胚胎干细胞鉴定的生物学特性及其应用前景

Ｔｉａｎｊｉｎ Ｍｅｄ Ｊ， Ｆｅｂ ２００７， Ｖｏｌ ３５ Ｎｏ ２
ｃｅｐｈａｌｙ： ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ｃｒａｎｉｕｍ ｕｓｉｎｇ ｔｈｒｅｅ－ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｔｅｄ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄ ａ ｌｉｆｅ－ ｓｉｚｅ ｍｏｄｅｌ ［Ｊ］． Ｊ Ｃｒａｎ－ ｉｏｆａｃ Ｓｕｒｇ， ２００５，１６（４）：６８８－ ６９３．
２ ＥＳ 细胞的应用前景 具有无限增殖、自我更新和多向分化潜能的 ＥＳ 细胞在
基 础 研 究 和 临 床 应 用 等 方 面 具 有 广 阔 前 景 ［１４］： （ １） 建 立 体 外 分化模型及各种基因改变的 ＥＳ 细胞系， 以求发现某些基因 或细胞因子在胚胎发育早期对不同类型细胞或组织分化的 作用， 进一步了解胚胎的发育规律。通过对各时期基因表达 的研究， 认识畸形胎儿发生机制， 为 ＥＳ 细胞体外定向诱导分 化奠 定基础［１５］。（ ２） 作为基因治疗的理想载体［１６］。（ ３） 定向培养 为分化细胞， 以制造组织和器官， 用于某些疾病的细胞治疗 及机体损伤修 复 和 器 官 移 植［１７］。 （ ４） 用 于 研 究 某 种 新 药 模 型 或 化 学 物 质 的 毒 性 及 效 能 的 评 估 ， 这 对 药 理 学 、农 业 化 肥 工 业 等 领 域 的 发 展 有 重 要 意 义 ［１８］。
作者单位： ３０００７０ 天津医科大学组胚教研室 ＊ 审校者
天津医药 ２００７ 年 ２ 月第 ３５ 卷第 ２ 期
产物并测序， 显示了其与人 Ｏｃｔ－ ４ 序列的一致性［１１］。人和小鼠 的 ＥＳ 细 胞 都 表 达 转 录 因 子 Ｏｃｔ－ ４， 当 ＥＳ 细 胞 分 化 时 ， 其 表 达能力大大降低。Ｏｃｔ－ ４ 可能是哺乳动物不同发育阶段多潜 能细胞所特有的少数特异的调控分子之一。 １．６ 体 内 外 分 化 能 力 Ｔｈｏｍｓｏｎ 等［４］将 分 离 的 ５ 个 ＥＳ 细 胞 系分别注射到免疫缺陷小鼠体内， 结果在小鼠身上长出了畸 胎瘤。这种畸胎瘤包括消化道上皮细胞（内胚层）， 骨和软骨组 织 、平 滑 肌 和 横 纹 肌（中 胚 层）， 神 经 表 皮 、神 经 节 和 复 层 鳞 状 上皮（外胚层）。这证明了 ＥＳ 细胞系具有诱导分化出内、中、外 三个胚层的潜能。这些 ＥＳ 细胞在体外培养的条件下， 会分化 为滋养层和各种细胞类型， 呈现自分化现象， 保持其多方向 分化潜能。Ｈ９ 细胞系在体外自分化 ２ 周后， 培养液内检测到 α－ 甲胎蛋白（ α－ ＡＦＰ） 和绒毛膜促性腺激素（ ＨＣＧ） ， 表明有内 胚层和滋养层分化。Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ 等［１２］将 ＥＳ 细胞接种于缺乏饲养 层细胞的琼脂平板上， 细胞黏附成团， 形成拟胚体， 最外层分 化为由较大细胞组成的内胚层样结构， 中间为未分化的干细 胞继续培养， 拟胚体增大， 内部出现囊腔， 形成囊状胚体。在 囊腔和早期分化出的内胚层之间的细胞发育成类外胚层， 为 一层上皮样细胞， 这样的结构可持续存在 ３ 周左右［１３］。若把刚 形成的拟胚体移至无琼脂层的培养皿中贴壁生长， 则可见拟 胚体中间的细胞团保持着干细胞生长特点， 而其周边细胞逐 渐自发分化为多种不同类型的细胞， 包括上皮细胞和成纤维 细胞等， 细胞类型随培养条件和细胞密度而有所不同［１３］。
１ 生物学特性 ＥＳ 细 胞 是 来 自 着 床 前 胚 胎 或 胎 儿 原 始 生 殖 细 胞 的 、可
