标记免疫技术

• 基本原理：标本中的抗原和ED标记的抗原与特 异性抗体竞争结合，形成两种抗原抗体复合物。 ED标记的抗原与抗体结合后由于空间位阻，不 能再与EA结合。反应平衡后，剩余的ED标记抗 原与EA结合，形成具有活性的酶，加入底物测 定酶活力，酶活力的大小与标本中抗原含量呈 正比。
五、固相膜免疫测定
• 固相膜免疫测定与ELISA相类似,其特点 是以微孔膜作为固相.标记物可用酶和各 种有色微粒子,如彩色乳胶、胶体金等。 常用固相膜为硝酸纤维素（NC）膜。 类型：免疫渗滤试验：穿流形式 免疫层析试验：横流形式 斑点酶免疫吸附试验（dot-ELISA） 免疫印迹法 (Western blot)
一、放射免疫分析（ RIA ） 基本原理 采用定量的标记抗原（Ag＋）和 非标记抗原（Ag）竞争性结合有限 量特异性抗体（Ab）的反应。
• 基本原理:半抗原与酶结合成酶标半抗原，保 留半抗原和酶的活性。当酶标半抗原与抗体结 合后，所标的酶与抗体密切接触，使酶的活性 中心受影响而活性被抑制。
（二）克隆酶供体免疫测定
（cloned enzyme donor immunoassay,CEDIA） 利用重组DNA技术制备β-半乳糖苷酶的两 个片段：大片段称为酶受体（enzyme acceptor,EA），小片段称为酶供体（enzyme donor,ED），两个片段本身均不具酶活性，但 结合在一起就具有酶活性，利用这一特性建立 的均相酶免疫测定称为克隆酶供体免疫测定 (CEDIA)。 CEDIA的反应模式为竞争法。
第三节
放射免疫技术
放射免疫分析（radioimmunoassay,RIA） 免疫放射分析（immunoradiometric assay,IRMA）
广义放射免疫技术还包括放射受体分析（使用受体测 量抗原）和放射配体结合分析（使用配体研究受体）。
特点:灵敏度高(10-9-10-15g/L)、特异性强、 重复性好等
F/P值越高，说明抗体分子上结合的荧光 素越多，反之则越少。一般用于固定标 本的荧光抗体以F/P＝1.5为宜，用于活 细胞染色的以F/P＝2.4为宜。
抗体效价：效价越大标记抗体的特异性越 高非特异荧光越少。效价在1:16-1:32者 较为理想。 抗体特异性 ：免疫电泳和交叉免疫电泳观 察特异性沉淀线或沉淀峰，在紫外线照 射下发出强烈荧光。
（三）技术类型
• 直接法
优点：操作简便、特异性高、非特异 荧光染色因素少。 缺点：灵敏度偏低，每检查一种抗原需制备相应的特 异荧光抗体。
• 间接法
优点：灵敏度高，在不同抗原的检测中只需应用 一种荧光抗体。既可检测抗原，也可检测抗体。
（四）荧光免疫显微技术在 医学检验中的应用
1．血清中自身抗体的检测 2．各种微生物阶快速检查和鉴定 3．寄生虫感染的诊断 4．白细胞分化抗原的检测 5．人类白细胞抗原(HLA)的检测 6．肿瘤组织中肿瘤抗原的检测 7．组织中免疫球蛋白和补体组分的检测 8．激素和酶的组织定位
• 酶标记方法
1.交联法
以双功能交联剂为“桥”，分别与酶和 抗体（抗原）连接形成结合物。如戊二 醛交联法。
2.直接法
用过碘酸钠活化酶蛋白分子后，再与抗 体（抗原）结合。仅适用于含糖蛋白分 子的酶（如HRP）标记物制备。
（四）标记抗体鉴定 （五）免疫吸附剂 （六）试剂最佳工作浓度的选择
三、酶联免疫吸附试验
洗涤：
决定着实验的成败。 目的：洗去反应液中没有与固相抗原或 抗体结合的物质以及在反应过程中非特 异性吸附于固相载体的干扰物质。 洗涤的方式除某些ELISA仪器配有特殊 的自动洗涤仪外，手工操作有浸泡式和 流水冲洗式两种。
比色 比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的 液体，然后将板正确放入酶标比色仪的比色架 中。用特定的波长测读吸光值。 比色结果的表达以往通用光密度（optical density，OD），现按规定用吸光度 （absorbence，A），两者含义相同。 通常的表示方法是，将吸收波长写于A字母的 右下角，如OPD的吸收波长为492nm，表示方法 为"A492nm"或"OD492nm"。
technique)是标记免疫技术中发展最
早的一种。是将抗原抗体反应的特 异性与荧光物质检测的敏感性和直 观性结合起来的一种方法。
基原理
利用荧光素标记抗体，使之在涂片上 或组织切片上与标本中的待检抗原特异 结合，采用高发光效率的点光源，透过 滤色板发出一定波长的光，使结合在标 本上的荧光素被激发而产生荧光，借助 荧光显微镜观察底物片上荧光染色形态， 来判断有无待检抗原或抗体。
二、荧光免疫测定技术
• 荧光免疫测定同酶免疫测定一样，根据 抗原抗体结合后是否需要将结合状态与 游离状态的的荧光标记抗原（或抗体） 分离开，而将之为均相和非均相两种类 型。
(一)时间分辨荧光免疫测定 1.基本原理
• 时间分辨荧光免疫测定(time-resolved fluorescence immunoassay，TR-FIA)是荧光分 析（FIA）的基础上，用具较长寿命荧光 的稀土金属（Eu、Tb、Sm、Dy）的作为标 记物来标记抗体或抗原，从而检测标本 中的相应抗原或抗体的新技术。
一、免疫荧光显微技术 （一）基本原理：使荧光抗体与标本 切片中组织或细胞表面的抗原进行 反应，洗涤除去游离的荧光抗体后， 于荧光显微镜下观察，在黑暗背景 上可见明亮的特异荧光。
