第五章 细胞融合

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单克隆抗体生产
单克隆抗体的特点 1）单克隆抗体是针对单一抗原决定簇的化学结 构完全相同的单一抗体，其特异性强，与其对应抗 原的亲和力高度均一； 2）杂种瘤细胞株可冷冻于液氮中长期保存，所 以单克隆抗体可以重复、稳定地制备，不会因批号 不同而产生差异； 3）产生单克隆抗体的杂交瘤株可在体外扩大培 养。
融合过程

细胞融合主要经过了以下4步：


两原生质体或细胞互相靠近
细胞桥形成


胞质渗透
细胞核融合 其中细胞桥的形成是细胞融合最关键的一 步
5．4


融合材料
5． 4．1
植物或微生物原生质体的制备
植物和许多微生物细胞外有一层坚韧的细胞 壁，为了促使这样细胞的融合就必须先得到单个 细胞，除去细胞壁，才能获得植物原生质体或微 生物原生质球 。因此时于植物和微生物细胞的融 合一般又可称为原生质体融合。


最适宜的密度是2-8×104个/ml。
4、在融合液中加入少量CaCI2,既可维持一定电导率， 对细胞也有保护作用。 另外交变电流的强弱、处理时间长短、电脉冲大小 均会影响融合率。


5 、此外，用混合盐溶液对原生质进行融合前处理， 以及在促融剂中添加伴刀豆蛋白、二甲基亚砜等可提 高融合率。


胞电融合和电穿孔仪，独 特的交流非正弦波 使细 胞双向电泳排列到一起， 然后在微秒级时间内转换
成直流方波使细胞融合，
融合后的交流脉冲稳定杂
合细胞的融合状态，大大
提高了细胞融合的效率。 电融合仪
二、 基本过程 细胞膜的接触：

当原生质体臵于电导率很低的溶液中时，电场 通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其 结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子， 从而使原生质体紧密接触排列成串
病毒颗粒 细胞核
细胞核
5．5

细胞融合技术
细 胞 融 合 技 术
生物法
化学法
物理法 细胞融合的影响因素
PEG结合高Ca2+、PH诱导法
细胞融合中的化学法诱导主要包括： NaNO3诱导 NaNO3能中和原生质体表面负电荷，促进 原生质体聚集，对原生质体无损害，但融合效率低。



5． 7
细胞融合技术的应用举例
植物原生质体融合的研究已有90 多年的历史。 但现代植物细胞融合技术研究是从20世纪60年代才开 始的，20世纪70年代，一些科学家探讨了植物细胞杂 交的内容、方法和意义，并提出具有吸引力的以番茄 和马铃薯为细胞杂交亲本的细胞杂交模型，推动了原 生质体融合技术研究的广泛开展。此后、逐步形成了 通过细胞杂交进行作物改良的新观念 。
1000以上者为固体。

1974年人们用它诱导大麦、大豆植物原生质 体融合，以后又用PEG诱导与用高Ca2+和PH诱导 相结合，极大地提高了融合效率。

机制
由于PEG分子带有大量负电荷，和原 生质体表面的负电荷在钙离子的连接下 形成静电键，从而在原生质体之间形成 分子桥，其结果是使原生质体发生粘连 而促使原生质体的融合；另外，PEG能增 加类脂膜的流动性，也使原生质体的核、 细胞器发生融合成为可能。
由于这个新细胞得到了来自两个细胞的染色体组和 细胞质，在适宜的条件下来培养，长成的生物个体就是 一个新的物种或品系。



5．3 基本原理
新 生 物

细胞可以发生融合的生物范围是很广的。到 目前为止、已经在种间、属间、科间以及动植 物两界之间都做过细胞融合的尝试，但只有体 细胞的无性杂交才是真正意义上的细胞融合技 术。

用高Ca2+和PH溶液把与质膜结合的PEG 分子进行洗脱，导致电荷平衡失调并重 新分配，使两种原生质体上的正负电荷 连接起来，进而形成具有共同质膜的融 合体。


物理法
基本原理 开发较晚，但目前应用广泛。
一、


电融合必须有融合仪和融合板。
原理：在直流电脉冲的诱导下，原生质体质膜表面
的电荷和氧化还原电位发生改变。使异种原生质体


膜的击穿：
原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲 就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的 细胞融合在一起
5．5

细胞融合技术
细 胞 融 合 技 术
生物法
化学法
物理法 细胞融合的影响因素
细胞融合的影响因素

一、
影响植物细胞融合的因素
植物原生质体融合无种属特异性，与其自身种属无关， 故其融合效率仅与外界条件有关。
黏合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，至 到闭和成完整的膜形成融合体。
与PEG法比较，电融合法三大优点： 1、融合率高、重复性强、对原生质体伤害小；

