而推算出待检样品中的抗原 量。 主要用于小分子抗原或半抗原的检测.
(一)酶扩大免疫测定技术:
（enzyme-multiplied immunoassay technique，EMIT）
technique)是标记免疫技术中发展最
早的一种。是将抗原抗体反应的特 异性与荧光物质检测的敏感性和直 观性结合起来的一种方法。
基本原理
利用荧光素标记抗体，使之在涂片上 或组织切片上与标本中的待检抗原特异 结合，采用高发光效率的点光源，透过 滤色板发出一定波长的光，使结合在标 本上的荧光素被激发而产生荧光，借助 荧光显微镜观察底物片上荧光染色形态， 来判断有无待检抗原或抗体。
第一节
酶免疫技术
基本原理
利用酶催化底物反应的生物放大作用, 提高特异性抗原-抗体免疫学反应的检测 敏感性的一种标记免疫技术。
基本特点：
①标记后保留酶和抗原(抗体)的活性。 ②酶促反应专一性，保证特异性。 ③底物反应放大作用，提高敏感性。 ④酶标试剂保存稳定。 ⑤操作简便，安全易行。
一、 酶免疫技术的分类
第三节
放射免疫技术
放射免疫分析（radioimmunoassay,RIA） 免疫放射分析（immunoradiometric assay,IRMA）
广义放射免疫技术还包括放射受体分析（使用受体测 量抗原）和放射配体结合分析（使用配体研究受体）。
特点:灵敏度高(10-9-10-15g/L)、特异性强、 重复性好等
2．间接法
3.竞争法
特点：
用于抗原和半抗原的定量测定，也可对抗体 进行测定。 酶标Ag（Ab）与样品或标准品中的非标记Ag （Ab）具有相同的与固相Ab(Ag)结合的能力。 反应体系中，固相Ab（Ag）和酶标Ag（Ab） 是固定限量的，且前者的结合位点少于酶标 记与非标记Ag（Ab）的分子数量和。 反应后，结合与固相载体上复合物中被测定 的酶标Ag（Ab）的量（酶活性）与样品中非 标记Ag（Ab）的浓度成反比。
ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗 体，在这种测定方法中有3种必要的试剂： 固相的抗原或抗体， 酶标记的抗原或抗体， 酶作用的底物。
酶联试剂
阳性对照
酶标记物
显色液 A
终止液
反应板
显色液 B
浓缩洗涤液
加样枪与吸头
阴性对照
1．双抗体夹心法
特点：
非竞争结合反应 常用于抗原的检测 适用于分子中具有至少两个抗原决定簇 百度文库多价抗原，而不能用于小分子半抗原 的检测 所用两种抗体分别针对同一个抗原分子 的不同抗原决定簇
二、荧光免疫测定技术
• 荧光免疫测定同酶免疫测定一样，根据 抗原抗体结合后是否需要将结合状态与 游离状态的的荧光标记抗原（或抗体） 分离开，而将之为均相和非均相两种类 型。
(一)时间分辨荧光免疫测定 1.基本原理
• 时间分辨荧光免疫测定(time-resolved fluorescence immunoassay，TR-FIA)是荧光分 析（FIA）的基础上，用具较长寿命荧光 的稀土金属（Eu、Tb、Sm、Dy）的作为标 记物来标记抗体或抗原，从而检测标本 中的相应抗原或抗体的新技术。
• 基本原理：标本中的抗原和ED标记的抗原与特 异性抗体竞争结合，形成两种抗原抗体复合物。 ED标记的抗原与抗体结合后由于空间位阻，不 能再与EA结合。反应平衡后，剩余的ED标记抗 原与EA结合，形成具有活性的酶，加入底物测 定酶活力，酶活力的大小与标本中抗原含量呈 正比。
五、固相膜免疫测定
• 固相膜免疫测定与ELISA相类似,其特点 是以微孔膜作为固相.标记物可用酶和各 种有色微粒子,如彩色乳胶、胶体金等。 常用固相膜为硝酸纤维素（NC）膜。 类型：免疫渗滤试验：穿流形式 免疫层析试验：横流形式 斑点酶免疫吸附试验（dot-ELISA） 免疫印迹法 (Western blot)
F/P值越高，说明抗体分子上结合的荧光 素越多，反之则越少。一般用于固定标 本的荧光抗体以F/P＝1.5为宜，用于活 细胞染色的以F/P＝2.4为宜。
抗体效价：效价越大标记抗体的特异性越 高非特异荧光越少。效价在1:16-1:32者 较为理想。 抗体特异性 ：免疫电泳和交叉免疫电泳观 察特异性沉淀线或沉淀峰，在紫外线照 射下发出强烈荧光。
• 荧光抗体是将荧光素（如FITC）与特异性抗体以 化学方式共价结合而成。 常用于标记的荧光素：异硫氰酸荧光黄（FITC） 四乙基罗丹明（RB200）
