植物遗传转化方法和转基因植株的鉴定
转基因植物的检测鉴定方法、遗传转化技术及新技术
PCR检测
• PCR是在体外快速特异地扩增目的基因DNA片段 的有效方法。能在几小时内使pg水平的起始物达 到ng水平,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭 染色后很容易观察,不通过杂交分析就可以鉴定出 基因组中的一些顺序。
• 但由于PCR扩增十分灵敏,有时会出现假阳性扩 增,因而对外源基因是否整合需要进行扩增产物 的Southern杂交。
*已获得专利许可
42
Site-specific recombinasemediated transgene excision
loxP
Cre
Transgene
loxP
loxP
Cre
Transgene
llooxP
loxP
43
外源基因去除(Gene-deletor)
• “外源基因去除”技术的要点之一是在目标植 物中加入了受DNA调空片段启动子控制的特殊基 因,该基因在启动子的作用下,可根据科学家的 意愿,在需要的时间和部位将外源基因和自身从 转基因植物中切掉,从而使转基因作物的花粉、 种子、果实不再含有外来基因,或将外来基因从 人们所需食用的部分(如植物的茎、叶、块茎) 彻底清除掉,达到用转基因作物生产出非转基因 食品的目的,从根本上解决了长期困扰人们的转 基因植物基因扩散问题和转基因食品的安全性问 题。
ATP
dsRNA
siRNA
蛋白复合物
RISC
靶 正义链
40
mRNA
3、无选择标记转化
• 可消除选择标记基因对转基因作物安全性 方面的影响
• 可消除选择标记基因对重复多基因转化叠 加所带来的困难
41
marker-free转基因植株
• 共转化法*(基因枪与农杆菌转化) • 转座元法 • 重组酶法* • MAT(Multi-auto transformation)法* • 替代法*
转基因植物的筛选与鉴定
转基因植物的筛选与鉴定随着植物转基因技术的不断进步,它对于分子遗传学研究和植物改良都具有特别重要的意义。
转基因植株的筛选在转基因技术中起着关键性的作用。
将含有35S启动子的基因载体PMDC150经农杆菌介导,利用农杆菌侵染拟南芥花序的方法转入拟南芥后得到T1代种子。
文章通过组织培养来筛选含有Kan抗性的转基因植株。
标签:拟南芥;转基因植物;筛选1 文献综述1.1 转基因植物的研究进展植物的遗传转化是指利用重组DNA,细胞组织培养等方法,将外源基因导入到植物的组织或细胞中,获得转基因植物的技术[1]。
从转基因植株成功之后,转基因技术飞速发展,如今,植物在抗病、抗虫和抗药等方面都有了转基因植株。
这种技术对改进农作物品质、提高产量等方面都有非常大的帮助。
1.2 基因转化技术随着人们对基因转化技术不断地深入研究和探索,现已发现多种基因转化的方法,例如农杆菌介导的基因转化、花粉管通道法等。
相比较其他植物基因的转化方法,农杆菌介导法有着减少成本、容易操作等优点,但对宿主细胞有着严格的要求。
每种方法都有其优缺点,所以根据植物的不同种类,我们要选择合理的转化方法,达到理想的转化效果。
1.3 本论文的目的和意义植物的转基因技术日新月异迅速发展,已经成为许多国家重点发展的新目标新领域,它所产生的巨大的社会和经济效益促使各个国家对其进行更加深入的研究,由其产生的巨大的生产潜能一定会推动社会的进步,改善人类现有的生产、生活质量以及健康水平。
本文以拟南芥为主要研究对象,通过转化后的农杆菌侵染拟南芥花序的方法及组织培养的方法进行了轉基因植物的筛选。
借由本次实验研究,可深入了解基因工程等相关领域的理论,可熟练掌握相关技术例如无菌操作技术、植物转基因技术、植物组织培养技术等等。
2 转基因植物的筛选与鉴定2.1 实验材料2.1.1 植物材料拟南芥2.1.2 载体与菌株重组表达载体PMDC150-35S(由实验室提供)、农杆菌菌株GV31012.1.3 主要试剂75%酒精、84消毒液、侵染缓冲液、限制性内切酶、卡那霉素、壮观霉素(重组表达载体含有的抗性)、利福平2.1.4 培养基LB培养基:5g/L酵母提取物,10g/L蛋白胨,10g/L NaCl,15g/L琼脂(只固体培养基添加)1/2MS培养基2.2 实验方法2.2.1 拟南芥种植:将种子放在浸过水的滤纸上,放在4℃的冰箱中,不见光培养24小时,然后取出种子种在营养土里,在光照强度8000Lux,温度25℃的培养箱中经过光照16小时/黑暗8小时培养[2]。
转基因植物
载体介导法
➢ T-DNA区可高效整合到植物受体细胞的 染色体上并得到表达。利用这一特点, 将目的基因转入Ti质粒的T-DNA区构建 根瘤农杆菌的转化载体。
一、转基因植物
通过植物基因工程获得转基因植物在农 业生产发展及植物分子生物学研究中有 十分重要的意义,已获得的有重大经济 价值的转基因植物已经很多。
一、转基因植物
基因工程: 就是重组DNA技术,指在体 外将不同来源的DNA进行剪切和重组, 形成杂合DNA或成嵌合DNA分子,然后将 其导入特定的宿主细胞从而得到大量扩 增和表达,使宿主细胞获得新的遗传特 性,产生新的基因产物。
载体介导法
Vir区(virulence region): ➢ 该区段上的基因能激活T-DNA转移,
使农杆菌表现出毒性,故称之为 毒性区。T-DNA区与Vir区在质粒 DNA上彼此相邻,合起来约占Ti质 粒DNA的三分之一。
Ti质粒的基因位点及其功能区域
➢ T-DNA区(transferred-DNA regions):
产生白化苗,且由于 PEG法对原生质体活力 有害,转化率低。
应用这种方法已成功的获得大麦、柑桔、胡
椒等植物的转基因植株。
一、转基因植物
载体介导法 具体方法有农杆菌介导法、病毒介导法。 农杆菌介导可采用“共培养法”,(见
书本图10-1 B),有根癌农杆菌和发根农 杆菌两种载体系统。
载体介导法
以野生型根癌农杆菌载体系统为例: ➢ 野生型根癌农杆菌Ti质粒大小约200-
植物转化及转基因的检测
复杂
复杂
简单
昂贵
昂贵
便宜
低
高
低
可行
广泛
广泛
Agrobacterium tumefaciens
Ti plasmid with the new gene
+
cell’s DNA
Agrobacterium
Plant cell
Transformation
The new gene
Tr2a0n20s/6g/20enic plant
Calli are placed in vacuum chamber, Helium pressure shot DNA into cells
Gene gun
vacuum chamber
Calli remain on the high osmotic media for 2020h2o0u/6r/s20 following shooting.
