鸡肝中过氧化氢酶提取,和大肠杆菌质粒提取详解
大肠杆菌中质粒DNA大量提取条件的优化
大肠杆菌中质粒DNA大量提取条件的优化大肠杆菌是一种常见的细菌，可以在肠道和环境中找到。
质粒DNA是一种重要的DNA 分子，常常存在于细菌中，并且可以通过大肠杆菌进行大量提取。
在实验室中，提取质粒DNA是进行分子生物学实验的重要步骤之一。
本文将讨论大肠杆菌中质粒DNA大量提取条件的优化。
大肠杆菌中质粒DNA提取的基本步骤包括：菌落培养、菌体收集、细胞壁裂解、质粒DNA纯化和质粒DNA溶解。
在这些步骤中，有许多条件可以进行优化，以提高质粒DNA的提取效率和纯度。
菌落培养是质粒DNA提取的起始步骤。
优化菌落培养条件可以提高菌体数量和质粒DNA含量。
需要注意的是，合适的培养温度、培养时间和培养培养基的选择对质粒DNA的提取有重要影响。
一般来说，37摄氏度是大肠杆菌的适宜培养温度，培养时间通常在12-16小时之间。
选择适当的培养基也是提高菌体数量的重要因素，例如LB培养基通常是质粒DNA提取的较好选择。
菌体收集和细胞壁裂解也是质粒DNA提取过程中的关键步骤。
优化细胞壁裂解条件可以有效释放质粒DNA，并避免蛋白质和其他杂质的污染。
通常使用裂解缓冲液和蛋白酶来实现细胞壁裂解，而优化裂解缓冲液的配方和蛋白酶的添加量可以影响质粒DNA的纯度和产量。
合适的菌体收集方法也可以避免细胞壁裂解过程中的损伤和污染。
质粒DNA纯化是提取过程中最重要的一步。
通过离心、吸附、洗涤和洗脱等步骤，可以将质粒DNA从混合物中分离出来。
在这些步骤中，合适的离心速度、吸附剂选择、洗涤缓冲液的配方和洗脱溶液的pH值等条件都可以进行优化，以提高质粒DNA的纯度和产量。
质粒DNA的溶解条件也对最终的提取结果有影响。
通常使用TE缓冲液（Tris-HCl和EDTA）来溶解质粒DNA，而调节TE缓冲液的pH值和温度可以影响质粒DNA的稳定性和可溶性。
实验动物肝脏提取详解演示文稿
（3）插入梳子，梳齿下端离板底0.5－1mm。 （4）在胶床上滴加2－3滴 0.5μg/mL的EB溶液。 （5）将60℃凝胶不间断倒入胶床，高3－4mm，避免气泡，摇匀，
室温下凝固。
（6）完全凝固后，撕掉胶带，置于电泳槽中，加入电泳缓冲液 ，高于胶面1－2mm，从一头轻轻斜拉出梳子，除去产生的气 泡。
因此，琼脂糖凝胶电泳已成为分子生物学及基因工程研究中常用实 验方法之一， DNA样本的分离、纯化、鉴定以及相对分子质量测定常 用琼脂糖凝胶电泳。
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荧光染料EB染色 后，在紫外灯 (λ305nm)下观察
到的电泳结果：
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* 荧光染料EB染色的原理和优点是什么？ 1、原理：
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荧光来自两方面，一是核酸吸收260nm的紫外光，并将 能量传给EB；二是EB本身吸收波长为302nm和360nm 的紫外光。这两方面的能量最终激发EB发出波长为 590nm的红橙色荧光。
溴化乙啶可加入凝胶中，也可以在电泳后，将凝胶放在 含EB的溶液中浸泡.
溴化乙啶检测DNA的灵敏度很高，可检出10ng甚至更 少的DNA。
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DNA分子在pH高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中 向正极移动（电荷效应） 。 DNA分子泳动速率的大小除与DNA分子的带电量有关外，还 与DNA分子的大小和空间构象有关（琼脂糖凝胶的分子筛效应 ）。 电泳时，用溴酚蓝做前沿指示剂，用溴化乙啶 （ethidium bromide，EB） 指示DNA样品在凝胶中的确切位置。 溴化乙啶是一种荧光染料，可插入DNA双螺旋结构的两个 碱基对之间，与DNA分子形成络合物，在紫外光的激发下发出 橙黄色的荧光。
从动物肝组织中分离、提取、纯化和鉴定一种酶
2.浓缩： 2.浓缩： 浓缩
从低浓度酶液中除去部分水或其他溶剂而成为高浓 度酶液的过程。浓缩的方法很多，离心分离、 度酶液的过程。浓缩的方法很多，离心分离、过滤 与膜分离、沉淀分离、 与膜分离、沉淀分离、层析分离等都能起到浓缩作 用各种吸水剂，如硅胶、聚乙二醇、 用。用各种吸水剂，如硅胶、聚乙二醇、干燥凝胶 等吸去水分，也可以达到浓缩效果。 等吸去水分，也可以达到浓缩效果。 本实验采用真空蒸发浓缩法。 本实验采用真空蒸发浓缩法。 真空蒸发浓缩：在一定的真空条件下， 真空蒸发浓缩：在一定的真空条件下，使酶液在 60℃以下汽化蒸发，进行浓缩的过程。 一般说来， 60℃以下汽化蒸发，进行浓缩的过程。 一般说来， 以下汽化蒸发 在不影响酶活力的前提下，适当提高温度、 在不影响酶活力的前提下，适当提高温度、降低压 增大蒸发面积都可以使蒸发速度提高。 力、增大蒸发面积都可以使蒸发速度提高。
10级七年二班 10级七年二班 第五组
材料的选择
因动物肝脏中的酶往往结合较多的脂 核酸的物质，所以取饥饿24 24小时 质、核酸的物质，所以取饥饿24小时 的动物肝脏为实验材料。 的动物肝脏为实验材料。
1. 细胞破碎
材料的预处理
机械破碎法：可选用捣碎法或匀浆法。 机械破碎法：可选用捣碎法或匀浆法。 捣碎法 使用匀浆法时应先将大块的组织或者细胞团用 使用匀浆法时应先将大块的组织或者细胞团用 大块的组织或者细胞团 组织捣碎机或研磨器械捣碎分散。 组织捣碎机或研磨器械捣碎分散。 研磨法常用于微生物 植物组织细胞的破碎故 微生物和 研磨法常用于微生物和植物组织细胞的破碎故 本实验不采用。 本实验不采用。 物理破碎法：冻融法、 物理破碎法：冻融法、渗透压法和超声波破碎法均 可。 使用冻融法应注意不能 过高的温度下操作 不能在 的温度下操作， 使用冻融法应注意不能在过高的温度下操作， 以免引起酶的变性失活。 以免引起酶的变性失活。 在冷库中进行， 使用超声波破碎法应注意操作需在冷库中进行 使用超声波破碎法应注意操作需在冷库中进行， 或将样品置于冰浴中，并采用问歇操作， 或将样品置于冰浴中，并采用问歇操作，如破碎 30～60 s，间歇1 min，如此反复进行。 30～ s，间歇1 min，如此反复进行。 化学破碎法：常用的化学试剂 化学试剂有 化学破碎法：常用的化学试剂有：① 有机试剂 甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等）； ）；② （甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等）；② 表面活性剂 Tween、特里顿（Triton） ）；③ （Tween、特里顿（Triton）等）；③ 螯合剂 EDTA：乙二胺四乙酸） 他们都可以增加细胞膜 （EDTA：乙二胺四乙酸）等。他们都可以增加细胞膜 的通透性，是酶容易释放。 的通透性，是酶容易释放。 酶溶法：因对此肝酶不了解故不采用此方法。 酶溶法：因对此肝酶不了解故不采用此方法。