四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）
标记方法：搅拌法(适合大样品)
透析法(适合小样品)
标记抗体的纯化：透析法、层析分离法
（2）荧光抗体的鉴定
F/P比率： 将制备的荧光抗体稀释至A280≈1.0，分 别测读A280（蛋白质特异吸收峰）和标记 荧光素的特异吸收峰。
• 种类与选择
1.塑料制品 2.微颗粒 3.膜载体
（二）酶与酶作用底物
1. 用于标记酶的要求： • 酶活性高 • 标记后酶活性稳定，且不影响标记抗原 与抗体的免疫反应性 • 酶催化底物后信号易判定或测定 • 酶活性不受样品中其他成分的影响 • 酶、辅助因子及底物理化性质稳定，安 全无害，价廉
2. 常用酶及其底物 （1）辣根过氧化物酶（HRP） 常用底物： • 邻苯二胺（OPD）：反应显橙黄色，应 避光，致癌性。 • 四甲基联苯胺（TMB）：反应后呈蓝色， 无需避光，无致癌性，但水溶性差。
标记免疫技术
邹全明
第三军医大学医学检验系 临床微生物学和免疫学教研室
标记免疫技术= 免疫技术+标记技术
抗原抗体反应 示踪物标记
特异性
灵敏性
标记免疫技术的主要特点：
高特异性、高灵敏性
标记免 疫技术
免疫组 化技术
示踪物及 标记技术
免疫测 定技术
酶免疫技术 荧光免疫技术 放射免疫技术 化学发光技术 金免疫技术 生物素-亲和素 免疫放大技术 ……
用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复 合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上 的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。 （酶标抗原抗体复合物的分离）
加入底物后，底物被酶催化变为有色产物，产
物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可
根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。
（显色反应）
（二）ELISA技术类型：
2.技术类型
(1)固相双位点夹心法 (2)固相抗原竞争法 (3)固相抗体竞争法
(二)荧光偏振免疫测定
FPIA是一种均相竞争荧光免疫分析法。 其原理是：标本中的抗原与荧光标记的抗原竞 争结合抗体。反应平衡后，与抗体结合的荧光 标记抗原的量与标本中抗原浓度的量呈反比。 由于抗体的分子量远大于抗原的分子量，游离 的荧光标记抗原与结合抗体的荧光标记抗原所 产生的偏振荧光强度相差甚远。因此在FPIA中 测定的偏振荧光强度与标本中抗原的浓度呈反 比。通过小分子抗原标准品与荧光偏振强度关 系建立标准曲线，可检测小分子抗原的浓度。
4.捕获法（反向间接法） • 主要用于 血清中某种抗体亚型成分（如 IgM）的测定。
注意事项：
加样
应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加 在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。 保温 1、一般均采用水浴箱，使温度迅速平衡。 2、为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴 封纸或保鲜膜覆盖板孔。
( enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)
(一)基本原理：
使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保 持其免疫活性（固相抗原／抗体的形成） 在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗 原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载 体表面的抗原或抗体起反应（抗原抗体反应）
酶免疫组化 酶免疫技术
用于检测组织切片或细胞涂片中的抗原和抗体
均相酶免疫测定
酶免疫测定
异相酶免疫测定
固相酶免疫测定
（ELISA）
液相酶免疫测定
二、酶免疫技术的技术要点 （一）固相载体
• 基本要求 结合容量高，结合稳定；可与抗原 抗体复合物等大分子蛋白结合；生物大 分子固化后仍保持活性；固化方法简便 易行、快捷经济。
