等电聚焦电泳(2020年整理).ppt
等电聚焦电泳Isoelectric Focusing Electrophoresis,IEFE
的缓冲能力； ④在pI处具有足够的电导，导电性均匀； ⑤两性电解质载体的数目要足够多； ⑥可溶性好； ⑦对280nm的紫外光没有或仅有很低的吸光度，
不干扰样品的测定。
2.载体两性电解质的合成
蛋白质分子的电聚焦过程
+ +
pH=pI
-
—
a
b
c
a.
蛋白质分子在负极端
b.
蛋白质分子在正极端
c.
蛋白质样品中各组分聚焦成区带
pI1 pI2
pI3 pIn
在这个从正极到负极pH逐渐增加的直流电 场中，当蛋白质进入这个环境，不同的蛋白质 带上不同性质和数量的电荷，向着一定方向移 动，迁移到与其相同的等电点位置上停留下来， 即被聚焦于一个狭的区带中 ，得以分离。
①有一个在电泳条件下基本稳定、重复性良好的 pH梯度
②有一个抗对流的电泳材料，使已经分离的样品 不再重新混合
③电泳后有适当的方法来鉴定分离的区带
（一）pH梯度的建立
用多种两性电解质(ampholytes)混合物建 立稳定良好的pH梯度
1.理想的载体两性电解质（Carrier ampholytes） 应具备的特征：
（一）优点
High Resolution High Sensitivity Good Reproduction
（二）缺点
1.要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋白质可能 发生沉淀。
2.样品中的成分必须停留在其pI，不适用在pI不 溶或发生变性的蛋白质。
分辨率(resolution)较不连续PAGE更高， 特别适合于分离分子量(molecuar weight,MW)相同而电荷(electric charge)不 同的生物大分子。
等电聚焦电泳
在电场下利用不同pH值缓冲溶液相互扩散，在混合区间 形成pH梯度，称人工pH梯度。但这种pH梯度易受缓冲溶 液离子的迁移和扩散而变动，重复性差，已不被采用。 利用温度梯度建立pH梯度。因为温度可以影响缓冲液的 解离度，从而使pH值改变。由于每差别一个pH单位温度 约50℃，故这种方法只能建立范围很窄的pH梯度，而且 不易稳定。
如果在电泳系统中建立一个由阳极至阴极，pH由 低到高（即环境由酸到碱）的连续而稳定的pH梯度， 则处于一个系统的各种蛋白质分子，将根据各自的pI 值与所处位点的PH值的差别带上正电或负电。
IEF的分类
载体两性电解质pH梯度(carrier ampholyte pH gradient) 等电聚焦，即在电场中通过两性缓冲离子建立pH梯度。 固相pH梯度(immobilized pH gradients,IPG)等电聚焦，是 利用一系列具有弱酸或弱碱性质的丙烯酰胺衍生物滴定时， 在滴定终点附近形成pH梯度并参与丙烯酰胺的共价聚合， 形成固定的、不随环境电场条件变化的pH梯度，分辨率 可达0.001pH。 载体两性电解质/固相pH梯度混合技术，即在固相pH梯度 凝胶中加入载体两性电解质作为添加剂，被称为“杂交等 电聚焦”。 固相pH梯度等电聚焦与载体两性电解质等电聚焦的 区别在于前者不是两性分子，在凝胶聚合时便形成pH梯 度.后者是两性分子，在电场中两性分子迁移到自己的等 电点而形成pH梯度。