• 早衰
生长期缩短、早孕早穗等
• 对环境敏感
对水、肥、温度、光照敏感
Transformation is performed by gene gun meia prepare calli for transfomation
2020/6/20
福建省农业遗传工程重点实验室
DNA with desired gene and antibiotic resistance is coated onto the surface of gold particles.
借助标记基因和报告基因的快速筛选和纯合
抗生素抗性基因
新霉素磷酸转移酶基因(nptII)——Kanr,G418r
双氢叶酸脱氢酶基因 潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)——hygr 氯霉素乙酰转移酶基因(cat)——Cre
转基因植物的筛选与鉴定
2017年24期Technology Innovation and Application方法创新转基因植物的筛选与鉴定王迪(聊城大学东昌学院,山东聊城252000)摘要:随着植物转基因技术的不断进步,它对于分子遗传学研究和植物改良都具有特别重要的意义。
转基因植株的筛选在转基因技术中起着关键性的作用。
将含有35S启动子的基因载体PMDC150经农杆菌介导,利用农杆菌侵染拟南芥花序的方法转入拟南芥后得到T i代种 子。
文章通过组织培养来筛选含有Kan抗性的转基因植株。
关键词:拟南芥;转基因植物;筛选中图分类号:Q943 文献标志码:A文章编号:2095-2945(2017)24-0087-021文献综述1.1转基因植物的研究进展植物的遗传转化是指利用重组DNA,细胞组织培养等方 法,将外源基因导入到植物的组织或细胞中,获得转基因植物 的技术[1]。
从转基因植株成功之后,转基因技术飞速发展,如 今,植物在抗病、抗虫和抗药等方面都有了转基因植株。
这种 技术对改进农作物品质、提高产量等方面都有非常大的帮助。
1.2基因转化技术随着人们对基因转化技术不断地深入研究和探索,现已 发现多种基因转化的方法,例如农杆菌介导的基因转化、花粉 管通道法等。
相比较其他植物基因的转化方法,农杆菌介导法 有着减少成本、容易操作等优点,但对宿主细胞有着严格的要 求。
每种方法都有其优缺点,所以根据植物的不同种类,我们 要选择合理的转化方法,达到理想的转化效果。
1.3本论文的目的和意义植物的转基因技术日新月异迅速发展,已经成为许多国 家重点发展的新目标新领域,它所产生的巨大的社会和经济 效益促使各个国家对其进行更加深入的研究,由其产生的巨 大的生产潜能一定会推动社会的进步,改善人类现有的生产、生活质量以及健康水平。
本文以拟南芥为主要研究对象,通过转化后的农杆菌侵 染拟南芥花序的方法及组织培养的方法进行了转基因植物的 筛选。
借由本次实验研究,可深入了解基因工程等相关领域的 理论,可熟练掌握相关技术例如无菌操作技术、植物转基因技 术、植物组织培养技术等等。
植物转化及转基因的检测
※从重组子中,提取DNA,进一步分析鉴定转化子。
表达载体构建
※将目的基因克隆到表达载体上,使之在新的遗传背景下实现功能表达。
植物基因工程的主要步骤
植物遗传转化
※ 用生物或物理方法将目的基因转入植物受体中
转基因植物的鉴定
※ 分子水平、个体水平、群体水平检测目的基因的遗传、表达及其稳定性
转基因作物的育种利用
从处于分蘖中期的供试转基因抗虫水稻植株上,随 机取三个粗壮分蘖剪取3-4cm长的叶片一片。将叶片 移置长玻璃管6.5cm×1.5cm)内经0.1g/l苯骈咪唑保 鲜液浸渍过的滤纸片上,每管分别接入5头刚孵化的蚁 螟,管口塞紧脱脂棉。自开始接虫后,第二、四、六、 八天分别考察或测定幼虫死亡率。期间向管内增添新 鲜的叶片。
对照
直链淀粉含量 %
9.7 10.9 9.6 9.9 9.2 9.3 9.6 10.4 8.9 8.9 10.8 9.2 12.8
比对照降幅 %
24.51 14.96 25.26 22.66 28.12 27.70 24.65 18.50 30.31 30.31 15.83 28.20
转基因株系的遗传分析及纯合
植物转化及转基因的检测
2021/4/8
福建省农业遗传工程重点实验室
基因工程的概念
利用DNA体外重组或PCR扩增技术从某种 生物基因组中分离感兴趣的基因,或是用人工 合成的方法获取基因,然后经过一系列切割, 加工修饰,连接反应形成重组DNA分子,再将 其转入适当的受体细胞,以期获得基因表达的 过程.
