肿瘤耐药基因表达的临床意义及其逆转研究

究开辟了新的途径 。开发出新的耐药逆转剂 PZT11 、PND 和抗耐药肿瘤新药 PH Ⅱ27 有望在临床发挥作用 。抗 P2gp/ 抗 CD3 微型双 功能抗体也有望成为逆转肿瘤耐药新有力工具 。
关键词 :肿瘤 ;基因 ,耐药 ;多药耐药 ;糖蛋白
中图分类号 : R73 - 3
文献标识码 :A
文章编号 :1004 - 0242(2001) 03 - 0132 - 05
132
K562/ HHT, ③人结肠癌耐药细胞株 HCTv2000 , ④A2780 细胞 对阿霉素耐药系 , ⑤小鼠耐 Mel (马法兰) 细胞株 L1210/ Mel , ⑥人白血病耐 Mel 细胞株 K562/ Mel , ⑦人肺癌耐 PDD 细胞株 A549PDD。并对人白血病多药耐药细胞株 K562/ A02 和人肺 癌耐 PDD 细胞株 A549PDD 进行系统鉴定 。
The Clinical Significance of Overexpression of Drug - Resistance Genes and Reversal of Multidrug Resistance in Cancer
YANG Chun-zheng1 , LIU Shu-yi2 (1. National Laboratory of Experi mental Hematology , Hematologic Institute , Chinese Academy of
Key words :neoplasms ;gene ,drug resistance ;multidrug resistance ;glycoprotein
肿瘤细胞对多种化疗药物产生交叉耐药性称多药耐药 (Multidrug resistance , MDR) , 是造成肿瘤化疗失败的主要原 因 。有关资料统计 , 肿瘤年死亡率中 , 属内在性多药耐药 (intrinsic MDR) 的肿瘤 , 包括消化系统 、呼吸系统 、泌尿系统 以及大脑和中枢神经系统肿瘤约占肿瘤年死亡 61 %。属获得 性多药耐药 (acquired MDR) 的肿瘤 , 包括皮肤癌 、乳腺癌 、生 殖器癌 、内分泌肿瘤 、白血病和淋巴瘤 ,约占 33 %。这就是说 90 %以上肿瘤患者死因或多或少都与耐药有关 ,因此对 MDR 机制研究和逆转 MDR 成为肿瘤治疗亟待解决的问题 。我们 在国家“九五”攻关课题的支持下对肿瘤耐药基因表达及其 临床意义和逆转耐药进行了研究 。
肿瘤耐药基因表达的临床意义及其逆转研究
杨纯正 1 ,刘淑仪 2
(11 中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所实验血液学国家重点实验室 ,天津 300020 ;21 北京市肿瘤防治研究所 ,北京 100034)
摘 要 : 对人白血病多药耐药细胞株 K562/ A02 和人肺癌耐 PDD 细胞株 A549PDD 系统研究表明 ,耐药表型是多基因的 ,它随
K562/ A02 细胞内药物浓度变化 : K562/ A02 在用药物孵 育 60 分钟后 ,细胞内柔红霉素 (DNR) 浓度仅为 K562 的 1/ 3 。 3μM 的环胞菌素 CsA 和 10μM 的异搏定 VPL 均能显著增加 耐药细胞 K562/ A02 对 DNR 的外排作用 , CsA 较 VPL 作用更 强 。它们分别增加 200 %和 138 %左右 , 但对 K562 细胞无作
Medical Science , Tianjin 300020 , China ;2. Beijing Cancer Institute , Beijing 100034 , China)
九 五 攻 关
Abstract :Based on the investigation of K562/ A02 and A549PDD ,the results show that the phenotype of drug resistance is multi - genes. It varies with the induced drugs , the kinds and differentiation of tumor and the host micro-environment , resulting in overexpression of one resistant gene or multi - genes simultaneously. It has been proved that mdr1/ P-gp is the only one related tumor resistance in clinic . Using cDNA Array technique to compare the RNA from the resistant cell line K562/ A02 with its parent cell line K562 ,several genes were found that have not related with tumor resistance before . New reagents for reversal of MDR have been developed for its potential application in clinic and also Diabody anti CD3 / anti P-gp which is a new approach for the therapy of P-gp + tumors ,especially in metastasis.