在体外分化状态下长期增殖传代 培养的、具有稳定的二倍体 核型和多能干细胞表面特异标记的、可分化为三个胚层来 源 的各种组织及细胞类型的永久细 胞 系 。ＥＳ 细 胞 鉴 定 的 理 论 基础是其生物学特性。 １．１ 形态学特征 ＥＳ 细胞在胰酶和无 Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋培养液中形 成相对扁平紧密的克隆群， 并易解离为单一细胞； 而胚胎生 殖细胞（ＥＧ 细胞）为圆形克隆群，且很难用常规方法 解 离 。ＥＳ 细 胞 生 长 缓 慢 ， 对 数 生 长 期 为 ３６ ｈ， 而 ＥＧ 细 胞 对 数 生 长 期 为 １２ ｈ。人 ＥＳ 细胞与哺乳动物 ＥＳ 细胞具有相似的形态特征： 细 胞 体 积 小 ， 核 大，胞 浆 少 ， 有 一 个 或 多 个 核 仁 ， 核 质 比 高 ［２］。 ＥＳ 细 胞 在 体 外 培 养 时 呈 集 落 状 生 长 ， 就 集 落 形 态 而 言 ， 人 ＥＧ 细胞集落与小鼠 ＥＳ 细胞集落更接近呈紧密牢固结合、多 层密集立体生长的无明显细胞界限的集落 ； 而人 ＥＳ 细胞集 落呈相对松散、扁平状集落， 集落内细胞界限隐约可见［３］。 １．２ 核型分析 ＥＳ 细胞具有正常稳定的二倍体核型， 可作 为生物发育 机 制 和 移 植 分 化 细 胞 的 研 究 模 型 。Ｔｈｏｍｓｏｎ 等［４］ 分 离 的 ５ 个 ＥＳ 细 胞 系 中 Ｈ１、Ｈ１３、Ｈ１４ 具 有 正 常 的 ＸＹ 核 型 ， Ｈ７、Ｈ９ 具 有 正 常 的 ＸＸ 核 型 ， 其 中 Ｈ１、Ｈ７、Ｈ１３、Ｈ１４ 细 胞 系 经 反 复冷冻、复苏培养 ５￣６ 个月仍维持正常的核型。Ｇｅａｒｈａｒｔ 等［５］ 建 立 的 ＥＧ 细 胞 系 在 ８￣１０ 代 （ ６０￣７０ ｄ） 进 行 了 核 型 分 析 ， 在 ５ 个 ＥＧ 细胞系中， ３ 个为 ＸＸ 核型， ２ 个为 ＸＹ 核型， 核型正 常稳定。Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ［６］建立的 ２ 个 ＸＸ 核 型 ｈＥＳ 细 胞 系 ＨＥＳ－ １ 和 ＨＥＳ－ ２ 分别在 ５￣７、１４￣１８、２２￣２６、４４￣４６ 代和 ６￣８、４０￣４２ 代进行了核型检测， 结果表明， 两个细胞系在体外培养数十 代后仍保持了正常核型。Ａｍｉｔ 等［７］从体外培养 ６ 个月的 Ｈ９ 细
１５９
３．２ 具有生理性功能的定向诱导分化细胞的建立 已证实来 自鼠 ＥＳ 细胞的多种分化细胞类型（ 心肌细胞、多巴胺能神经 元 等） ［２１］， 但这些细胞尚未能证实在体内外具有生理功能， 如理想的 胰岛分化细胞应该表现为对葡萄糖敏感的胰岛素正常分泌等。 ３．３ 疾 病 模 型 有 效 性 的 证 实 临 床 移 植 治 疗 效 果 的 实 现 要 求植入细胞以功能形式整和入受体组织， 如梗死心肌细胞或 瘢痕组织需要 ＥＳ 细胞定向分化为心肌细胞并整和入心脏 组 织［２２］， 实现有效协调的机械收缩，并形成组织血管化。 ３．４ 植入后 分 化 细 胞 的 致 瘤 性 体 内 外 分 化 研 究 表 明 未 分 化 ＥＳ 细胞移植后产生非转移性良性畸胎瘤［８］， 在免疫缺陷动 物移植未分化 ＥＳ 细胞后表现为依赖未分化干细胞的肿瘤性 生长， 因此移植后细胞应该为有丝分裂后终末分化细胞。可 设计转基因方法以选择培养中残存的未分化干细胞， 如利用 Ｏｃｔ－ ４ 表达细胞进行负向选择以去除未分化干细胞。
１５８
ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｂｙ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｃｏａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ－ ２ ａｎｄ ｂａｓｉｃ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ［Ｊ］． Ｗｏｕｎｄ Ｒｅｐａｉｒ Ｒｅｇｅｎ，２００４，１２（２）：２５２－ ２５９． ［１８］ Ｙａｍａｄａ Ａ，Ｉｍａｉ Ｋ，Ｎｏｍａｃｈｉ Ｔ，ｅｔ ａｌ．Ｃｒａｎｉａｌ ｄｉｓｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｐｌａｇｉｏ－