Calli are placed in vacuum chamber, Helium pressure shot DNA into cells
Gene gun
转基因植物的分子检测与鉴定方法及进展
转基因植物的分子检测与鉴定方法及进展随着分子生物学和植物基因工程的不断发展,越来越多的育种工作者开始利用转基因技术获得常规育种技术难以得到的新种质和新品种。
植物转基因技术最大的好处在于可以打破自然界物种间原有的生殖隔离,促进基因在不同物种间的交流,极大地丰富变异类型,增大遗传多样性,为植物新品种的培育提供丰富的育种资源。
通过对基因功能的研究,筛选m目的基因,还可实现植物性状的定向改良。
因此该技术自1983年首次获得转基因植物以来,便深受育种工作者青睐,得到了蓬勃地发展。
至今已有30多科约200多种植物转基因成功;国际上相继有30多个国家批准3 000多例转基因植物进入田间试验,并且在美国、加拿大、中国等20多个国家成功进行了商品化生产…。
到2006年止,全球转基因作物的商业种植面积达1.02亿hm2,比2005年增长13%,是1996年的62倍。
转基因作物品种在农业生产中日益显现出巨大潜力。
植物转基因操作中,除利用抗生素抗性和除草剂抗性等选择基因排除非转化细胞而留存转化细胞,以及利用Gus和CFP等报告基因显示转基因成功外,更重要的是从分子水平鉴别出阳性转化体,明确目的基因在转基因植株中的拷贝数和转录与表达情况。
本文就常用的转基因植株检测与鉴定方法作一概述,并对近期发展起来的新方法做简要介绍。
1 外源基因整合与否及其整合拷贝数的鉴定1.1 PCR(p01 ymera se chain reaction)检测1.1.1 常规PCRPCR技术对目的片段的快速扩增实际上是一种在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下利用DNA聚合酶的酶促反应,通过3个温度依赖性步骤(即变性、退火和延伸)完成的反复循环。
经PCR扩增所得目的片段的特异性取决于引物与模板DNA间结合的特异性。
根据外源基因序列设计出一对引物,通过PCR反应便可特异性地扩增出转化植株基因组内外源基因的片段,而非转化植株不被扩增,从而筛选出可能被转化的植株。
大豆遗传转化实验报告
一、实验目的本研究旨在通过农杆菌介导法对大豆进行遗传转化,将目的基因导入大豆基因组中,并成功获得转基因大豆植株。
通过本实验,旨在探索大豆遗传转化技术,为大豆育种提供新的技术手段,提高大豆的产量和品质。
二、实验材料1. 大豆品种:Williams822. 农杆菌菌株:E. coli DH5α3. 转化载体:含有目的基因的质粒pBI1214. 实验试剂:抗生素、植物激素、DNA提取试剂盒等5. 实验设备:离心机、PCR仪、凝胶成像系统、组织培养室等三、实验方法1. 质粒提取与鉴定(1)采用DNA提取试剂盒提取质粒DNA。
(2)通过PCR扩增质粒中的目的基因,并进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。
2. 农杆菌培养与活化(1)将农杆菌菌株E. coli DH5α接种于含有抗生素的LB培养基中,37℃培养过夜。
(2)将活化后的农杆菌接种于含有抗生素的YEB培养基中,28℃培养过夜。
3. 转化载体的构建(1)将目的基因插入到质粒pBI121的T-DNA区域。
(2)通过PCR和琼脂糖凝胶电泳鉴定转化载体。
4. 农杆菌介导的大豆遗传转化(1)将转化载体与活化后的农杆菌共培养,使农杆菌吸收转化载体。
(2)将农杆菌接种于含有抗生素的YEB培养基中,28℃培养过夜。
(3)将农杆菌悬浮液滴加到大豆子叶节上,进行农杆菌介导的大豆遗传转化。
5. 转基因大豆植株的再生与筛选(1)将转化后的大豆子叶节接种于含有抗生素和植物激素的培养基上,进行组织培养。
(2)通过PCR和琼脂糖凝胶电泳筛选阳性植株。
6. 转基因大豆植株的鉴定(1)采用RT-PCR技术检测目的基因在转基因大豆植株中的表达。
(2)通过Western blot技术检测目的蛋白在转基因大豆植株中的表达。
四、实验结果1. 质粒提取与鉴定:成功提取质粒DNA,并通过PCR和琼脂糖凝胶电泳鉴定出目的基因。
2. 农杆菌培养与活化:成功活化农杆菌菌株E. coli DH5α。
3. 转化载体的构建:成功构建含有目的基因的转化载体。
植物遗传转化步骤
植物遗传转化步骤植物遗传转化是一种通过改变植物的遗传物质来实现特定目的的技术。
这一技术已经被广泛应用于植物育种、基因工程和农业生产中。
下面我们将介绍植物遗传转化的具体步骤。
一、选择目标植物和目标基因在进行植物遗传转化之前,首先需要确定目标植物和目标基因。
目标植物通常是经济作物或者重要的研究对象,而目标基因则是具有特定功能的基因,如抗病性、耐旱性等。