加入附加物质建立pH梯度。通过把一些有机溶剂如乙醇、 甘油等加到缓冲液中，利用附加物的介电常数的变化，改 变了缓冲液一些组分的解离常数，可以形成1.5pH单位的 pH梯度。如在硼酸盐溶液中加0~5%甘油和0~3%蔗糖， 可以形成pH为7~8.6范围的梯度，可分离血红蛋白。 在电极间放入含多种不同等电点电解质的溶液，通电后在 电极间便会形成pH梯度。这些两性电解质大多是一些多 胺基多羧酸化合物。为了防止对流对pH梯度的干扰，可 以采用加入不同浓度的中性或惰性物质形成密度梯度的方 法，也可以采用在电极间加入凝胶的方法。
《中国药典》2020版— 等电聚焦电泳法
0541电泳法
第六法等电聚焦电泳法
等电聚焦（ISOELECTRIC FOCUSING，IEF）电泳法是两性电解质在电泳场中形成一个 pH 梯度，由于蛋白质为两性化合物，其所带的电荷与介质的 pH 值有关，带电的蛋白质在电泳中向极性相反的方向迁移，当到达其等电点(此处的 pH 值使相应的蛋白质不再带电荷)时，电流达到最小，不再移动，从而达到检测蛋白质和多肽类供试品等电点的电泳方法。
本法用于蛋白质的定性鉴别、等电点测定、限度检查以及定量测定。
方法 1：垂直板电泳法
除各论中另有规定外，按以下方法测定。
1.仪器装置
恒压或恒流电源、带有冷却装置的垂直板电泳槽和制胶模具。
2.试剂
(1)水(电阻率不低于 18.2MΩ•cm)。
(2)A 液称取丙烯酰胺29.1g、亚甲基双丙烯酰胺0.9g，加适量水溶解，并稀释至 100ml，双层滤纸滤过，避光保存。
(3)B 液10%过硫酸铵溶液，临用前配制。
(4)供试品缓冲液(4 倍浓度) 取甘油8ml、40%两性电解质(pH3〜10)溶
1。
等电聚焦电泳【共54张PPT】
蛋白质分子的电聚焦过程
+
+
pH=pI
-
—
a
b
pI1 pI2 pI3
pIn
c
a. 蛋白质分子在负极端 b. 蛋白质分子在正极端
c. 蛋白质样品中各组分聚焦成区带
在这个从正极到负极pH逐渐增加的 直流电场中，当蛋白质进入这个环境， 不同的蛋白质带上不同性质和数量的电 荷，向着一定方向移动，迁移到与其相 同的等电点位置上停留下来，即被聚焦 于一个狭的区带中 ，得以分离。
进行IEFE必须具备3个条件：
①有一个在电泳条件下基本稳定、重复 性良好的pH梯度
②有一个抗对流的电泳材料，使已经分 离的样品不再重新混合
③电泳后有适当的方法来鉴定分离的区 带
（一）pH梯度的建立
用多种两性电解质混合物建立稳定 良好的pH梯度
1.理想的载体两性电解质（Carrier ampholytes）应具备的特征：
等电点聚焦的分离容量受下列几个因素影响：
1、聚焦后每一区带的蛋白量取决于密度梯 度所能支持的蛋白质，提高密度可以提 高分离容量；
2、容量与区带高度的平方成正比，降低电 压可使区带变宽，提高容量，但分辨率
降低，聚焦时间长，用窄的pH梯度范围 可以使区带变宽，提高分辨率。 3、分离的容量与柱的横载面成正比，用440 毫克柱时，可加粗蛋白质5克，每一区带 可达一克。
-
a
由于载体两性电解质是一系列不同
分子的两性电解质的混合物所组成的， 设 其 中 某 一 成 分 为 A， 它 的 pI=pH’， 当 环境中的pH>pH’时，它带负电荷，朝正 极移动。(图b)
pH
ApH=pH’
+
-
b
电泳技术(共21张PPT)
优点：分辨率高，区带清晰、窄，加样部位自由，重现性好，可测定P或多肽的等电点。
蛋白：溴酚兰、氨黑10B、偶氮胭脂红B 根据要分离物质的相对分子质量选择合适的单体浓度。
机械强度好，透明有弹性，稳定，无吸附作用和电渗作用，可制成不同孔径的凝胶。
第4页，共21页。