大肠杆菌质粒DNA的提取
大肠杆菌质粒DNA的提取一、大肠杆菌质粒DNA的提取质粒DNA的提取是从事基因工程工作中的一项基本实验技术，但提取方法有很多种，以下介绍一种最常用的方法:碱裂解法:此方法适用于小量质粒DNA的提取，提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、银染序列分析。
方法如下:1、接1%含质粒的大肠杆菌细胞于2ml LB培养基。
2、37?振荡培养过夜。
3、取1.5ml菌体于Ep管，以4000rpm离心3min，弃上清液。
4、加0.lml溶液I(1,葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。
5、加入0.2ml溶液 II(0.2 mM/L NaOH，1, SDS)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
6、加入0.15m1预冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，轻轻翻转混匀，置于冰浴5 min 。
7、以10，000rpm离心20min，取上清液于另一新Ep管8、加入等体积的异戊醇，混匀后于?0?静置10min。
9、再以10，000rpm离心20min，弃上清。
10、用70,乙醇0(5ml洗涤一次，抽干所有液体。
11、待沉淀干燥后，溶于0(05mlTE缓冲液中煮沸法1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中,4?下12000,离心30秒。
2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。
3、将菌体沉淀悬浮于120ml STET溶液中, 涡旋混匀。
4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液(10mg/ml), 涡旋振荡3秒钟。
5、将eppendorf管放入沸水浴中,50秒后立即取出。
6、用微量离心机4?下12000g离心10分钟。
7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。
8、取20ml进行电泳检查。
[注意] 1. 对大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒DNA。
2. 煮沸法中添加溶菌酶有一定限度,浓度高时,细菌裂解效果反而不好。
从动物肝组织样品中分离提取纯化鉴定一种酶
感谢那些把自己的ppt放到网上的学长学姐！！要不然这实验怎么做！！设计实验报告12级七年儿科实验名称从动物肝组织样品中分离提取纯化鉴定一种酶实验目的1.掌握从肝细胞中分离提取纯化鉴定某种酶的实验方法2.培养灵活选择并综合使用各种生物学实验方法的能力3.培养探索精神和团队合作意识实验原理（一）材料的选择因动物肝脏中的酶往往结合较多的脂质、核酸的物质，所以取饥饿24小时的动物肝脏为实验材料。
（二）细胞破碎细胞破碎可选用三种方法：机械破碎法，物理破碎法，化学破碎法。
本次使用机械破碎法。
机械破碎法：可选匀浆法。
使用匀浆法时应先将大块的组织或者细胞团用组织捣碎机或研磨器械捣碎分散。
加入蛋白酶抑制剂的目的是防止蛋白酶的水解作用。
常用的蛋白酶抑制剂有苯甲基磺酰氟（PMSF）、二异丙基氟磷酸；金属蛋白酶抑制剂有EDTA和EGTA（乙二醇四乙酸）一般微生物和植物的粗酶液中有大量的核酸污染。
除核酸的常用方法是沉淀法，沉淀剂的选择需要大量的试验来选定，已知的有1%~2%的链霉素硫酸盐、PEG、溶菌酶等。
由于该酶的位置未知。
故应用超速离心分离技术分离胞液中的酶体和微粒体，细胞核和线粒体。
对三种成分分开研究，使得提取物中杂志减少。
（三）超速离心分离技术悬浮液静止不动时，由于重力场作用，悬浮颗粒就要逐渐的沉降下来，颗粒越重，下沉越快，反之则上浮。
但是颗粒在重力场中的沉降速度并不只与重量有关，还与密度，大小，形状有关。
但当颗粒大小小于几微米时沉降速度很慢而扩散现象非常严重。
所以必须用高速离心的方法，产生出强大的离心场，就产生了超速离心分离技术。
医保内不同结果的比重，大小，形态不同，在同一离心场中沉降速度不同。
可根据这一原理将亚细胞组分分离。
（四）酶的提取常用方法：盐溶液提取、酸溶液提取、碱溶液提取和有机溶剂提取。
本实验中因缺乏酶的更多信息，故采用盐溶液提取法。
盐溶液提取法盐溶液提取：适用于大多数酶。
盐溶现象：大多数P酶在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加。
质粒提取的原理操作步骤各溶液的作用
质粒提取的原理、操作步骤、各溶液的作用细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。
各类质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情形下可持续稳固地处于染色体外的游离状态，但在必然条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞割裂传递到后代。
质粒已成为目前最经常使用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可取得大量纯化的质粒DNA分子。
目前已有许多方式可用于质粒DNA的提取，本实验采纳碱裂解法提取质粒DNA。