二、构建载体构建载体是进行植物遗传转化的重要步骤之一。
载体是将目标基因导入植物细胞的媒介,通常由DNA序列构成。
在构建载体时,需要将目标基因插入到适当的表达载体中,并加入其他必要的DNA片段,如启动子、终止子和选择标记基因等。
三、转化载体到植物细胞将构建好的载体导入植物细胞是植物遗传转化的核心步骤。
目前常用的转化方法有农杆菌介导的转化和基因枪法。
农杆菌介导的转化是将构建好的载体转化到农杆菌中,然后利用农杆菌侵染植物组织,将载体导入植物细胞。
基因枪法则是利用高压气体将载体直接“射击”到植物细胞中。
四、筛选转化植株在转化植物细胞后,需要进行筛选以获得含有目标基因的转化植株。
为了区分转化植株和未转化的植株,常常会在载体中加入选择标记基因。
选择标记基因通常会使转化植株对某种抗生素或除草剂具有耐受性,在培养基中添加相应抗生素或除草剂后,只有含有目标基因的转化植株能够生长下去。
五、培养和繁殖转化植株筛选出含有目标基因的转化植株后,需要进行培养和繁殖。
通常会将转化植株移至含有适当营养物质的培养基中进行生长,以获得足够数量的转化植株。
六、鉴定转化植株在培养和繁殖转化植株后,需要对其进行鉴定,确认其是否成功转化。
鉴定方法包括PCR扩增、Southern印迹和Western印迹等。
通过这些方法,可以检测目标基因在转化植株中的存在和表达情况。
七、后续分析和应用一旦确认转化植株成功,就可以进行后续的分子生物学和生理学分析,如基因表达分析、蛋白质功能研究等。
此外,转化植株也可以用于基因工程和农业生产中,如改良作物品质、提高产量等。
中国转基因作物流程
中国转基因作物流程
中国转基因作物流程主要包括以下步骤:第一步是科研阶段的基础研究,包括基因克隆、转基因载体构建、转基因植物组织培养和遗传转化等。
第二步是品系筛选阶段,通过对转基因植株进行鉴定和筛选,确定具有良好表现的品系。
第三步是品系试验田阶段,将筛选出来的转基因品系在试验田中进行种植和试验,评价其适应性和稳定性。
第四步是品种审定阶段,经过多年的试验和研究,对转基因品种进行安全性和质量评估,获得审定证书后方可推广种植。
最后一步是推广应用阶段,将已经获得审定证书的转基因品种推广到市场上,供农民种植和使用。
中国转基因作物流程中的每个环节都有严格的规定和监管,旨在确保转基因作物的安全性和质量,保障公众健康。
- 1 -。
植物基因转化与转基因植株鉴定
3. 目标基因 PCR 扩增 采用 PrimeSTARTM HS DNA Polymerase 高保真酶从玉米 cDNA 中扩增 ZmMKK4 全长编码序列(GenBank 序列号:NM_001158890.1)。 ZmMKK4 扩增引物:F-ZmMKK4,R-ZmMKK4。 25μL 反应体系为:5 μL 5× PrimeSTAR Buffer (Mg2+ Plus),2 μL dNTP Mixture (各 2.5 mM),1μL 上游引物(5μM),1μL 下游引物(5μM),1 μL cDNA,0.25 μL PrimeSTARTM HS DNA Polymerase,加 ddH20 至 25μL。PCR 扩增程序为 98C 98C 58C 72C 72C 1~3 min 10 s 15 s 1.5 min 10 min
图 1 外源基因转化流程图
三、实验目的和实验要求 目的: 学习和掌握从基因分离克隆到植株转化及转基因植株的筛选整个实验 体系。 要求: 综合利用前面的单个实验环节所掌握的知识, 获得完整的实验理念, 并在实验过程中学会设计、构建适合的载体并将外源基因转化植株。 四、实验材料和方法 (一)实验仪器 PCR 仪, 凝胶成像系统, 台式高速离心机, 台式高速冷冻离心机, DU 640 紫 外分光光度计,UV-2450 分光光度计,精密 pH 计,微量移液器,控温摇床,电 子天平,制冰机,-80C 超低温冰箱,电热恒温水浴锅,自动电热压力蒸汽灭菌 器,超净工作台,光照培养箱等 (二)试剂及配方 Trizol试剂,RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis Kit,DNase I,2× PCR Master Mix,FastDigest 限制性内切酶,T4 DNA Ligase,PrimeSTARTM HS DNA Polymerase 高保真酶, pEASY-Blunt C, 质粒提取试剂盒 (E.Z.N.A. Gel Extraction Kit) , 凝胶回收试剂盒 (E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit I) , DNA提取试剂盒, Kanamycin (Kan) ,Ampicillin(Amp) ,Carbenicillin(Cb) ,电泳缓冲液,LB培养基、YEB 培养基,烟草培养基如下表1.