2 滤纸的选择与处理 层析用滤纸，纸宽2～3cm/样品组分，长短影响电场强度。
3 点样
分1 电离泳胶：：带小电孔粒径点子，在p圆H电8场.点中向（着与量其本少身电）荷相、反的点电极条移动状的过（程。一般），点中间（未知样品）、 点一边（已知样品） 点圆点（量少）、点条状（一般），点中间（未知样品）、点一边（已知样品）
凝胶（如聚丙烯酰胺凝胶） 4 操作要点
pH梯度支持介质的制备
聚焦电泳 检测 两性电解质载体的除去
第20页，共21页。
电泳技术思考题
1名词解释
电泳、电泳分离技术、泳动度、电渗、区带电泳、 相对迁移率、不连续凝胶电泳
2 影响泳动度的主要因素有哪些？
3 区带电泳的操作步骤一般有哪些？
4 如何制备聚丙烯酰胺凝胶？
CH2(NH2)COOH → (样品胶、浓缩胶pH6.7~6.8） →
CH2(NH2)COO－（0.1％～1.0％）泳动速度最慢（慢离子） 蛋白质（P）泳动速度介于快慢离子之间 电泳时， Cl －超过P走在最前面，其后形成一个离子浓度较
低的低电导区→较高电位梯度→P和慢离子加速移动→P 压缩成层
Aa：茚三酮、靛红
干法、湿法 分类：垂直管型盘状电泳、垂直板型电泳；
1 电泳：带电粒子在电场中向着与其本身电荷相反的电极移动的过程。
等电聚焦电泳的原理和应用
等电聚焦电泳的原理和应用1. 原理等电聚焦电泳是一种基于蛋白质等电点（pI）差异的分析方法。
在等电聚焦电泳中，蛋白质被置于一个电荷梯度进行分离，直到达到其等电点时停止运动。
原理可分为以下几个步骤：1.1 准备电荷梯度电荷梯度是等电聚焦电泳中的关键。
通常使用聚丙烯酰胺凝胶，其中有两个极性的电解质进行稀释，创建一个pH梯度。
这个梯度会在凝胶中生成氢离子（H+）和氢氧根离子（OH-）。
1.2 样品加载样品通常会混合在一种称为“载体溶胶”的缓冲液中，以保持样品的pH稳定。
这些样品会在载体溶胶上浮，准备好进行电泳分离。
1.3 离子迁移一旦样品加载完成，电泳过程就开始了。
在电场的作用下，蛋白质在电荷梯度中迁移。
1.4 等电点停止当蛋白质在凝胶中达到其等电点时，它们的净电荷为零，停止迁移。
等电点是蛋白质的理论中性点。
2. 应用等电聚焦电泳在生物医学和生物化学研究中具有广泛的应用。
以下是一些应用示例：2.1 蛋白质分离和纯化等电聚焦电泳常用于蛋白质的分离和纯化。
通过优化电荷梯度和其他实验条件，可以实现对复杂样品的高分辨率分离。
这种方法对于深入了解蛋白质的结构和功能非常有帮助。
2.2 蛋白质组学研究等电聚焦电泳在蛋白质组学研究中发挥重要作用。
通过等电聚焦电泳，可以分析和比较不同样品中蛋白质的表达水平。
这对于研究疾病相关蛋白质的变化以及寻找生物标志物非常重要。
2.3 药物分析等电聚焦电泳在药物分析中也有应用。
它可以用来研究药物-蛋白质相互作用和药物的释放动力学。
这对于药物的开发和优化具有重要意义。
2.4 食品分析等电聚焦电泳在食品分析中也得到了广泛应用。
它可以用来检测食品中的蛋白质含量和质量，包括检测过敏原和添加剂。
这对于食品质量和安全性的监测非常重要。
3. 结论等电聚焦电泳是一种基于蛋白质等电点差异的分析方法。
它在分离和纯化蛋白质、蛋白质组学研究、药物分析和食品分析等领域都有广泛的应用。
这种方法具有高分辨率和灵敏度，对于研究生物分子在不同条件下的特性具有重要意义。
电泳技术PPT课件2
医用检验技术及应用
电泳技术
第六节 免疫电泳
• 火箭免疫电泳(RIE)