（二）荧光抗体的制备
（1）荧光抗体的标记
作为标记的荧光素应符合以下要求： ①应具有能与蛋白质分子形成共价健的化学基 团，与蛋白质结合后不易解离，而未结合的色 素及其降解产物易于清除。 ②荧光效率高,与蛋白质结合后，仍能保持较 高的荧光效率。 ③荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。 ④与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与 免疫性质，与蛋白质的结合物稳定，易于保存。 ⑤标记方法简单、安全无毒。
用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复 合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上 的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。 （酶标抗原抗体复合物的分离）
加入底物后，底物被酶催化变为有色产物，产
物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可
根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。
（显色反应）
（二）ELISA技术类型：
2.技术类型
(1)固相双位点夹心法 (2)固相抗原竞争法 (3)固相抗体竞争法
(二)荧光偏振免疫测定
FPIA是一种均相竞争荧光免疫分析法。 其原理是：标本中的抗原与荧光标记的抗原竞 争结合抗体。反应平衡后，与抗体结合的荧光 标记抗原的量与标本中抗原浓度的量呈反比。 由于抗体的分子量远大于抗原的分子量，游离 的荧光标记抗原与结合抗体的荧光标记抗原所 产生的偏振荧光强度相差甚远。因此在FPIA中 测定的偏振荧光强度与标本中抗原的浓度呈反 比。通过小分子抗原标准品与荧光偏振强度关 系建立标准曲线，可检测小分子抗原的浓度。
2．间接法
3.竞争法
特点：
用于抗原和半抗原的定量测定，也可对抗体 进行测定。 酶标Ag（Ab）与样品或标准品中的非标记Ag （Ab）具有相同的与固相Ab(Ag)结合的能力。 反应体系中，固相Ab（Ag）和酶标Ag（Ab） 是固定限量的，且前者的结合位点少于酶标 记与非标记Ag（Ab）的分子数量和。 反应后，结合与固相载体上复合物中被测定 的酶标Ag（Ab）的量（酶活性）与样品中非 标记Ag（Ab）的浓度成反比。
（一）斑点ELISA
(dot-ELISA)
（二）免疫印迹法
（immunoblottingtest，IBT）
亦被称为Western blot 分三个阶段进行 : SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE） 电转移 酶免疫定位
免疫印迹法原理示意图
第二节 荧光免疫技术 • 免疫荧光技术(immunofluorescence
标记免疫技术
邹全明
第三军医大学医学检验系 临床微生物学和免疫学教研室
标记免疫技术= 免疫技术+标记技术
抗原抗体反应 示踪物标记
特异性
灵敏性
标记免疫技术的主要特点：
高特异性、高灵敏性
标记免 疫技术
免疫组 化技术
示踪物及 标记技术
免疫测 定技术
酶免疫技术 荧光免疫技术 放射免疫技术 化学发光技术 金免疫技术 生物素-亲和素 免疫放大技术 ……
第一节
酶免疫技术
基本原理
利用酶催化底物反应的生物放大作用, 提高特异性抗原-抗体免疫学反应的检测 敏感性的一种标记免疫技术。
基本特点：
①标记后保留酶和抗原(抗体)的活性。 ②酶促反应专一性，保证特异性。 ③底物反应放大作用，提高敏感性。 ④酶标试剂保存稳定。 ⑤操作简便，安全易行。
一、 酶免疫技术的分类
4.捕获法（反向间接法） • 主要用于 血清中某种抗体亚型成分（如 IgM）的测定。
注意事项：
加样
应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加 在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。 保温 1、一般均采用水浴箱，使温度迅速平衡。 2、为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴 封纸或保鲜膜覆盖板孔。
酶免疫组化 酶免疫技术
用于检测组织切片或细胞涂片中的抗原和抗体
均相酶免疫测定
酶免疫测定
异相酶免疫测定
固相酶免疫测定
（ELISA）
液相酶免疫测定
二、酶免疫技术的技术要点 （一）固相载体
• 基本要求 结合容量高，结合稳定；可与抗原 抗体复合物等大分子蛋白结合；生物大 分子固化后仍保持活性；固化方法简便 易行、快捷经济。
• 荧光抗体是将荧光素（如FITC）与特异性抗体以 化学方式共价结合而成。 常用于标记的荧光素：异硫氰酸荧光黄（FITC） 四乙基罗丹明（RB200）
四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）
标记方法：搅拌法(适合大样品)
透析法(适合小样品)
标记抗体的纯化：透析法、层析分离法