植物遗传转化方法和转基因植株的鉴定
植物遗传转化方法和转基因植株的鉴定金万枚 巩振辉 李桂荣 张桂华(西北农业大学 陕西杨陵 712100)提 要 对现有主要植物遗传转化方法和转基因植株的鉴定进行了比较分析,并对它们在植物遗传转化中的前景进行了展望。
关键词 植物;遗传转化方法;转基因植株;转基因植株鉴定 人们可通过有性杂交,物理化学诱变或自然变异来创造新物种和新品种。
但常常存在着杂交不亲和或杂种不育而造成的生殖隔离,也存在诱变的非定向性。
采用遗传转化技术,将所要求的外源目的基因导入受体植株,并通过对转化植株的鉴定选择,从而创造出人类所需要的新品种或新物种。
植物遗传转化方法和转基因植株的鉴定是植物遗传转化的重要环节。
关*国家自然科学基金资助,项目编号39770522。
优质小麦品质的决定性因素;其次要有较强的生活力,保证营养生长健壮。
3.3.2 播种 研究表明,适当晚播和增加密度能在稳定产量的基础上提高小麦品质。
根据我省实际,关中优质专用小麦播量应控制在每亩6~8kg,渭北应控制在9kg。
播期可依据实际情况较当地常规适播期推迟2~3d。
提倡机械以精量半精量播种。
3.4 灌水灌水对小麦品质的影响比较复杂,尤以抽穗至成熟期间影响最大,此期灌水会降低蛋白质含量,对沉淀值等加工品质也不利,但如果氮量充足或灌水与施氮结合则蛋白质含量不下降或下降很慢。
因而施肥上的前氮后移也为后期合理灌水提供了条件。
中国农业大学曾研究出一套节水高产栽培技术,小麦春季可只灌一次,并将灌水时期移至孕穗期;若特别干旱,可在拔节期和开花期分别灌水。
这种灌水制度与前氮后移的施肥方法配合起来,有利于优质专用小麦生产。
3.5 地膜覆盖地膜覆盖栽培能使小麦产量大幅度提高,对品质的影响这方面研究还较少。
陕西省农科院小麦中心的初步研究表明,小麦覆膜后籽粒容重有不同程度提高;蛋白质含量与正常露地播种没有差异;覆膜不影响不同生态类型品种的干、湿面筋值和沉淀值;但不同生态类型品种之间籽粒容重、蛋白质含量、干、湿面筋值和沉淀值存在较大差异。
植物遗传转化
转化植株
茎尖 块茎 创伤植株 根
(未)受精卵细胞
花器官
原生质体 悬浮培养细胞
8 植PL物AN遗T传G转E化NE体T系IC的TR建A立NSFORMATION
8.1 植物基因转化的受体
尽管接受外源基因的受体包括叶圆片(盘)、胚性愈伤、 胚状体、愈伤组织、悬浮细胞、原生质体等不同的形态, 但其基本形态还是细胞。其中,叶圆片与农杆菌共培养 是最简单的转化方法;愈伤组织的转化效率高、生长速 度快,是快速检测外源基因表达的最好受体;原生质体 则是单克隆转化的最佳材料。
根癌农杆菌与烟草细胞原生质体共培养,再生了具有明显肿瘤特征 的幼苗 (Marton等,1979)。Horsch(1985)等首创了根癌农杆菌 与植物叶圆盘共同温育而实现转化的“叶圆盘共培养法”(Leef disk cocultivation),实现了烟草的转化。李宝健等(1990)用此法已将 外源基因转移到花椰菜、甘蓝、苜蓿、花叶芋、胡萝卜、番茄、烟 草等细胞中并得到表达。另外,我国已在龙葵、大豆、甘蓝、菊花、 诸葛菜等植物上通过农杆菌转化获得了转化植株。
经过十多年来得探索,基因转化的技术日臻成熟,已经形成了以农杆 菌载体转化和基因枪转化技术为主体的两大植物基因转化系统。这两种 转化系统机理清楚、证据确凿,成功的例子最多,约占已获转基因植物 的90%以上 。
8 PLANT GENETIC TRANSFORMATION
学习后的感受:
1.植物遗传转化受体? 2.植物遗传转化方法? 3.转基因植株的再生? 4.转基因植株的检测?
8 植PL物AN遗T传G转E化NE体T系IC的TR建A立NSFORMATION
8.1 植物基因转化的受体
所谓基因转化受体是指用于转化的外植体通过组织培养途径或 其他非组织培养途径,能高效、稳定地再生无性系,并能接受外 源DNA整合,转化选择抗生素敏感的再生系统。
第十二讲植物遗传转化
3)基因枪工作原理
基因枪根据动力系统可分为火药引爆、高压放电和压缩气体驱 动三类
金属微颗粒(0.6-1.6 mm直径的钨或金颗粒),包被外源DNA 载体,加速后携带外源DNA进入植物受体细胞
压缩气体驱动的基因枪是目前的主流: 基因枪是利用不同厚度的聚酰亚胺薄膜制成可裂圆片,来调 控氦气压力,当氦气压力达到可裂圆片的临界压力时,可裂 圆片爆裂并释放出一阵强劲的冲击波,使微粒子弹载体携带 微粒子弹向下高速运动,轰击靶细胞或组织。
是指将植物的离体材料包括茎尖(芽)、分生组织、胚胎、 花粉、愈伤组织、悬浮细胞、原生质体等,经过一定的方法 处理后在超低温(-196℃液氮)条件下进行保存的方法。
材料的准备—预处理—加入冷冻保护剂—降温冷冻—种质液 氮保存—快速化冻(34-40 oC)、洗涤、再培养
4)超低温保存的方法有哪些?