碱裂解法是一种应用最为普遍的制备质粒DNA的方式，其大体原理为：当菌体在NaOH和 SDS 溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。
纯化质粒DNA的方式一般是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。
例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平稳离心、离子互换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方式，但这些方式相对昂贵或费时。
关于小量制备的质粒DNA，通过苯酚、氯仿抽提，RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA，所得纯化的质粒DNA已可知足细菌转化、DNA 片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中经常使用。
一、试剂预备1. 溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖，25mM Tris-HCl(pH ，10mM EDTA(pH ）。
1M Tris-HCl<!--[if !supportAnnotations]--><!--[endif]--> (pH ）， EDTA（pH ）10ml，葡萄糖，加ddH2O至500ml。
在10 lbf/in2高压灭菌15min ，贮存于4℃。
任何生物化学反映，第一要操纵好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl溶液。
质粒提取步骤及原理
质粒提取是分子生物学中常用的实验技术，其目的是从细菌中提取出质粒DNA，用于后续的基因操作和分析。
下面是质粒提取的主要步骤和原理的详细解释。
一、质粒提取原理
质粒是细胞内的一种环状的小分子DNA，是进行DNA重组的常用载体。
作为一个具有自身复制起点的复制单位独立于细胞的主染色体之外，质粒DNA上携带了部分的基因信息，经过基因表达后使其宿主细胞表现相应的性状。
在DNA重组中，质粒或经过改造后的质粒载体可通过连接外源基因构成重组体。
从宿主细胞中提取质粒DNA，是DNA重组技术中最基础的实验技能。
二、质粒提取步骤
培养细菌使质粒扩增：将含有目标质粒的细菌接种在适当的培养基上，提供适当的条件（如温度、湿度和营养）使细菌生长和繁殖，从而使质粒得到扩增。
收集和裂解细菌：通过离心等方法收集培养好的细菌，然后使用适当的裂解液裂解细菌，使细菌的细胞壁和细胞膜破裂，释放出内部的质粒DNA。
分离和纯化质粒DNA：通过离心、过滤或层析等方法，将裂解液中的蛋白质、细胞碎片等杂质去除，得到相对纯净的质粒DNA。
这个过程中可能需要使用一些特殊的试剂或柱子来提高分离和纯化的效率。
通过以上步骤，我们可以从细菌中提取出高质量的质粒DNA，用于后续的基因操作和分析。
2020年上海市高中毕业统一学业考试生物试卷(解析版)
2020年上海市普通高中学业水平等级性考试生物试卷一、选择题1. “芳林新叶催陈叶，流水前波让后波”，新叶中叶绿素的合成必须含有的离子是（）A. Mg2+B. Fe2+C. Zn+D. Ca2+【答案】A【解析】【分析】细胞内的无机盐主要以离子的形式存在，有的无机盐是某些复杂化合物的组成成分，如Mg是叶绿素的组成成分，碘是甲状腺激素合成的原料，钙是骨骼和牙齿的组成成分等；许多无机盐对于维持细胞和生物体的生命活动具有重要作用，生物体内无机盐降低会出现相应的疾病；有的无机盐还对于维持酸碱平衡和渗透压具有重要作用。
【详解】Mg2+是叶绿素的组成成分，A正确。
故选A。
2. 观察1000个酵母菌有丝分裂，根据表格分析时间最长的是（）A. G1期B. G2期C. S期D. M期【答案】A【解析】【分析】分裂间期包括G1期、S期和G2期，主要特点是完成DNA的复制和蛋白质合成。
【详解】分析表格可知，G1期的细胞数目比S期多，说明G1期时间比S期长，A正确。
故选A。
3. B淋巴细胞分化形成浆细胞和记忆B淋巴细胞，他们相同的是（）A. 细胞形态相同B. 蛋白质相同C. 遗传物质相同D. mRNA相同【答案】C【解析】【分析】B淋巴细胞受到抗原刺激后，在淋巴因子的作用下，分化形成浆细胞和记忆B淋巴细胞。
【详解】A、细胞分化会导致细胞的形态结构和功能发生稳定性差异，故细胞形态不同，A错误；B、细胞分化的实质是基因的选择性表达，故产生的蛋白质不同，B错误；C、细胞分化过程中并不改变遗传物质，故三种细胞遗传物质相同，C正确；D、细胞分化的实质是基因的选择性表达，故转录产生的mRNA相同，D错误。
故选C。
4. HIV通过cd4受体主要感染T淋巴细胞，主要阻断了人体的（）A. 细胞免疫B. 体液免疫C. 非特异性免疫D. 特异性免疫【答案】A【解析】【分析】免疫分为非特异性免疫和特异性免疫，特异性免疫又包括体液免疫和细胞免疫．T淋巴细胞主要在细胞免疫中起作用，在体液免疫中主要起分泌淋巴因子的作用；B淋巴细胞主要在体液免疫中起作用。
质粒提取原理和方法
质粒提取原理和方法质粒提取是从细菌基因组中提取出质粒DNA的一种方法。
它是分子生物学和遗传工程中常用的技术，可用于质粒的纯化和制备。
质粒提取的原理主要基于以下几个步骤：1.细菌培养：首先，我们需要将含有目标质粒的细菌培养在适当的培养基上，通过高速离心将细菌收集起来。
2.细菌溶解：将培养物进行离心，分离菌落。
然后采用一定的细胞破碎方法，如超声波震荡、冻融等，将细菌细胞壁破坏，使质粒DNA释放到溶液中。
3.质粒分离：通过离心将细菌碎片、蛋白质等杂质与质粒DNA分离。
一般是通过两次离心来完成，第一次较低速离心用于去除细菌碎片和细胞蛋白质，第二次较高速离心用于沉淀质粒DNA。
4.DNA纯化：将质粒DNA从上一步得到的沉淀物中提取出来。
可以使用酚/氯仿法、硅胶柱法、商用试剂盒等方法进行纯化。
其中酚/氯仿法是较为常用的方法，它可以将DNA溶于水相，而蛋白质和其他的污染物则溶于有机相。
5.DNA沉淀：将纯化得到的DNA溶液加入适量的酒精沉淀剂（如乙醇或异丙醇），再次进行高速离心，使DNA沉淀到离心管底部。
6.DNA洗涤：将离心管底部形成的DNA沉淀用70%乙醇洗涤，去除酒精沉淀剂和其他杂质。