2、装臵精巧、方便简单、可在显微镜下观察或 录像融合过程；

3、免去PEG 诱导后的洗涤过程、诱导过程可控 制性强等等。
电融合仪

本产品是一台多功能的细


进行体细胞融合就可以避开生殖细胞的受 精过程。避免上述种种麻烦，从而在亲缘更远 的物种间实现基因转移，创造出自然界中所没 有的新物种。

例如，马铃薯和番茄通过细胞融合得 到了至今有性杂交未能获得的属间杂种 薯番茄和番茄薯。

许多研究人员成功地进行了不同 植物的细胞融合，并培养出了再生植 株后，许多人开始尝试培育不同种属 的超级杂交植物。１９７８年，德国 的梅罗帕斯博士用细胞融合的方法培 育出了马铃薯（土豆）和番茄的杂交 后代———薯番茄。他们先用酶液除 去马铃薯、番茄的细胞壁，然后将两 种去壁细胞（原生质体）等量混合， 在混合液中加进聚乙二醇溶液，使原 生质体紧密粘聚，再用高钙和高ｐＨ 溶液处理，结果，马铃薯与番茄两种 原生质体的融合率竟高达４０％～５ ０％。其中所育成的“番茄薯”新品 种地上部分能结番茄，地下部分能结 马铃薯



3、细胞融合时，需要适宜的温度和运动状态。

4、细胞融合过程中，通常耗氧量大，缺氧时 不融合。 5、有些细胞融合时需要Ca2+否则不融合。


6、最适合的PH为7.4-7.8之间，在此范围之外， 不宜融合。
5.6

融合细胞的选择
不同的融合产物在培养条件下有着不同的命运。

未融合的原生质体和同源融合的原生质体能较快 地适应培养条件而生长发育。
第五章
细胞融合
5．1 细胞融合的定义
又称体细胞杂交(Somatic hybridization) 是指将不同来源的原生质体（细胞）相融合并 使之分化再生、形成新物种或新品种的技术。
5．2

细胞融合的意义
人们很早就发现在生物界中有自发的细胞融合现象。 我们知道，无论是远缘杂交还是利用多倍体技术都要 先实现有性杂交，而亲缘关系较远的物种间杂交往往 表现为杂交不亲合或不能受精或是胚胎早期败育。 克服远缘杂交中的不亲和障碍； 优良性状改良 组合起各种植物的优良遗传性状，从而培育出理想的 新品种。
具体应用时要根据不同对象选择不同 的细胞融合方法和条件。 诱导动物细胞融合 仙台病毒HVJ诱导、 PEG法、电融合法都适用
植物细胞融合 微生物细胞融合 常用PEG法和电融合法； 只适用PEG法


5．5．1 生物法—— 仙台病毒法

我们知道很多病毒都具有凝集细胞的能力。 它一边黏接在一个细胞表面，另外一边黏接 在另一个细胞表面，从而使两个细胞在病毒 的作用下靠近发生凝结。 仙台病毒也称日本血凝病毒HVJ,属黏液 病毒副流感类群，是RNA病毒，多型颗粒状， 易在小鼠中蔓延。

最简单的选择方法是利用双亲细胞形态和色泽上 的差异识别杂种细胞，但多数是根据细胞生理遗传上
的特性来选择。比较常用的杂种细胞筛选方法包括：

(1)遗传互补筛选法：利用每一亲本贡献一个功能 正常等位基因，纠正另外一亲本的缺陷，从而令杂种 细胞表现正常功能的原理选择杂种细胞。 如亲本1：叶绿体缺陷型 亲本2：光致死型 两亲本在光照下一种死亡，另一种呈白色，融合细胞 长成植株呈绿色，并能成长


由于被感染细胞表面发生某些改变，使 得这些细胞容易发生融合，甚至处死的HVJ 病毒也具有促进细胞融合的作用。 日本学者冈田利用仙台病毒使两种不同 的动物细胞之间发生凝集，进而融合成一体。


研究发现：促进细胞融合的有效部位在于 病毒的膜，被超声波打碎的病毒膜片仍具有 促进细胞融合的功能。
仙台病毒促使细胞融合的因素与病毒被膜 上的磷脂成分有关，而与病毒内核酸的活性 无关。 仙台病毒被膜糖蛋白与其促融合的能力有 关。在动物细胞融合中，仙台病毒(HVJ)已成 为产生细胞杂种的标准融合剂。