植物遗传转化技术的应用:
基础研究
植物性状改良
植物抗虫基因工程 抗病基因工程 植物抗逆基因工程 植物品质改良的基因工程 植物叶绿体基因工程
生物工程
植物生物反应器
二 植物遗传转化的方法
直接基因转移技术 生物介导基因转移技术
基因枪法 电击转化法 PEG转化法 花粉管通道法 显微注射法 激光微束穿孔法
一 植物遗传转化的概念
植物遗传转化(Plant genetic transformation):是指将 外源基因转移到植物体内并稳定整合、表达并遗传, 从而使受体植物体现转移基因的特征的过程。又称为 基因转化(gene transformation)
转基因植物(Transgenic plant):通过遗传转化手 段,获得目的基因(包括外源和内源基因两类) 并能 在后代中稳定遗传的植物
植物遗传转化研究植物基因工程和遗传转化技术
植物遗传转化研究植物基因工程和遗传转化技术植物遗传转化研究:植物基因工程和遗传转化技术植物遗传转化研究是现代生物技术领域的一个重要分支,它通过操纵植物的基因来改变其性状和功能,为农业、生物医学和环境保护等方面提供了广阔的应用前景。
本文将介绍植物基因工程的原理和遗传转化技术的发展现状,以及其在农业和医学领域的应用。
一、植物基因工程原理植物基因工程是指通过人为干预植物基因组,将外源基因导入植物细胞,并使其在植物中表达。
其核心技术是DNA重组技术,具体包括以下几个步骤:1. 外源基因的克隆:将具有特定功能的基因从其他生物体中分离出来,并经过体外扩增,得到足够的DNA片段。
2. 载体构建:将目标基因与适当的表达载体连接,构建成重组DNA。
常用的载体包括质粒和病毒。
3. 转化方法:将重组DNA导入植物细胞。
常用的转化方法有农杆菌介导的转化和基因枪介导的转化等。
4. 选择与筛选:利用选择标记基因或者报告基因等,对经转化的植株进行筛选和鉴定,确保目标基因已经成功导入植物细胞。
5. 后续培养:将转基因植株培养至成熟植株,并进行繁殖和观察,验证目标基因的功能和表达。
二、遗传转化技术的发展现状随着生物技术的不断进步,植物遗传转化技术也得到了广泛应用,取得了许多重要成果。
目前常用的植物遗传转化技术包括农杆菌介导的转化、基因枪介导的转化、电击法等。
农杆菌介导的转化是最常用的植物遗传转化技术之一,利用农杆菌通过水分或创伤进入植物细胞,将外源基因导入植物基因组。
该技术具有高效性和选择性,并且适用范围广泛,在获得转基因植株方面具有重要作用。
基因枪介导的转化是一种直接将外源DNA通过高速银粒枪或金粒枪射入植物组织的方法。
该技术能够克服农杆菌介导的转化对组织的要求较高的限制,使得更多的植物种类能够进行遗传转化。
电击法是一种利用暴露在电场中的植物细胞的特定瞬间可逆孔效应,使得外源DNA通过电穿孔方式导入细胞的方法。
该技术常用于难以转化的植物种类,如谷物、树木等。
植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定
植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定1. 引言植物基因转化是一种重要的生物工程技术,利用这种技术可以引入外源基因或修改内源基因,从而改变植物的性状和功能。
转基因植物是通过植物基因转化技术获得的具有外源基因的植物,具有重要的应用价值。
本文将介绍植物基因转化的基本原理和方法,并探讨转基因植物的分析与鉴定方法。
2. 植物基因转化的基本原理和方法2.1 基本原理植物基因转化利用穿透细胞壁的技术,将外源DNA导入植物细胞,通过细胞的内源机制使其稳定地表达。
常用的植物基因转化方法包括农杆菌介导的转化、生物弹射法和基因枪法等。
2.2 基本方法2.2.1 农杆菌介导的转化农杆菌介导的转化是最常用的植物基因转化方法之一。
基本步骤包括构建表达载体、感受剂的处理和遗传转化的选择和鉴定。
构建表达载体时,将目标基因插入适当的载体上,并添加转录和翻译的调控序列,如启动子和终止子,以确保目标基因的表达。
感受剂的处理是将表达载体导入农杆菌中,并通过培养条件的优化,使农杆菌中的表达载体得到高效表达。
遗传转化的选择和鉴定是将感受剂经过适当的处理后,转化到植物细胞中,并通过筛选和鉴定来确定转化成功的细胞株。
2.2.2 生物弹射法生物弹射法是将DNA以高速撞击植物细胞,使其穿透细胞的质壁和细胞膜,进而将外源基因导入细胞内。
生物弹射法通常使用微粒子加速器或毛发管射击法进行。
微粒子加速器是一种将金属微粒或微球与外源DNA一起加速,并将其发射到目标细胞上的设备。
通过微粒的高速撞击,外源基因能够穿透细胞的质壁和细胞膜。
毛发管射击法是将DNA包裹在微小的金属颗粒上,然后使用高压气体将金属颗粒射击到目标细胞上。
这种方法也能够使外源基因穿透细胞膜进入细胞。
2.2.3 基因枪法基因枪法是将外源DNA包裹在金粒或微米级金属颗粒上,并使用高压气体或炮发射器将其穿过细胞质,进入植物细胞。
基因枪法不需要依赖转化菌或细胞融合等辅助手段,直接将外源DNA送入目标细胞,因此具有较高的成功率。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。