然后用空气吹干，最后用一定体积的纯水或缓冲液溶解。
质粒提取的方法根据实验需求不同和实验室条件的不同可以有所差异，常用的方法有以下几种：1.酚/氯仿法：这是一种经典的DNA提取方法，它将质粒DNA溶于三氯甲烷和酚的混合物中，蛋白质和其他污染物则溶于酚相。
离心去除酚相，再用异丙醇沉淀DNA，最后用70%乙醇洗涤。
2.硅胶柱法：这是一种基于硅胶柱的离心柱技术，可用于高通量的质粒提取。
DNA样品在硅胶柱中被结合，杂质被洗掉，最后用纯水或缓冲液洗提质粒DNA。
3.磁珠法：这是一种基于磁性珠子的质粒提取方法，通过在磁性珠子表面修饰DNA结合物，使质粒DNA与磁性珠子结合。
通过外加磁场将磁性珠子与DNA一起沉淀，然后去除上清液，最后用纯水洗提DNA。
大肠杆菌质粒提取原理
大肠杆菌质粒提取原理
大肠杆菌质粒提取的原理主要包括以下几个步骤：
1. 细胞裂解：将大肠杆菌菌落接种到液体培养基中培养，在适当的培养时间后，将菌液离心沉淀，得到含有大肠杆菌细胞的沉淀物。
细胞裂解是通过物理或化学方法破坏细胞壁，释放细胞的内容物。
2. 质粒提取：将裂解后的细胞加入适当的缓冲液中，经过离心分离得到上清液和沉淀物。
上清液中含有质粒DNA，而细胞碎片和其他细胞器等则在沉淀物中。
3. DNA纯化：使用DNA纯化试剂盒或其他纯化方法将上清液中的质粒DNA分离纯化。
这些方法通常涉及对上清液进行酚/氯仿提取、乙醇沉淀或离心柱纯化等步骤，以去除杂质和纯化质粒DNA。
4. 质粒DNA定量：使用紫外线分光光度计对纯化后的质粒DNA进行定量，以确定得到的DNA的浓度和纯度。
5. 质粒DNA的后续应用：得到纯化的质粒DNA后，可进一步进行测序、限制性酶切、聚合酶链式反应(PCR)等分子生物学实验，以研究质粒DNA所携带的目的基因的功能、构建重组质粒或进行基因克隆等实验。
需要注意的是，在文中不提供标题或重复的文字。
如果需要添加标题，可以根据具体内容进行修改。
质粒抽提原理与详细操作步骤
质粒抽提原理与详细操作步骤质粒抽提,实验室必备技能之一质粒质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA 分子。
质粒抽提从细菌中分离质粒DNA的方法包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。
采用强碱液、加热或溶菌酶（主要针对革兰氏阳性细菌）可以破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠（SDS）和 TritonX-100（一般很少使用）可使细胞膜裂解。
经溶菌酶和SDS或 Triton X-100处理后，细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。
当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性，而共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA，简称cccDNA）的两条链不会相互分开。
当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。
质粒抽提最常用的方法是碱裂解法，它具有得率高、适用面广、快速和纯度高等特点。
当然，碱裂解法也有缺陷：容易导致不可逆的变性。
要降低不可逆的变性，就要控制好碱裂解的时间。
碱裂解法抽提质粒需要用到以下三种溶液溶液Ⅰ50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0），10 mmol/L EDTA（pH 8.0），在15 psi 压力下蒸汽灭菌15 min，4℃保存。
溶液Ⅱ0.2 mmol/L NaOH（从10 mmol/L 贮存液中现用现稀释），10 g/L SDS（室温保存）。
溶液Ⅲ5 mol/L乙酸钾 60.0 mL，冰乙酸 11.5 mL，无菌水28.5 mL，4℃保存，使用时置于冰浴中。
下面介绍一下碱裂解法小提质粒的具体操作：01柱平衡：向吸附柱中加入500 μl平衡Buffer，12000 rpm离心30-60 s，倒掉收集管中的废液；注意：吸附柱平衡后可最大限度激活硅基质膜，提高质粒的得率；吸附柱平衡后应立即使用，长时间放置会影响其吸附效果。
从动物肝组织中分离、提取酶
4.离子交换柱层析法分离纯化肝脏酶
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4.离子交换柱层析法分离纯化肝脏酶
实验步骤：
1. DEAE-纤维素处理为PH值为6.1（Hcl） 2. 装柱与平衡（乙酸铵溶液） 3. 样品上样、乙酸铵溶液洗脱收集，以20%三氯乙酸或 磺基水杨酸溶液检测蛋白质含量为纵坐标，收集管号 为横坐标，绘制洗脱峰曲线，收 集第一个峰的蛋白 溶液 4. 处理DEAE-纤维素溶液为PH=6.3 5. 装柱与平衡（乙酸铵溶液） 6. 样品上样、用乙酸铵缓冲液洗脱收集，以蛋白质含 量为纵坐 标，收集管号为横坐标，绘制洗脱峰曲线， 收集第二个峰的酶溶液 即为PI=6.2左右的蛋白质溶液
实验步骤：
1. 离心管中加入5ml 0.34M蔗糖，将5ml匀浆轻 轻覆在 其上，1600r/min离心10min，得上清 液（1） 2. 沉淀加10ml 0.25M蔗糖混匀，3500r/min离心 10min， 得上清液（2） 3. 将上清液（1）（2）混合取1ml,6600r/min 离心 10min，得上清液，即为酶体和微粒体
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实验流程：
1.取动物肝组织 2.制作组织浆液 3.动物肝酶的初步分离提取 4.离子交换柱层析法分离纯化肝酶 5.肝酶活性检验 6.SDS-聚丙烯凝胶电泳鉴定肝酶分离纯度
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6.SDS-聚丙烯凝胶电泳鉴定肝酶分离 纯度
原理：
Acr (丙烯酰胺) + Bis (交联剂N) 网状结构凝胶 引发剂过硫酸铵（Ap），催化剂四甲基乙二胺（TEMED）
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梯度离心获得含有酶的细胞液