图 6-16 Laurell 技术示意图及火箭免疫电泳图谱 Ag：抗原；1、2、3为待测标本；4、5、6为标准
医用检验技术及应用
电泳技术
第六节 免疫电泳
• 火箭免疫电泳(RIE)－－检验医学中的应用
– 火箭电泳放射自显影定量甲胎蛋白
医用检验技术及应用
电泳技术
第三节 SDS-PAGE电泳
• 检验医学中的应用－－非浓缩尿蛋白电泳
图 6-7 非浓缩尿蛋白电泳 示意图
医用检验技术及应用
电泳技术
第三节 SDS-PAGE电泳
• 检验医学中的应用－－非浓缩尿蛋白电泳
图 6-8 临床常见蛋白尿电泳图谱 左：肾小球性蛋白尿； 中：肾小管性蛋白尿，泳道4示混合性蛋白尿，肾小管性蛋白尿为主型； 右：混合型蛋白尿
电泳技术
第七节 高效毛细管电泳技术
• 基本原理
电渗流
蛋白泳动
－ 电流
+
检测器 －
缓冲液
温度控制器
+
电源
泳动
缓冲液
图 6-23 高效毛细管电泳原理图
医用检验技术及应用
电泳技术
第七节 高效毛细管电泳技术
• 高效毛细管电泳的分离模式
– 毛细管区带电泳 (capillary zone electrophoresis, CZE) – 毛细管凝胶电泳（capillary gel electrophoresis, CGE） – 胶束电动力学毛细管色谱（micellar electrokinetic capillary
医用检验技术及应用
电泳技术
第六节 免疫电泳
07实验七等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点
3．剥胶
电泳结束后，取下凝胶管，用蒸馏水洗净两端电极液，在 凝胶条的正极端作上标记。用灌满水的注射器长针头插入凝胶 与玻管管壁之间，边压水边慢慢转动玻管，推针前进，同时注 入水，靠水流压力和润滑力将玻璃管内壁与凝胶分开，凝胶条 即可流出。
4 .固定染色
取出凝胶条放在一块洁净的玻板上，用尺量出固定前的凝 胶条长度。放入带盖试管中加入固定液。固定20min2后，倒 掉固定液后用脱色液漂洗2次，再染色1h，用蒸馏水漂洗数次 后用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰，量出蛋白带距正极端 的距离。
计算出待测蛋白质聚焦部 位的实际长度后，直接从 pH梯度曲线上求出该蛋白 质等电点。
IEF-PAGE测定 蛋白质pI
五、思考题
(1)简述聚丙烯酰胺等电聚焦电泳的基本原理。 (2)进行聚丙烯酰胺等电聚焦电泳时的注意
事项有哪些？
• 有一类两性电解质：它具有依次递变而又相差不大 的等电点，在电场下形成递变而又连续的pH梯度， 故在电泳介质中加入这种物质则能造成介质pH由酸 到碱逐步变化。
等电聚焦原理：
利用：1)各种蛋白质pI不同
2）两性电解质载体在电场作用下，按各自pI形成从 阳极到阴极逐渐增加的连续而稳定的pH梯度
以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持介质，并在凝胶中加 入两性电解质载体，在电场作用下，蛋白质在此pH梯 度的凝胶中泳动，当迁移至pH值等于pI处时，就不再 泳动，而被浓缩成狭窄的区带。
(4)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，也无 变性作用，其化学组成不同于蛋白质。
三、实验试剂与仪器