植物遗传转化方法和转基因植株的鉴定金万枚 巩振辉 李桂荣 张桂华(西北农业大学 陕西杨陵 712100)提 要 对现有主要植物遗传转化方法和转基因植株的鉴定进行了比较分析,并对它们在植物遗传转化中的前景进行了展望。
关键词 植物;遗传转化方法;转基因植株;转基因植株鉴定 人们可通过有性杂交,物理化学诱变或自然变异来创造新物种和新品种。
但常常存在着杂交不亲和或杂种不育而造成的生殖隔离,也存在诱变的非定向性。
采用遗传转化技术,将所要求的外源目的基因导入受体植株,并通过对转化植株的鉴定选择,从而创造出人类所需要的新品种或新物种。
植物遗传转化方法和转基因植株的鉴定是植物遗传转化的重要环节。
关3国家自然科学基金资助,项目编号39770522。
优质小麦品质的决定性因素;其次要有较强的生活力,保证营养生长健壮。
3.3.2 播种 研究表明,适当晚播和增加密度能在稳定产量的基础上提高小麦品质。
根据我省实际,关中优质专用小麦播量应控制在每亩6~8kg,渭北应控制在9kg。
播期可依据实际情况较当地常规适播期推迟2~3d。
提倡机械以精量半精量播种。
3.4 灌水灌水对小麦品质的影响比较复杂,尤以抽穗至成熟期间影响最大,此期灌水会降低蛋白质含量,对沉淀值等加工品质也不利,但如果氮量充足或灌水与施氮结合则蛋白质含量不下降或下降很慢。
因而施肥上的前氮后移也为后期合理灌水提供了条件。
中国农业大学曾研究出一套节水高产栽培技术,小麦春季可只灌一次,并将灌水时期移至孕穗期;若特别干旱,可在拔节期和开花期分别灌水。
这种灌水制度与前氮后移的施肥方法配合起来,有利于优质专用小麦生产。
3.5 地膜覆盖地膜覆盖栽培能使小麦产量大幅度提高,对品质的影响这方面研究还较少。
陕西省农科院小麦中心的初步研究表明,小麦覆膜后籽粒容重有不同程度提高;蛋白质含量与正常露地播种没有差异;覆膜不影响不同生态类型品种的干、湿面筋值和沉淀值;但不同生态类型品种之间籽粒容重、蛋白质含量、干、湿面筋值和沉淀值存在较大差异。
优质专用小麦可以采用地膜栽培,但不应忽视地膜覆盖后对小麦生育期及农艺性状的影响,比如植株增高,应采取化控措施,在小麦返青~起身期,喷施壮丰安防止倒伏;再如部分病虫害发生的提前与危害加重问题,应及时开展病虫防治,减少对产量和品质的影响。
同时提供麦收前一个月揭膜,减少地膜污染。
3.6 病虫害防治优质专用小麦病虫害的防治,应尽量减少化学药品残苗,不要影响食用品质。
应坚持综合防治的原则,要采用农业防治、物理防治和生物防治措施,减少化学药剂防治次数;选用高效低毒低残留农药;收获前20d以内严禁施药;使用农药增效剂,提高防治效果。
3.7 收获收获是优质专用小麦栽培的最后一个环节;也是比较关键的环节。
要做到单收、单贮、单独销售,实现优质优价优加工。
于植物遗传转化方法的研究报道颇多,不同转化方法的转化率差异较大,同一转化方法在不同植物上的转化率亦有明显差异;此外,不同学者在对转化植株进行鉴定的策略和方法上所采用的选择标记基因、报告基因,以及外源基因在受体植物上的不同表达水平所采用的鉴定方法亦有差异。
因此,本文试图通过对植物遗传转化方法及转化植株鉴定策略与方法的综合分析,旨在为进一步研究和应用高效遗传转化体系,提高转化植株的准确性,研究植物基因与表达的关系提供参考。
1 植物遗传转化方法选择适宜的遗传转化方法是提高遗传转化率的重要环节之一。
尽管转基因的方法很多,但从遗传转化系统来说,可分为两大类,一类是以载体为媒介的遗传转化,另一类是外源目的DNA的直接转化。
1.1 载体法1.1.1 农杆菌T i或R i质粒介导法 农杆菌T i或R i质粒介导法是迄今植物基因工程应用最多、最理想的方法。
早在70年代末80年代初,人们发现根癌农杆菌(A robacterium tum e2 f acians)侵染植物后将其T i质粒(tum o r in2 ducing p las m id)上一段DNA(T-DNA)插入到被侵染细胞的基因组中,并能稳定地遗传给后代[1]。
此后发现T i质粒上有若干重大区域:复制起始位点,致病区(V ir区),T-DAN区和农杆碱分解代谢区。
V ir区受到植物细胞释放的信号分子的刺激才能表达,这些信号分子都是水溶性的酚类化合物。
此外,根癌农杆菌染色体致病区(chv regi on)有两个独立的转录单位, chvA和chvB,其中chvB的产物可能与根癌农杆菌表面2-环-B-葡聚糖的合成有关,是保证根癌农杆菌吸附于植物细胞壁所必需的成份,chvA可能与吸附过程有关。
而T-DNA区只要两端序列存在且方向正确,在两端序列中间插入任何一段DNA片段都可能被转移到植物基因组中。
发根农杆菌(A g robacterium rh iz o2 g enes)侵染植物是将其质粒(p las m id)上的T-DNA插入到宿主植物基因组中,这一点与T i质粒相类似。
转移机制也类似,所不同的是vir区和T-DNA区所含基因及其同源性不同[2]。
发根农杆菌由于宿主植物损伤部位产生的酚类化合物而附着在植物的细胞壁上,virA的产物是一种跨膜蛋白,进一步激活virG的产物。
T-DNA区的T L区具有较高的稳定性,T R区具有与生长表合成有关的基因tm s1和tm s2及农杆碱或甘露碱合成基因。
T R区可进行改造,这样R i通过农杆菌细胞膜特定“孔道”进入宿主植物细胞核,进而使T-DNA整合到植物基因组中。