原理：
离心基本原理是根据物质沉降系数、质量、 浮力因子等不同，利用离心机产生的强大 离心力来分离具有不同沉降系数的物质。 沉降系数是为颗粒在离心力场的作用下， 从静止状态到达极限速度所需要的时间。 其单位用S表示，反映的是单位离心力作用 下颗粒沉降的速度。
鸡肝中过氧化氢酶提取,和大肠杆菌质粒提取
大肠杆菌中质粒的小量提取及核酸电泳摘要：采用碱裂解法将大肠杆菌中的质粒DNA分子进行分离和纯化，将分离纯化后的质粒DNA分子进行琼脂糖凝胶电泳，并在紫外成像仪中观察DNA条带，以测定所得到的质粒DNA片段的分子量大小。
结果表明，成功从大肠杆菌中提取出质粒DNA分子，其分子量大小约为2000bp。
关键词：质粒DNA分子；碱裂解法；分子量；电泳引言质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子。
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。
在碱性电泳缓冲液中带负电荷，所以在外加电场作用下会向正极迁移。
将提取到的DNA 分子提取液中加入核酸染色剂，经过琼脂糖凝胶电泳后，利用紫外灯照射即可观察到所提取的DNA条带，第一泳道加入合适的Marker 与之进行比对，即可较为准确地估测出所提取出的质粒DNA分子量。
1 材料与方法1.1 实验材料(1) 含质粒Psd-T19的大肠杆菌(2) 试剂：细菌质粒小量提取试剂盒、琼脂糖，电泳缓冲液（TAE），核酸电泳上样缓冲液（6×），标准分子量的DNA等。
1.2 实验仪器微量移液器、试管、微波炉、离心机、电泳仪、凝胶成像系统、天平。
1.3 质粒的提取（小量试剂盒提取）(1) 首先取1.5ml混匀的菌液于1.5ml离心管中，台式离心机中12000r/m离心1min，弃上清液得到大肠杆菌菌体；(2) 按照试剂盒提取的步骤提取出大肠杆菌质粒DNA。
1.4 核酸电泳(1) 制备1%琼脂糖凝胶，并添加GoldVied I核酸染料；(2) 加样：在离心管中混合DNA样品2-3ul和1ul上样缓冲液。
采用梯度上样，上样量分别为2ul、4ul、6ul、8ul和5ulDNA分子量标记；(3) 电泳：120V，40min；(4) 观察：将电泳后的凝胶放置于透射紫外光下进行观察，对照分子量标记判断DNA样品的分子量大小。
如何从动物肝脏中提取一种酶
实验原理
五，离子交换柱层析(Ion exchange column chromatography )，
按照可交换离子的类型分为阳离子交换柱色谱法和阴离子交换柱 色谱法。根据物质酸碱性、极性等差异，通过离子间的吸附和解 吸而将电解质各组分分开。 在离子交换过程中，可以将杂蛋白选择性地结合到离子交换剂上， 其余蛋白存在于过柱液中;或将欲分离蛋白选择性地结合到离子交 换剂上，杂蛋白存在于过柱液中;或几种带同性电荷的蛋白均结合 到交换剂上，利用其结合的牢固程度不同(即带电荷的数目不同)， 静电引力不同，分步洗脱下来，达到分离的目的。
案例实验：
从动物肝组织样品中分离提取纯 化鉴定一种酶
实验目的：
1，掌握从肝细胞中分离提取纯化鉴 定某种酶的实验方法 2，培养灵活选择并综合使用各种生 物实验方法的能力 3， 培养探索精神及团队合作意识
实验原理
一，材料预处理
1，因动物肝脏中的酶往往结合较多的脂质、核酸的物质，所 以取饥饿24小时的动物肝脏为实验材料。 2，由于细胞膜的半透膜性质，将细胞置于低渗溶液中，细胞 易胀破，通过搅碎研磨可以得到细胞质中的胞液以及细胞核 等各种细胞器和少量的细胞器碎片。 3，由于目前未知该酶的具体位置，因此对胞液，细胞核和线 粒体应该分开研究，使得提取物中杂质尽量减少。
5，根据选取的方法设计实验具体步骤
1，正确选材 总的来说，材料选择应遵循的原则是：有效成分含量多，稳
定性好；来源丰富、保持新鲜；提取容易、工艺简单；杂质有综 合利用价值。
2，材料预处理 及时使用避免有效成分丧失，否则应及时冰冻或干燥储存，
2023年广东省普通高中学业水平合格性考试生物模拟测试卷(六) 含答案与解析
2023年广东省普通高中学业水平合格性考试生物科模拟仿真卷(六）(时间60分钟，总分100分)一、选择题(本大题共20小题，每小题3分，共60分。
在每小题给出的四个选项中，只有一个选项是最符合题目要求的)1.如图为动物细胞有丝分裂过程中的几个示意图。
据图分析，以下说法错误的是()A.乙图与丙图细胞内染色体数目相等B.丁图的母细胞有4条染色体C.甲图的细胞内有4条染色体D.丙图是观察辨认染色体形态、数目的最佳时期2.下列事实中，能说明细胞具有全能性的是()A.花药离体培养成单倍体植株B.小鼠与人的细胞融合C.蝌蚪发育成蛙D.将烧伤者的皮肤培养后移植3.如图为ATP与ADP相互转化的关系式，下列说法错误的是()A.ATP中有三个特殊的化学键，A代表腺嘌呤B.人体细胞中①过程一般与细胞呼吸相联系C.②过程能直接为肌细胞的收缩提供能量D.ADP中有一个特殊的化学键，A代表腺苷4.如图表示某人体内的几种细胞，它们的形态、结构和功能各不相同的根本原因是()A.DNA的结构不同B.mRNA不同C.遗传物质不同D.线粒体结构不同5.控制豌豆子叶颜色的等位基因Y和y的本质区别是()A.基因Y、y位于同源染色体上B.Y对y为显性C.减数分裂时基因Y和y分离D.二者的碱基序列存在差异6.在甲、乙试管中各加入2 mL体积分数为3%的过氧化氢溶液，再向甲试管中加入2滴新鲜鸡肝匀浆，向乙试管中加入2滴质量分数为3.5%的FeCl3溶液，观察到的现象是()A.甲试管比乙试管产生的气泡多B.甲试管比乙试管产生的气泡少C.甲试管不产生气泡，乙试管产生气泡D.甲试管产生气泡，乙试管不产生气泡7.卵细胞形成特点不同于精子形成特点的是()①卵细胞的形成过程无变形期②一个初级卵母细胞只形成一个卵细胞③卵细胞形成过程中无联会现象④卵细胞形成过程中不出现四分体A.①④B.①②C.②④D.②③8.艾弗里等人的肺炎链球菌转化实验和赫尔希与蔡斯的噬菌体侵染细菌实验都证明了DNA是遗传物质。
浙江省七彩阳光新高考研究联盟2024-2025学年高二上学期11月期中生物试题含解析
2024学年第一学期七彩阳光新高考研究联盟期中联考高二年级生物学科试题（答案在最后）考生须知：1．本卷共8页满分100分，考试时间90分钟。
2．答题前，在答题卷指定区域填写班级、姓名、考场号、座位号及准考证号并填涂相应数字。