1）两性电解质 2）30％丙烯酰胺溶液 3）TEMED 4）10％过硫酸铵溶液 5）负极缓冲液：0.1M NaOH 6) 正极缓冲液：0.1M 磷酸或硫酸 7) 固定液：10％（W/V）三氯乙酸 8) 染色液 9) 脱色液 10) 蛋白质等电点标准 11) 电泳仪 12) 圆盘电泳槽
等电聚焦实验报告
1. 了解等电聚焦电泳（IEF）的基本原理和操作步骤。
2. 学习利用等电聚焦电泳技术测定蛋白质的等电点（pI）。
3. 掌握实验操作技能，提高实验动手能力。
二、实验原理等电聚焦电泳（IEF）是一种利用pH梯度介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。
其基本原理是在一个具有pH梯度的介质中，蛋白质分子根据其等电点在电场作用下向相应pH位置移动，直至聚焦于该位置。
蛋白质分子是两性电解质，其等电点（pI）是指蛋白质分子在溶液中呈电中性时的pH值。
在pH低于蛋白质的pI时，蛋白质分子带正电荷；在pH高于蛋白质的pI 时，蛋白质分子带负电荷。
在等电聚焦电泳过程中，当蛋白质分子移动到与其pI相等的pH位置时，其净电荷为零，停止移动，从而实现蛋白质的分离和聚焦。
三、实验仪器与试剂1. 仪器：毛细管电泳仪、恒温水浴、pH计、移液器、超纯水系统等。
2. 试剂：蛋白质样品、两性电解质载体、尿素、磷酸、氢氧化钠、乙酸等。
四、实验步骤1. 准备样品：取适量蛋白质样品，加入适量两性电解质载体，制成蛋白质溶液。
2. 制备pH梯度：根据蛋白质的pI值，配制相应的pH梯度介质，置于毛细管中。
3. 样品上样：将制备好的蛋白质溶液加入毛细管中，注意避免气泡产生。
4. 设置参数：根据仪器要求，设置电泳电压、温度、时间等参数。
5. 运行实验：开启毛细管电泳仪，开始电泳实验。
6. 数据采集：实验结束后，采集数据，分析蛋白质的等电点。
五、结果与分析1. 根据实验数据，绘制蛋白质的迁移曲线，分析其等电点。
2. 与理论值进行比较，评估实验结果的准确性。
1. 等电聚焦电泳是一种有效的蛋白质分离和鉴定技术，具有分辨率高、操作简便等优点。
2. 通过本次实验，掌握了等电聚焦电泳的操作步骤，提高了实验动手能力。
3. 在实验过程中，需要注意以下几点：a. 精确配制pH梯度介质，确保pH梯度均匀。
b. 避免气泡产生，影响实验结果。
c. 严格控制实验参数，确保实验结果的准确性。
制备型等电聚焦电泳
实验步骤
4、在电极槽中加入电解液。
实验步骤
5、聚焦
①首先将制冷装置上的旋钮旋开。 ②将聚焦装置放入仪器底盘，聚焦槽上样口端和电极通气口端 向上。核实阳极端在左，阴极端在右。 ③用注射器向电极中加入电解液 ④加盖制冷装置盖子，并旋紧螺杆。 ⑤加盖仪器盖子 ⑥连接micro rotofor 分离器底盘后电源线和电源插座 ⑦连接micro rotofor 分离器到真空装置。 ⑧将振荡装置 ⑨根据实验需要将制冷开关设置到10或20 ℃ ⑩通过观察电压的变化过程，可以指示聚焦是否完成。
其它辅助设备及附件
辅助设备：电源
真空泵、真空阀、真空管
电解液用于平衡离子交换膜：0.1MH3PO4、 0.1MNaOH
20µl，100µl，1000µl 移液器，移液器头，50ml烧杯
附件：密封带
在运行过程中，密封带用于密封载样和收集端口。
密封膜 用于分离后承载样品组份的收集盘 3ml注射器 使用3ml注射器将样品加入到聚焦槽中 10ml注射器 使用10ml注射器将样品加入到电极槽中 镊子、清洁刷
器振荡时，容易松动，产生泄漏现象。