基于以上原理,生物技术工作者,先将目的基因分离和鉴定,然后构建植物表达载体,最终将目的基因插入T-DNA区,通过农杆菌T i或R i质粒介导,将外源目的基因导入植物细胞,以获得转基因植株。
这种方法目前在油菜[3]、大豆[4]、甘蓝[5]、黄瓜[6]、籼稻[7]等植物中获得成功。
现将农杆菌介导的植物遗传转化常采用的方法,简要介绍如下。
1.1.2 叶盘法 叶盘法[8]是双子叶植物较为常用也较为简单有效的方法。
选取健康的无菌苗,用打孔器打出叶圆盘,将带有新鲜伤口的叶圆盘与载有目的基因的农杆菌液进行短期共培养,农杆菌通过伤口使携带外源目的基因的T i 或R i质粒进入植物细胞,使外源目的基因整合到植物基因组中。
1.1.3 真空渗入法 将适宜转化的健壮植株倒置浸于装有携带外源目的基因的农杆菌渗入培养基的容器中,经真空处理,造伤,使农杆菌通过伤口感染植株,在农杆菌的介导下,发生遗传转化。
这种方法在拟南芥[9]、大白菜、油菜[10、11]等均有成功地报道。
它是一种简便、快速、可靠而且不需要经过组织培养阶段即可获得大量转化植株的基因转移方法,具有良好的研究与应用前景。
1.1.4 原生质体法 原生质体法[12]是指在原生质培养的早期,将携带外源目的基因的农杆菌与原生质体共同培养,农杆菌的T i或R i就会随着外源信号分子的诱导而导入原生质体的核内,T-DNA就可能整合在受体基因组上。
现在,农杆菌介导的植物遗传方法已广泛用于植物细胞[8]、愈伤组织、茎切段[12],子叶下胚轴[13]等遗传转化上。
1.1.5 脂质体法 脂质体是人工拟造的类脂(或胆固醇)与磷脂构成的小体,能够跨膜转运,可将核酸包裹起来,免于核酸酶的作用而保持核酸的完整性。
脂质体制备方法简单,比较稳定,毒性小。
用于研究细胞膜的相互作用和转移DNA、RNA和蛋白质等大分子到细胞中[14]。
此方法介导基因转移在烟草、青菜等植物[15]上有报道。
1.1.6 原生质球法 原生质球法与脂质体法相类似。
原生质球是除去细胞壁的细菌细胞。
通过与植物原生质体融合与吞噬作用将外源基因导入植物细胞中。
此外,作为载体法,新的转基因方法[16]有:基于A C D S转座系统建立的转化载体;利用噬菌体P1C re-lox位点的特异性重组系统;利用酵母线粒体I-Sce I核酸内切酶特异性诱导植物DNA双链断开引起的同源重组系统;利用双元细菌人造染色体载体系统等,能够提高转化率或转基因位点质量。
1.2 外源DNA直接转化法目的基因分离鉴定以后,在它的5’端加上启动子,在3’端加上终止子,目的基因就能够在植物中有效地表达。
植物基因工程中常采用的启动子是从Ca M V中分离的35S启动子,其次是胭脂碱和章鱼碱合成酶的no s启动子和ocs启动子。
终止子常采用no s终止子或R u2 b isco小亚基基因的3’端区域。
这样,通过修饰之后的目的基因就可以直接导入植物的外植体。
常见的外源DNA直接转化法有基因枪法、化学药剂诱导法和花粉管通道法。
1.2.1 基因枪法 基因枪(p article gun)[17]是1987年美国康奈尔大学Sanfo rd等人首先发明的。
这种方法原理简单,用被放电而加速的金属颗粒对细胞击孔,通过金属微粒将附着其表面的外源目的基因引入到受体细胞中,整合到基因组中。
在籼稻[18]、小麦、玉米[19]、谷子[20]、水稻[21]等禾谷类作物上已有许多成功地报道。
1.2.2 化学药剂诱导法 常用的转化细胞的化学药剂有聚乙二醇(PEG),多聚鸟氨酸(PLO),聚乙烯醇(PVA)等,其中以PEG应用较多,效果较好。
它们能够诱导质粒DNA进入植物细胞,从而达到转基因的目的。
应用这种方法已在大麦[22]等禾谷类作物上成功地获得了转基因植株。
1.2.3 花粉通道法 这种方法是利用开花植物授粉后形成的花粉管通道,直接将外源目的基因导入尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞,实现目的基因的转化。
它是一种直接、简便的转基因方法[23],不需要组织培养的继代,从而排除了植株再生的障碍。
最为成功和有影响的就是转基因抗虫棉的获得[24],在蔬菜作物[25]中也有应用报道。
此外,其它遗传转化方法,如显微注射法[14]、激光微束穿刺法[26],多聚阳离子基因导入法[27]等,亦在不同植物上有成功的报道。
限于篇幅,这里不再一一赘述。
迄今为止,植物基因转移方法可大致归为以上两大类。
DNA直接转化法的优点,没有宿主的限制,但转化的DNA重组率高,往往导致多拷贝整合,引起基因丢失或沉默;载体介导法,得到单拷贝或低拷贝整合的外源DNA,但易受宿主限制。
无论是载体法还是外源DNA 直接导入法,使用时可根据不同植物,不同受体等多种因素选择最佳方法。
2 转化植株的鉴定植物外植体经过农杆菌等介导或DNA的直接转化后,大部分转化体包括细胞、组织、器官或植株是没有转化的,只有少数被转化,这就需要采用特定的方法将未转化的细胞、组织、器官或植株与转化的区分开来,淘汰未转化的。
目前,应用于转基因植株的鉴定方法可分为利用标记基因进行鉴定、分子检测和免疫技术三大类,现简要分述如下。
2.1 标记基因的使用标记基因,包括选择标记基因和报告基因。
它常常用于植物遗传转化中筛选和鉴定转化的细胞、组织、器官和再生植株,通常与目的基因构建在同一植物表达载体上,一起转入受体。