3．所有答案必须写在答题纸上，写在试卷上无效。
4．考试结束后，只需上交答题纸。
选择题部分一、选择题（本大题共20小题，每小题2分，共40分。
每小题列出的四个备选项中只有一个是符合题目要求的，不选、多选、错选均不得分）1.细胞外液是人体细胞生活的内环境，下列物质正常情况下不会在内环境中出现的是（）A.DNA聚合酶B.胆固醇C.葡萄糖D.尿素【答案】A【解析】【分析】内环境是由细胞外液构成的液体环境，是体内细胞生活的直接环境，主要包括血浆、组织液、淋巴。
存在于血浆、组织液、淋巴中的成分均属于内环境的成分。
内环境的成分一般包括：营养物质（水、无机盐、葡萄糖、氨基酸等）、代谢废物（二氧化碳、尿素等）、调节物质（激素、抗体、递质等）、其他物质（纤维蛋白原等）。
【详解】A、DNA聚合酶位于细胞内，不会在内环境中出现，A符合题意；B、胆固醇属于营养物质，可存在于血浆中，会在内环境中出现，B不符合题意；C、葡萄糖属于营养物质，可存在于血浆中，会在内环境中出现，C不符合题意；D、尿素属于代谢废物，可存在于血浆中，会在内环境中出现，D不符合题意。
故选A。
2.艾滋病是由于感染人类免疫缺陷病毒（HIV）而引起的严重的免疫缺乏病，下列叙述正确的是（）A.HIV通过识别并结合辅助性T细胞表面的相应受体，进入细胞B.HIV最初侵入人体时，即可在人体细胞中大量繁殖C.HIV的RNA在宿主细胞提供的逆转录酶的作用下形成互补的DNAD.HIV可通过性接触和握手等途径传播，应避免不必要的身体接触【答案】A【解析】【分析】免疫缺陷病是指由于机体免疫功能不足或缺乏而引起疾病。
一类是由于遗传而使机体生来就有的先天性免疫缺陷病；一类是由于疾病和其他因素引起的获得性免疫缺陷病，如艾滋病。
猪肝过氧化氢酶提取条件及应用研究
猪肝过氧化氢酶提取条件及应用研究研究过氧化氢酶是一种重要的酶类，在医药、制浆造纸、食品、环境等领域有着广泛的应用。
猪肝过氧化氢酶是一种高效的过氧化氢降解酶，具有较高的催化效率和稳定性。
因此，研究猪肝过氧化氢酶的提取条件及应用具有重要的理论和应用价值。
提取条件实验材料猪肝组织、磷酸盐缓冲液(pH 7.0)、甲醇、乙腈、丙酮、氮气、色谱柱实验过程1.猪肝切片，并在冰上磨成细粉2.加入10倍磷酸盐缓冲液，充分振荡，浸泡10分钟3.离心15分钟，取上清液4.将上清液慢慢加入氮气中，使其脱除氧气5.在氮气的保护下，加入甲醇、乙腈、丙酮等有机溶剂，使沉淀物稳定6.沉淀物加入色谱柱进行分离纯化结果分析通过实验，发现在磷酸盐缓冲液(pH 7.0)条件下，甲醇、乙腈、丙酮等有机溶剂可以有效地提取出猪肝过氧化氢酶，并通过色谱柱的分离纯化，可以得到较纯的过氧化氢酶。
应用研究抗菌性研究研究人员采用实验室常见的二氧化氯消毒方法，对不同浓度的猪肝过氧化氢酶溶液进行试验。
实验结果表明，猪肝过氧化氢酶具有一定的抑菌效果，当浓度为5mg/mL时，对大肠杆菌的抑菌率达到了50%以上。
应用于纤维素酶系统的增强猪肝过氧化氢酶可以通过氧化作用增强纤维素酶的催化效果，提高纤维素的降解效率。
实验结果表明，将0.2%的猪肝过氧化氢酶与0.5%纤维素酶混合使用，可以使纤维素的降解率提高25%以上。
应用于食品添加剂猪肝过氧化氢酶可以在食品加工过程中作为添加剂，去除食品中的过氧化物，具有良好的保鲜效果。
实验结果表明，在生鲜果蔬中添加适量的猪肝过氧化氢酶后，可以将其保鲜时间延长3-5天。
猪肝过氧化氢酶是一种重要的酶类，在医药、制浆造纸、食品、环境等领域有着广泛的应用。
通过实验可以发现，在磷酸盐缓冲液(pH 7.0)条件下，甲醇、乙腈、丙酮等有机溶剂可以有效地提取出猪肝过氧化氢酶，同时发现该酶具有一定的抑菌效果、可以增强纤维素酶的催化效果、可以在食品加工过程中作为添加剂，去除食品中的过氧化物，具有良好的保鲜效果。
大肠杆菌质粒DNA的提取 (碱法)
10、将沉淀溶于20μl TE缓冲液或者灭菌水(pH8.0，含 20μg /ml RNaseA)中，储于-20℃冰箱中。
碱裂解法流程图
上清液 沉淀
对数期菌体
溶液I充分重悬
抽提
干燥溶解
酒精沉淀
溶液II裂解
质粒DNA溶液
离心洗涤 溶液III中和
五、注意事项——材料准备
使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒 增加）
分钟。
四、操作步骤
6、上清液（700μl左右）移入干净EP管中,加入等体积的 酚：氯仿：异戊醇(25:24:1), 振荡混匀,4℃下12000g离心 5min。 7、将水相（上清）（500μl左右）移入干净EP管中,加入2 倍体积的无水乙醇,振荡混匀后置于-20℃冰箱中15分钟， 然后4℃下12000g离心10分钟。 8、弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加 入1ml 70％乙醇洗沉淀一次。 9、吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥 10分钟或室温干燥。
培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢 失 尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应 加大菌体用量 菌株不要频繁转接（质粒丢失）
五、注意事项——细胞裂解
菌体量适当。 培养基去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮。 变性的时间不要过长（5分钟），否则质粒易被打断。 复性时间也不宜过长，否则会有基因组DNA的污染。 对于细胞壁较厚的菌（如酵母菌）质粒的提取，应先用 酶法或机械法处理，以破壁。
质粒能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细胞一些表型， 是比病毒更简单的原始生命。 质粒通过细菌的结合作用，从雄性体转移到雌性体， 是细菌有性繁殖的性因子. １９５２年由Lederburg正式命名为质粒。
生物工程研究生实验内容
⽣物⼯程研究⽣实验内容《⽣物⼯程综合实验》实验指导书张彩莹编写适⽤专业：2016级⽣物⼯程专业研究⽣⽣命科学与技术学院2016年10⽉前⾔随着⽣物技术的发展，⽣物⼯程的专业技术⼈员的需求更为迫切，特别是⽣物技术已经渗透到各个⾏业，并已蓬勃发展。