耐药基因的表达 ,用点杂交检测 K562/ A02 和 K562 细胞 mdr1 基因 ,发现 K562/ A02 的 mdr1 基因拷贝数不增加 。K562/ A02 用 RT- PCR 扩增后电泳产生 114bp 作为内标的β2 微球 蛋白基因扩增产物和 157bp 的 mdr1 基因扩ห้องสมุดไป่ตู้产物与 mdr1 cDNA 扩增产物相同 , mdr2 cDNA 为阴性 , K562 细胞只产生 114bp 的β2 微球蛋白扩增产物 。这表明它没有基因扩增而是 mdr1 基因转录增加 。
们的总 RNA , 再按照 Atlas cDNA Expression Arrays User Manual 进行操作 ( PT3140 - 1) 。用 CHROMA SPIN-200 、DEPC- H2 O col2 umn 纯化制备的 cDNA 探针 ,再以 cDNA 探针与 Atlas Array 杂 交 , 用 Clontech 公司 Atlas VisionTM 310 software 分析自显影图
K562/ A02 是我们用阿霉素 (ADM) 诱导 K562 细胞 , 建立 的一株多药耐药细胞株 ,它表现出下列特性 :
K562/ A02 的耐药谱 : 分别测定 K562/ A02 和 K562 对不 同药物的 IC50 , 以耐药细胞的 IC50 与敏感细胞 IC50 之比为耐 药倍数 , 发现 K562/ A02 细胞系的耐药谱 : 对 ADM 的耐药倍 数为 160 倍 ,对与 ADM 的结构及药理特性相似 (DNR) 或不同 的 MDR 药物 (如 VCR、HHT、VP16 、AMSA 等) 都有程度不同的 较强的耐药性 , 而对非 MDR 药物 (如 DDP、5-Fu 、MTX 和 Ara-C) 则不耐药或轻度耐药 ,表现为典型的多药耐药表型 。
中国肿瘤 2001 年第 10 卷第 3 期
用 。这表明肿瘤细胞耐药是以细胞内药物浓度降低为主要特 征。
膜糖蛋白 P-170 检测 :用银染法检测发现 K562/ A02 膜在 170 KD 附近有一条带 , 表明 P- 糖蛋白 ( P-gp) 表达阳性 。而 K562 为阴性 。这说明耐药肿瘤细胞内药物浓度的降低是由 于 P2gp 的存在而引起的 。
1 肿瘤细胞耐药基因表达及其临床意义
111 肿瘤多药耐药基因的研究 在国内首先建立了多药耐药细胞株 : ①小鼠多药耐药细
胞株 L1210/ HHT, ②人白血病多药耐药细胞株 K562/ A02 和 收稿日期 :2000 - 01 - 08 基金项目 “: 九五”国家科技攻关项目(96 - 906 - 01 - 24)
诱导的药物不同 ,肿瘤种类 ,分化程度以及宿主微环境的不同而表现为一种或几种耐药基因同时表达 。临床研究肿瘤共 524 例包
括白血病 260 例 ,实体瘤 264 例 ,但目前能在临床证实跟一些肿瘤耐药相关的基因只有 mdr1/ P2gp 。用比较敏感细胞和对应的耐药 细胞 cDNA 阵列表达水平的差别新技术发现了除已知 mdr1 等耐药基因以外新的与耐药相关基因 。这也为基因组学在耐药基因研
上述 mdr1 基因转染实验证明 , mdr1 扩增和由它编码的 P2gp 表达增加是肿瘤细胞产生多药耐药的原因 。
此外用狭缝杂交法检测 Top Ⅱ基因表达 , 发现 Top Ⅱ基 因表达明显低于 K562 细胞谷胱甘肽 -S- 转移酶活性检测结 果 K562/ A02 和 K562 细胞 GST含量分析为 01372 和每分钟 01175nM/ 107 个细胞 , 两者差异显著 。在敏感及耐药的人肿 瘤细胞中的端粒酶活性测定表明耐药细胞 K562/ A02 的端粒 酶活性是增加的 , 并且除抗凋亡基因 Bcl-2 表达增加外 PKC 活性也明显增加 。
新的耐药基因研究 ———基因芯片法 :DNA 芯片技术是 20 世纪 90 年代初期发展起来的一种 DNA 分析新技术 。cDNA Array 是 DNA 芯片中的一种 , 即 cDNA 阵列 , 比较敏感细胞和 对应的耐药细胞 cDNA 阵列表达水平的差别正是发现除已知
mdr1 等耐药基因以外新的与耐药相关的基因的有效方法 。
Human 112 ⅡAtlas array 由 1176 个 cDNA 组成 , 包括癌 基因 、肿瘤抑制基因 、凋亡相关基因 、DNA 损伤 、转录因子 、受
体 、细胞间连接 、细胞骨架等多个方面 ,但不包括多药耐药相
关基因 mdr1 、MRP 基因 、BCRP 基因等 。
我们取对数生长期的细胞 K562 、K562/ A02 分别提取它
转染的 K562/ MDR1 细胞对阿霉素 、柔红霉素 、米托蒽 醌 、足叶乙甙 、高三尖酯碱和长春新碱交叉耐药 ,其耐药倍数 为 718 、811 、710 、2124 、4186 和 2127 倍 , 各药物组中 , K562/ MDR1 与 K562 的 IC50 比较均有显著性差异 ( P < 0105) , 表明 K562/ MDR1 对多药耐药谱的药物具有耐药性 ,而对非多药耐 药谱的药物阿糖胞苷无耐药性 。
mdr1 基因转染 : 为了进一步确证 mdr1/ P2gp 在肿瘤多药 耐药中的作用 , 我们采用磷酸钙沉淀法将含有人全长 mdr1 cDNA 的 逆 转 录 病 毒 载 体 p HaMDR1/ A 转 移 到 包 装 细 胞 PA317 ,获得了产逆转录病毒的包装细胞 PA317- HaMDR1/ A1 , PA317- HaMDR1/ A1 产生的病毒颗粒感染 NIH3 T3 和 K562 细 胞采用上清感染法和共培养法 , 其转染 NIH3 T3 和 K562 细胞 的 转 染 率 分 别 为 3014 % 和 2813 % , 产 病 毒 包 装 细 胞 PA317- HaMDR1/ A1 和被转染 NIH3 T3 和 K562 细胞的基因组 DNA 中均已整合有外源性的 MDR1 cDNA。
经 PA317- HaMDR1/ A1 共培养的 K562 细胞 ,用 315ng/ ml 秋水仙碱筛选后 , 挑取耐药细胞集落进行扩增 , 命名为 K562/ MDR1 ,其转染率为 2813 %。
用免疫组织化学法检测 P2gp 表达 , 结果表明被转染 NIH3 T3 和 K562/ MDR1P2gp 染色较未转染的亲代细胞增强 。