②用载样注射器吸取样品溶液，从位于聚焦槽中央的载样口上样，至样品 溶液全部均匀渗漏到各个腔体内；或者采用在不同载样口上样，至样品 溶液在聚焦槽各个腔体分布均匀。（注意:在上样过程中注意不要产生气 泡，否则样品溶液在各个腔体内分布不均匀。如果出现气泡，可以将样 品吸出，从另外的载样口上样，注意同样不能产生气泡。 ③加载样品后，核实每一个聚焦体腔内是否充满样品溶液，并保证无气泡 。如果存在气泡，将影响后续的分离，因此请按上步措施进行处理。 ④擦干聚焦槽外部，用密封带将上样口密封。不要使用过长或过宽的密封 带，否则在仪器振荡时，容易松动，产生泄漏现象。
等电聚焦电泳
等电聚焦的基本原理
这就是等电聚焦电泳分离蛋白质的基 本原理。可见在该方法中，等电点是蛋 白质组分的特性量度，将等电点不同的 蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质 中，在电场内经过一定时间后，各组分 将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置 上，形成分离的蛋白质区带。
相等时,此时溶液的pH就是这种氨基酸的等电点(pI).
蛋白质是由氨基酸组成的,除了有末端-NH3+和末端COO-外,参与其组成的氨基酸残基侧链上还有酸、碱
性基团,因此蛋白质是两性物质,也有等电点.
等电聚焦的基本原理
不同的蛋白质或其他两性电解质具有不同 的等电点。如果某种蛋白质处于大于其等电点 的pH环境中，则带负电，在电场中必向正极泳 动；反之，当某种蛋白质处于小于其等电点的 pH环境中，则带正电，在电场中向负极泳动。
不同品牌的载体两性电解质性质上有细 微的差别，使用不同来源的载体两性电解 质凝胶时候蛋白质分离样式略有差异，若 要获得最好的重复性一般不要更换载体两 性电解质的品牌。
电泳仪-AE6541
电泳仪-伯乐bio-rad
电泳仪--实验室
电泳槽--DYCP32型
等电聚焦电泳分离蛋白质
一、仪器与试剂
1．仪 器： JY5000电泳仪、DYCP32型电泳槽 2．试 剂：蛋白质样品、载体两性电解质、
载体两性电解质
两性电解质，是脂肪族多胺和多羧类 的同系物，他们具有相近但不同的pKa 和pI值。在外电场作用下，自然形成pH 梯度，是一种特殊的缓冲液。
《中国药典》2020版—等电聚焦电泳法国家药品标准公示稿
0541电泳法第六法等电聚焦电泳法等电聚焦电泳法是两性电解质在电泳场中形成一个 pH 梯度，由于蛋白质为两性化合物，其所带的电荷与介质的 pH 值有关，带电的蛋白质在电泳中向极性相反的方向迁移，当到达其等电点(此处的 pH 值使相应的蛋白质不再带电荷)时，电流达到最小，不再移动，从而达到检测蛋白质和多肽类供试品等电点的电泳方法。
本法适用于蛋白质的定性鉴别、等电点测定、限度检查以及定量测定。
方法 1：垂直板电泳法除各论中另有规定外，按以下方法测定。
1.仪器装置恒压或恒流电源、带有冷却装置的垂直板电泳槽和制胶模具。
2.试剂(1)水(电阻率不低于18.2MΩ•cm)。
(2)A 液称取丙烯酰胺29.1g、亚甲基双丙烯酰胺0.9g，加适量水溶解，并稀释至 100ml，双层滤纸滤过，避光保存。
(3)B 液10%过硫酸铵溶液，临用前配制。
(4)供试品缓冲液(4 倍浓度) 取甘油8ml、40%两性电解质(pH3〜10)溶液 4ml，加水至 20ml。
加 0.1%甲基红溶液20μl。
(5)pI 标准商品化试剂，所选用的pI 标准的等电点范围一般应涵盖供试品的等电点。