⽣物技术的发展不但要有深厚的理论基础，⽽且要求专业技术⼈员具有较强的动⼿能⼒。
由于该学科是⼀门实践性较强的科学，所以在培养⽣物⼯程专业学⽣时要特别注意学⽣实验能⼒的培养，尤其是专业基本操作。
本专业学⽣的实验课程已经包括⽣物化学实验、微⽣物实验、基因⼯程实验、细胞⼯程实验和发酵⼯程实验等基础课程实验。
这些实验为培养学⽣的基本操作能⼒、提⾼学⽣的实际动⼿能⼒等奠定了良好的基础，但是这些实验都是单个的⼩实验，各个实验各⾃为⼀体，没有系统地相互关联，所以学⽣完成实验后没有⼀个完整的概念。
本课程是在原有课程实验的基础上开设的综合性实验，放弃了原来单独⼩实验的结构，改为独⽴的⼤实验，增加了学⽣的设计性和主动性。
这些实验既注重和加强了原来各⾃的实验内容，⼜注意到相互联系，使学⽣有⼀个完整的操作过程，对理解⽣物⼯程技术有了进⼀步的认识。
根据教学计划的安排，本课程设置了两个综合实验：（1）DNA的分离提取及核酸电泳；（2）从⽣物组织中分离提取活性物质及鉴定。
以期通过这两个综合实验的完成，使同学们充分了解⽣物技术原理并熟练掌握⽣物活性物质分离、纯化与鉴定的常⽤⽅法。
涉及的⽅法有：溶剂提取法、酶活⼒测定、物质含量测定(分光光度法)。
本课程主要以学⽣⾃⼰动⼿操作为主，教师指导学⽣完成实验内容，使同学们在开放的实验环境下，充分发挥主观能动性，摸索试验条件，解决具体问题，培养应⽤基本理论去分析和解决实际问题的能⼒。
希望通过这些实验和探索，让同学们获得⽣物⼯程专业基本的实验技术训练，为今后独⽴从事科研和开展相关专业⼯作打下扎实的基础。
实验须知⽣物⼯程综合⼤实验教学是⽣物⼯程专业课程的重要组成部分，是使学⽣进⼀步理论联系实际，掌握⽣物⼯程专业学⽣所具备的基本操作技能，提⾼学⽣分析和解决问题能⼒，养成严密科学态度和良好⼯作作风必不可少的教学环节。
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大肠杆菌中质粒的小量提取及核酸电泳摘要：采用碱裂解法将大肠杆菌中的质粒DNA分子进行分离和纯化，将分离纯化后的质粒DNA分子进行琼脂糖凝胶电泳，并在紫外成像仪中观察DNA条带，以测定所得到的质粒DNA片段的分子量大小。
结果表明，成功从大肠杆菌中提取出质粒DNA分子，其分子量大小约为2000bp。
关键词：质粒DNA分子；碱裂解法；分子量；电泳引言质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子。
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。
在碱性电泳缓冲液中带负电荷，所以在外加电场作用下会向正极迁移。
将提取到的DNA 分子提取液中加入核酸染色剂，经过琼脂糖凝胶电泳后，利用紫外灯照射即可观察到所提取的DNA条带，第一泳道加入合适的Marker 与之进行比对，即可较为准确地估测出所提取出的质粒DNA分子量。
1 材料与方法1.1 实验材料(1) 含质粒Psd-T19的大肠杆菌(2) 试剂：细菌质粒小量提取试剂盒、琼脂糖，电泳缓冲液（TAE），核酸电泳上样缓冲液（6×），标准分子量的DNA等。
1.2 实验仪器微量移液器、试管、微波炉、离心机、电泳仪、凝胶成像系统、天平。
1.3 质粒的提取（小量试剂盒提取）(1) 首先取1.5ml混匀的菌液于1.5ml离心管中，台式离心机中12000r/m离心1min，弃上清液得到大肠杆菌菌体；(2) 按照试剂盒提取的步骤提取出大肠杆菌质粒DNA。
1.4 核酸电泳(1) 制备1%琼脂糖凝胶，并添加GoldVied I核酸染料；(2) 加样：在离心管中混合DNA样品2-3ul和1ul上样缓冲液。
采用梯度上样，上样量分别为2ul、4ul、6ul、8ul和5ulDNA分子量标记；(3) 电泳：120V，40min；(4) 观察：将电泳后的凝胶放置于透射紫外光下进行观察，对照分子量标记判断DNA样品的分子量大小。
2 实验结果与分析大肠杆菌在37℃恒温摇床中220r/min培养24h，离心收集菌液收集菌液，之后按照试剂盒的操作步骤进行质粒提取纯化，最后进行核酸电泳，电泳图如图1-1所示。
其中1,2,3,4分别代表质粒的上样量分别为2µL，4µL，6µL，,8µL，M代表5µL标准品。
DNA分子的分子量、分子构型的差异和所带电荷多少，都会影响电场中其迁移速率，另外琼脂糖凝胶的浓度、电压大小、缓冲液pH 和电泳时的温度等也影响迁移率，从而使DNA分子在凝胶中出现不同的区带。
如图1-1所示，从大肠杆菌中提取的质粒DNA分子的分子量大小为2000bp，梯度上样的对比结果表明最适上样量为6ul。
图1-1 1％核酸电泳图3结论所提取的质粒DNA分子量为2000kb，琼脂糖凝胶电泳最适上样量为6ul。
参考文献[1] 叶枫,董兴齐,彭何碧.四种提取细菌质粒DNA方法的比较[J].地方病通报,1994,9(4):66.[2] 黄永莲.琼脂糖凝胶电泳实验技术研究[J].湛江师范学院学报，2009，30(6):83-85.鸡肝中过氧化氢酶的提取、分离及检测摘要：为得到鸡肝中的过氧化氢酶，首先从肝中提取可溶性的蛋白质，并测定其蛋白质的含量和过氧化氢酶的活力；然后采用硫酸铵分级盐析及透析，并测定过氧化氢酶活力；最后采用SDS-凝胶电泳鉴定过氧化氢酶的纯度和测定其分子量。
选用考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量，利用分光光度计测定过氧化氢酶活力。
结果表明，纯化后过氧化氢酶的总活性是4774U，比活性是155.43 U/(mg.N)，回收率是34%，纯化倍数是4.88，考马斯亮蓝G-250染色法测定的蛋白质含量是15.41mg/ml，SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示蛋白质的相对分子质量是。
关键词：蛋白质含量；酶活力；盐析及透析引言过氧化氢酶（Catalase，CAT）是一种酶类清除剂，又称为触酶，是以铁卟啉为辅基的结合酶[1]。
其普遍存在于能呼吸的生物体内，主要存在于植物的叶绿体、线粒体、内质网、动物的肝和红细胞中，其酶促活性为机体提供了抗氧化防御机理[2]，其次过氧化氢酶的应用也十分广泛[3]。
CAT在不同的组织中其活性水平高低不同。
过氧化氢在肝脏中分解速度比在脑或心脏等器官快，就是因为肝中的CAT含量水平高[4]。