３ 问题与展望 ＥＳ 细胞的研究已取得了令人瞩 目 的 成 就 ， 但 要 真 正 用
于临床治疗还必须解决以下 ４ 个问题。 ３．１ 特 定 分 化 细 胞 类 型 ＥＳ 细 胞 系 的 建 立 和 纯 化 有 关 ＥＳ 细胞株分离成可在体外存活的单个细胞是非常棘手的问题。 当前尚未能建立单细胞分化的细胞系培养条件 ， 使 ＥＳ 细胞 保持多 种分化细胞的基因表达。从保持 广 泛 分 化 潜 能 的 ＥＳ 细胞中选择相对均一性细胞的方法有： （ １） 使用特异性启动 子表达可选标记基因， 如抗体抗性基因［１９］。（ ２） 转导包含绿色 荧光免疫蛋白基 因 的 组 织 特 异 性 启 动 子 的 构 建 基 因［２０］， 从 而 用荧光细胞分选技术选择定向细胞。
胞系中克隆出 ２ 个 ＥＳ 细胞系 Ｈ９．１ 和 Ｈ９．２， 这 ２ 个细胞系在体 外继续培养 ８ 个月后仍保持了正常的 ＸＸ 核型。 １．３ 端 粒 酶 活 性 端 粒 是 位 于 染 色 体 末 端 的 重 复 ＤＮＡ 序 列 —ＴＴＡＧＧＧ， 其长度作为细胞分裂及细胞衰老的生物时钟。 它在每一次分裂中都会变短， 但可被端粒酶修复。端粒酶是 一种核糖核蛋白， 与维持真核细胞染色体末端的端粒长度和 控 制 细 胞 寿 命 有 关 。端 粒 长 度 对 其 复 制 寿 命 具 有 很 重 要 的 作 用， 端粒酶的表达与人细胞系的永生化程度高度相关； 向人 的某些二倍体细胞中重新导入端粒酶活性将会延长其复制 寿命； 人的二倍体细胞不表达端粒酶活性， 随着年龄的增长， 其染色体端粒变短， 在组织培养过程中， 经过有限的增殖期 后， 即进入复制衰老状态。大多数体细胞的端粒酶活性都不高， 并在 ５０￣８０ 代有限的增殖后进入老化阶段［８］。ＥＳ 细胞则表达 高度端粒酶活性， ＥＳ 细胞 即 使 长 期 培 养 １ 年 ， 传 代 ３００ 代 仍 表现有高端粒酶活性， 表明其复制寿命要长于体细胞的复制 寿命［６］。由于 ＥＳ 细胞在体外培养中长期保持早期胚胎细胞的 性质， 因而对研究细胞衰老和干细胞扩增机制有重要意义。 １．４ 细 胞 表 面 抗 原 的 表 达 ＥＳ 细 胞 具 有 表 达 早 期 胚 胎 细 胞、ＥＧ 细胞表面抗原的特性。人 ＥＳ 细胞表面 抗原的表达与 小鼠 ＥＳ 细胞存在明显的种属差异， 如小鼠 ＥＳ 细胞表达早期 胚 胎 细 胞 的 特 异 性 表 面 抗 原 ＳＳＥＡ－ １， 但 并 不 表 达 ＳＳＥＡ－ ３ 和 ＳＳＥＡ－ ４［８］，而 人 ＥＳ 细 胞 则 表 达 人 早 期 胚 胎 阶 段 特 异 性 抗 原 ＳＳＥＡ － ３，ＳＳＥＡ － ４，ＴＲＡ － １ － ６０，ＴＲＡ － １ － ８１； ＥＧ 细 胞 表 达 ＳＳＥＡ－ １，ＳＳＥＡ－ ３，ＳＳＥＡ－ ４，ＴＲＡ－ １－ ６０，ＴＲＡ－ １－ ８１。 人 ＥＳ Байду номын сангаас 胞 表 现 ＳＳＥＡ－ １ 阴 性 ， 而 小 鼠 的 ＥＳ 细 胞 和 ＥＧ 细 胞 则 表 现 ＳＳＥＡ－ １ 阳性， 因此， 常用单克隆抗体 ＳＳＥＡ－ １ 检测 ＥＳ 和 ＥＧ 细胞表面抗原作为发育全能性的一种标志。目前认为， ＳＳＥＡ－ １ 的表达与否， 可能反映了相对扁平疏松 结合的 ＥＳ 细 胞 集 落 （ ＳＳＥＡ－ １ 阴 性 ） 与 多 层 叠 垛 集 落 的 ＥＳ 细 胞 （ ＳＳＥＡ－ １ 阳性） 之间的差异［８］。碱性磷酸酶（ＡＫＰ）活性 常 被 用 来 作 为 鉴 定 ＥＳ 细胞及其分化与否的重要标志。在早期 ＥＳ 中 ＡＫＰ 活 性较高， 而在已分化的细胞中活性明显降低［２］。 １．５ 转 录 因 子 Ｏｃｔ－ ４ 的 表 达 Ｏｃｔ－ ４ 是 一 种 发 育 全 能 性 的 标志基因， 为 ＰＯＣ 区域的一个转录因子。在小鼠， Ｏｃｔ－ ４ 只限 定 在 多 潜 能 细 胞 中 表 达［９］。 研 究 结 果 表 明 ， 受 精 卵 所 表 达 的 Ｏｃｔ－ ４ 对建立 ＥＳ 细胞系是必需的 ［１０］。用 ＰＴ－ ＰＣＲ 方 法 分 析 ｈＥＳ 细胞的 ｍＲＮＡ， 发现 ｈＥＳ 细胞也表达 Ｏｃｔ－ ４。克隆 ＰＣＲ