(6)固定液称取三氯乙酸34.5g、磺基水杨酸10.4g, 加水溶解并稀释至300ml。
(7)脱色液(平衡液) 取 95%乙醇 500ml、冰醋酸 160ml，加水稀释至2000ml。
(8)染色液称取考马斯亮蓝G250(或R250)0.35g，加脱色液300ml，在60〜70℃水浴中加热，使溶解。
(9)保存液取甘油30ml，加脱色液300ml，混匀。
(10)正极液(0.01mol/L 磷酸溶液) 取磷酸1ml，加水至1800ml。
(11)负极液(0.01mol/L 氢氧化钠溶液) 称取氢氧化钠0.4g，加水溶解并稀释至1000ml。
3.测定法(1)制胶装好垂直平板电泳槽，压水，于玻璃板和玻璃纸之间加入 60% 甘油 1ml。
取水 12ml、甘油 2ml、A 液 4.0ml、两性电解质(pH3〜10)溶液( 或其他两性电解质 )1.0ml, 混匀，脱气，再加 B 液 72 μl，N,N,N’,N’-四甲基乙二胺3μl，混匀后注入槽内聚合，插入样品梳，注意避免气泡出现。
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NH3+ P
COOH
NH3+ P
COO-
NH2 P
COO-
pH＜pI
pH＝pI
pH＞ pI
在电泳介质中放入载体两性电解 质，当通入直流电时，两性电解质 形成一个由正极到负极逐渐增加的 pH梯度，正极附近是低pH区，负 极附近是高pH区。
蛋白质分子的电聚焦过程
+
+
pH=pI
-
—
a
b
pI1 pI2 pI3 pIn
pH梯度的选择
在测定未知蛋白时，可先采用 pH3-10的载体，经初步测定后改用 较窄的以提高分辨率。
（二）支持介质的选择
作用：防止扩散 抗对流
1.液体介质：蔗糖、Ficoll 2.凝胶介质：琼脂糖，葡聚糖、PAG
（三）聚焦后的检测方法
1.各种染色法
考马斯亮蓝染色 银染色 同工酶染色 专一蛋白染色 荧光标记以及免疫方法
pH
+
-
a
由于载体两性电解质是一系列不同
分子的两性电解质的混合物所组成的， 设 其 中 某 一 成 分 为 A， 它 的 pI=pH’， 当 环境中的pH>pH’时，它带负电荷，朝正 极移动。(图b)
pH
ApH=pH’
+
-
b
当环境pI<pH’时，它带正电荷，朝 负极移动，直至移动到它的等点电处， 在那里聚集。由于两性电解质A在它的pI 处具有一定的缓冲能力，因此在它附近 形成一个pH稳定区域。（图c）
办法将分别在阳、阴极之间到达它们自己的位 置而给出一个pI梯度。
电解槽中，通电后，正负两极都会发生电
极反应：
正极端反应：6H2O→O2+4H3O++4e负极端反应：4H2O+4e-→2H2+4OH-
在负极引起H值的升高，在正极pH 下降，另外在电极槽的正极端放的是酸 性溶液，负极端放的是碱性溶液造成了 在电极附近pH的急剧变化。（图a）
的缓冲能力； ④在pI处具有足够的电导，导电性均匀； ⑤两性电解质载体的数目要足够多； ⑥可溶性好； ⑦对280nm的紫外光没有或仅有很低的吸光度，
不干扰样品的测定。
2.载体两性电解质的合成
加成反应
丙烯酸+多乙烯多胺
Ampholine（LKB）
本质：一系列脂肪族多氨基多羧酸同系物 和异构体，具有很多既不相同又十分接 近相互连接的pI值。
2.电泳区带相当狭窄。 3.重复性好。
（二）缺点
1.要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋 白质可能发生沉淀。