一、放射免疫分析（ RIA ） 基本原理 采用定量的标记抗原（Ag＋）和 非标记抗原（Ag）竞争性结合有限 量特异性抗体（Ab）的反应。
• 基本原理:半抗原与酶结合成酶标半抗原，保 留半抗原和酶的活性。当酶标半抗原与抗体结 合后，所标的酶与抗体密切接触，使酶的活性 中心受影响而活性被抑制。
（二）克隆酶供体免疫测定
（cloned enzyme donor immunoassay,CEDIA） 利用重组DNA技术制备β-半乳糖苷酶的两 个片段：大片段称为酶受体（enzyme acceptor,EA），小片段称为酶供体（enzyme donor,ED），两个片段本身均不具酶活性，但 结合在一起就具有酶活性，利用这一特性建立 的均相酶免疫测定称为克隆酶供体免疫测定 (CEDIA)。 CEDIA的反应模式为竞争法。
• 酶标记方法
1.交联法
以双功能交联剂为“桥”，分别与酶和 抗体（抗原）连接形成结合物。如戊二 醛交联法。
2.直接法
用过碘酸钠活化酶蛋白分子后，再与抗 体（抗原）结合。仅适用于含糖蛋白分 子的酶（如HRP）标记物制备。
（四）标记抗体鉴定 （五）免疫吸附剂 （六）试剂最佳工作浓度的选择
三、酶联免疫吸附试验
（三）技术类型
• 直接法
优点：操作简便、特异性高、非特异 荧光染色因素少。 缺点：灵敏度偏低，每检查一种抗原需制备相应的特 异荧光抗体。
• 间接法
优点：灵敏度高，在不同抗原的检测中只需应用 一种荧光抗体。既可检测抗原，也可检测抗体。
（四）荧光免疫显微技术在 医学检验中的应用
1．血清中自身抗体的检测 2．各种微生物阶快速检查和鉴定 3．寄生虫感染的诊断 4．白细胞分化抗原的检测 5．人类白细胞抗原(HLA)的检测 6．肿瘤组织中肿瘤抗原的检测 7．组织中免疫球蛋白和补体组分的检测 8．激素和酶的组织定位
（一）斑点ELISA
(dot-ELISA)
（二）免疫印迹法
（immunoblottingtest，IBT）
亦被称为Western blot 分三个阶段进行 : SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） 电转移 酶免疫定位
免疫印迹法原理示意图
第二节 荧光免疫技术 • 免疫荧光技术(immunofluorescence
（2） 碱性磷酸酶（AP）
常用底物为对硝基苯磷酸酯（p-NPP）， 产物为黄色。 *
AP灵敏性高与HRP，但不易获得纯品，稳定性及酶标记物收率 低于HRP，且价高，故应用不如HRP普及。
（三）酶标记抗体或抗原
• 基本要求： 酶标记抗原纯度要高，抗原性完整； 抗体的特异性好，效价高，亲和力强， 比活性高以及易于批量生产和分离纯化。
一、免疫荧光显微技术 （一）基本原理：使荧光抗体与标本 切片中组织或细胞表面的抗原进行 反应，洗涤除去游离的荧光抗体后， 于荧光显微镜下观察，在黑暗背景 上可见明亮的特异荧光。
（二）荧光抗体的制备
（1）荧光抗体的标记
作为标记的荧光素应符合以下要求： ①应具有能与蛋白质分子形成共价健的化学基 团，与蛋白质结合后不易解离，而未结合的色 素及其降解产物易于清除。 ②荧光效率高,与蛋白质结合后，仍能保持较 高的荧光效率。 ③荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。 ④与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与 免疫性质，与蛋白质的结合物稳定，易于保存。 ⑤标记方法简单、安全无毒。
洗涤：
决定着实验的成败。 目的：洗去反应液中没有与固相抗原或 抗体结合的物质以及在反应过程中非特 异性吸附于固相载体的干扰物质。 洗涤的方式除某些ELISA仪器配有特殊 的自动洗涤仪外，手工操作有浸泡式和 流水冲洗式两种。
比色 比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的 液体，然后将板正确放入酶标比色仪的比色架 中。用特定的波长测读吸光值。 比色结果的表达以往通用光密度（optical density，OD），现按规定用吸光度 （absorbence，A），两者含义相同。 通常的表示方法是，将吸收波长写于A字母的 右下角，如OPD的吸收波长为492nm，表示方法 为"A492nm"或"OD492nm"。