考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在465nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。
其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。
以牛血清白蛋白(BSA)为标准品配制浓度梯度标准液，用考马斯亮蓝G-250法进行吸光值的测定，作标准曲线，依据标准曲线推算样品中蛋白质含量[5]。
酶活力单位指每毫升样品在反应体系中每分钟催化1nmolH2O2 降解定义为一个酶活力单位。
过氧化氢酶检测试剂盒(Catalase Assay Kit)是一种简单易行的通过显色反应来检测细胞、组织或其它样品中过氧化氢酶(Catalase)活性的试剂盒。
过氧化氢酶的活性可以用紫外分光光度计测定A240，H2O2在240nm有特征吸收峰，CA T能够分解H2O2，使反应溶液240nm下的吸光度随反应时间而下降，根据吸光度的变化率可计算出CAT活性。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS，SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小[6]。
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
1材料与方法1.1 实验材料(1) 新鲜鸡肝、低分子量标准蛋白、透析袋。
(2) 试剂：硫酸铵、考马斯亮蓝G-250、牛血清白蛋白标准液、过氧化氢酶检测试剂盒、聚丙烯酰胺、SDS、TEMED、4%浓缩胶、12%分离胶、样品缓冲液、染色液、脱色液、电泳缓冲液。
1.2 实验仪器可见分光光度计、研钵、冷冻离心机、电泳仪、垂直板电泳装置。
1.3水浸提法提取过氧化氢酶(1) 肝脏研磨液的制取；(2) 水浸提法提取过氧化氢酶按研磨液与水的体积比为1:5计算，加入相应体积的样品提取缓冲液浸提，浸提温度为25℃，浸提时间为5 h左右。
4℃10000r/min离心20 min，得上清液备用；(3) 将上清液分为3份：一份用于测总蛋白含量及过氧化氢酶活性；一份保存冰箱中用于最后SDS-PAGE电泳；另取一份用于盐析、透析等。
1.4 过氧化氢酶粗酶液的分级盐析及透析(1) 将硫酸铵研磨成粉末加入粗酶液中，使达40%饱和度（使大部分杂蛋白沉淀），在电磁搅拌器上边搅拌边加入，然后置冰箱放置1～2h。
(2) 12000 r/min冷冻离心20min。
收集上清液S1（取部分上清液测总蛋白及酶活力）。
上清液中再加入硫酸铵使达80%饱和度，放置1h左右，12000r/min冷冻离心20min，收集上清液S2（取部分上清液测总蛋白及酶活力）。
(3) 将第二次离心的沉淀复溶于1/20原始体积的缓冲液中，装入透析袋中，用大量的此缓冲液在冰箱中进行透析过夜（4℃），其间更换缓冲溶液约3-4次，直至无白色沉淀析出为止（用BaCl2溶液检查）。
透析完毕后，将提取液保存于冰箱中备用，取部分提取液测总蛋白及酶活力，也留部分进行SDS电泳。
1.5 考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量1.5.1蛋白标准曲线的制作以蛋白质含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制牛血清蛋白含量标准曲线。
1.5.2样品测定取一支试管，加入末知浓度稀释20倍的蛋白质溶液1ml，考马斯亮蓝G250试剂5ml，放置5min后，在595nm波长下比色，记录A595nm。
对照标准曲线求得末知蛋白浓度。
1.6 过氧化氢酶活力的测定(1) 分光光度计预热30min，调节波长到240nm，蒸馏水调零。
(2) 测定前将CAT检测工作液25℃水浴10min。
(3) 加入10ul样本和190ul工作液，混匀5s并立即计时，记录240nm下初始吸光值A1和1min后的吸光值A2。
CAT（U/ml）=反应液总体积÷样本体积÷反应时间÷H2O2消光系数（43.6×10-3）×△A=459×△A1.7 SDS-PAGE电泳测定蛋白质相对分子质量(1) 配胶：4%浓缩胶、12%分离胶。
(2) 制备凝胶板：混合分离胶各组分，用移液管快速加入分离胶，大约5cm左右，之后加少许蒸馏水，静置至溶液聚合。
(3)加样样品在沸水中加热5min，去掉亚稳态聚合，上样量10ul。
(4) 电泳：开始电压恒定在70V，当进入分离胶后改为150V，溴酚蓝距凝胶边缘约1cm时，停止电泳。
(5) 凝胶板剥离与染色：取出凝胶板，加入染色液，染色30min 左右。
(6) 脱色：蒸馏水漂洗，脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰。
2实验结果与分析考马斯亮蓝G-250染色法测定的牛血清蛋白含量标准曲线方程为y=0.0062x+0.0072(R2=0.9985)，标准曲线图如图1所示。
图1牛血清蛋白含量测定标准曲线图表1酶液酶液总体积（ml）蛋白质（mg/ml）酶活性（U/ml）总活性（U）比活性[U/(mg.N)]回收率（%）纯化倍数粗酶液57 7.66 244 13912 31.85 100 1 上清S1 59 5.37 190 11210 35.38 81 1.11 上清S2 55 0.95 / / / / / 透析后11 15.41 2395 4774 155.43 34 4.883结论参考文献[1]刘昌玲,王国庆.细菌过氧化氢酶的分离结晶及性质[J].生物化学与生物物理进展,1900,17(5):380-383.[2]黄永洪,花慧,等.猪肝过氧化氢酶提取条件的研究[J].生物技术通讯,2005,16(1):40-42.[3]张坤生,田荟琳.过氧化氢酶的功能及研究[M].食品科技,2007,1:8-11.[4]刘冰,梁婵娟.生物过氧化氢酶研究进展[J].中国农学通报,2005,21(5):223-232.[5]王孝平,邢树礼.考马斯亮蓝法测定蛋白含量的研究[M].天津化工,2009,23(3):13-14.[6] 朱广廉,杨中汉. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量[M].植物生理学通讯,1982(2)：43-47.。