病毒促使细胞融合的主要步骤：
(1)两个原生质体或细胞在病毒黏结作用
下彼此靠近

(2)通过病毒与原生质体或细胞膜的作用
是两个细胞膜间互相渗透，胞质互相渗透

(3)两个原生质体的细胞核互相融合，融 为一体 (4)进入正常的细胞分裂途径，分裂成含 有两种染色体的杂种子细胞。

用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程
1、PEG诱导融合的关键是作用时间，尤其是高Ca2+和PH

溶液处理时间长短非常重要。

时间过长，原生质体损伤严重，融合效率低 过短则不融合。 2、 PEG规格和纯度与融合效率也有关系。


3、在电场诱导融合时，融合率与原生质体密度有关，
密度小于104个/ml融合效率较低，大于106个/ml，会融 合成团。



5．4．2 动物单个细胞的获得 （一）组织的获得 (二)组织的消化
5．5
细胞融合技术
细 胞 融 合 技 术
生物法
化学法
物理法 细胞融合的影响因素

物理法
主要包括显微操作、电场刺激等；

化学法 主要是用聚乙二醇PEG结合高PH、 高钙离子法； 生物法 有仙台病毒法等。



存在问题
（1）通过融合将双亲的染色体组相加，往往 会造成遗传上的不稳定，杂种细胞也不易分化 成株。
(2)从野生种带进过多的不良基因

5．3 基本原理及步骤

1、对于植物细胞而言，一般先得到原生质体 2、通过物理或化学方法诱导细胞融合形成杂种细胞 3、进行杂种细胞的分检和培养
4、促使杂种细胞分裂形成细胞团、愈伤组织、直至形成 杂种植株，从而实现基因在远缘物种间的转移
高Ca2+和pH诱导法 PEG诱导 PEG结合高Ca2+和PH诱导法 上面几种方法中以PEG结合高Ca2+和PH诱导法最为常 用，下面做重点介绍：
：
5．5． 2．1

基本原理
聚乙二醇(PEG)是一种多聚化合物，商品
名卡波蜡，实验室用的PEG ，平均相对分子质
量在200-2000之间，一般1000以下者为液体，

(5)其他方法：采用显微操作技术也能把单 个异核体分离出来进行培养。因为如果是融 合细胞，就必定具有与双亲本不同的荧光标 记，所以科学家发明了一种普遍适用的方法， 即采用无毒的荧光素标记双亲原生质体。融 合后利用一种电子荧光激活选择器自动分类 和选择融合细胞。
以上方法中利用选择性培养基是一个很 常用的杂种细胞选择方法。
二、影响动物细胞融合的因素
在动物细胞的融合过程中，除促融剂外，细胞性 质、温度、PH、离子强度、离子种类均可影响细胞融 合率。 1、亲本细胞表面性质影响较大，表面覆盖绒毛而 不规则者容易融合，而表面光滑者较难融合。 2、细胞种类不同，融合效果也不同，如：腹水癌 较易融合，而淋巴细胞、血细胞几乎不融合。
异源融合体往往因它们发育缓慢而受到优势生长 的亲本原生质体融合细胞的抑制，不易发育成杂种。 因此需要通过培养和筛选，除去不需要的细胞，分离 出需要的杂种细胞，从而解决融合细胞的选择问题。

5.6
融合细胞的选择

对于如何筛选杂种细胞，尚无特定规律 可循，需对不同对象设计具体的筛选方案 和选择体系，优先选择杂种细胞，或只允 许杂种细胞生长，以淘汰亲本细胞。


(2)抗体互补筛选法；利用亲本原生质体 对抗生素、除草剂及其他毒性物质抗性差异来 选择杂种细胞。抗性突变体或抗药性有差异的 可采用这种方法。

(3)生长特性筛选法：利用原生质体 对培养基成分要求与反应的差异选择杂种细胞。 例如：亲本原生质体生长要求外源激素，而有 的杂种细胞由于双亲互补作用会产生内激素， 从而使杂种细胞能在无激素的培养基上生长。

近年来，科学家利用以细胞融合为核心技 •
术的操作取得了很大的科研成果，杂交育种
已成为培育动物新品种的一个有效手段。
如已培育出绵山羊：具有绵羊的卷曲浓密的
长毛、山羊式的羊角，毛肉兼用。
单克隆抗体生产

抗原决定簇：存在于抗原分子表面，决定 该抗原特异性的特殊化学基团。
Polyclonal antibody,PcAb：针对多种抗 原决定簇的混合抗体 Monoclonal antibody,McAb:由单个B细胞克 隆产生的针对单一抗原决定簇的同源抗体