2.样品中的成分必须停留在其pI，不适用 在pI不溶或发生变性的蛋白质。
分辨率较不连续PAGE更高，特别 适合于分离分子量相同而电荷不同 的生物大分子。
三、IEFE的基本原理
蛋白质分子在不同pH下的解离状态
c
a. 蛋白质分子在负极端 b. 蛋白质分子在正极端 c. 蛋白质样品中各组分聚焦成区带
在这个从正极到负极pH逐渐增加的 直流电场中，当蛋白质进入这个环境， 不同的蛋白质带上不同性质和数量的电 荷，向着一定方向移动，迁移到与其相 同的等电点位置上停留下来，即被聚焦 于一个狭的区带中 ，得以分离。
进行IEFE必须具备3个条件：
pH范围：pH3~10
3.pH梯度的形成
载体两性电解质是一系列不同分 子的两性电解质的混合物,在通电后， 它们各自迁移到适当位置形成一个 连续的pH梯度。
pH梯度形成的过程
㈠没通电时的变化
所有的载体两性电解质分子都荷电，只是溶 液中荷正电和荷负电的基团数目相等，净电荷 为零。
㈡引入电场时的变化
2.扫描与定量
激光光源强度大、单色性好，所以 对IEFE谱带的扫描最合适。 注意：操作程序和条件必须严格相同
3.其它检测方法
电泳转移 双相电泳 滴定曲线分析
蛋白质样品及分离容量
1、电聚焦有高的分辨力，一般样品不需提 纯，分析上可用来测定混合物中某一成 分的相对比例。
2、大量提纯蛋白质，则应预先初步提纯。 有些物质（如核酸）聚焦时会沉淀，应 预先除去。
解质即形成一个由阳极到阴极逐步增加 的pH梯度，在此体系中，不同的蛋白质 即移动到或聚焦于其相当的等电点位置 上，也就是说被聚焦于一个狭的区带中， 电泳技术中的等电点聚焦也称为聚焦电 泳。
二、IEFE的特点
（一）优点
1.分辨率高（精密度可达0.01pH单位）， 灵敏度高（最低检出量达0.1ng）。
载体两性电解质分子将向阴极或阳极迁移， 带有最低等电点的分子（荷最多的负电）将最 快地向阳极迁移。当它达到净电荷是零的位置 时才停止。
其次一些低pI的载体两性电解质分子（荷其 次多的负电）也将向阳极移动，直到它的净电 荷被减少到零才停止。
㈢电泳结束后的变化 所有的载体两性电解质分子以增加pI级数的
3、蛋白质应不含盐，因盐浓度高电流大， 易发热，而且盐离子迁移至两极产生酸 碱，占据了分离的有效部位。
等电点聚焦的分离容量受下列几个因素影响：
1、聚焦后每一区带的蛋白量取决于密度梯 度所能支持的蛋白质，提高密度可以提 高分离容量；
2、容量与区带高度的平方成正比，降低电 压可使区带变宽，提高容量，但分辨率 降低，聚焦时间长，用窄的pH梯度范围 可以使区带变宽，提高分辨率。
等电聚焦电泳
Isoelectric Focusing Electrophoresis，IEFE
一、IEFE 定义
IEFE一种利用具有pH梯度的 支持介质分离等点电不同的蛋白 质的电泳技术。
各种蛋白质各自都有一个等电点,在一 特殊的pH环境中,蛋白质分子呈电中性, 在电场中不会迁移。
等电聚焦就是在电泳介质中放入载体 两性电解质，当通以直流电时，两性电
pH
pH=pH’
A+
+
-
c
同样载体两性电解质中各种两性电
解质也会各自迁移到它们的等电点处， 由于它们的数量足够多，各自的等电点 相差很小，从而形成一个pH梯度。（图 d）
pH
+
-
d
假设在一个系统中含有极多的有 适当的等电点和它的等电点处有一 定的缓冲能力的两性电解质，因此 形成的pH梯度将是连续平滑的。
①有一个在电泳条件下基本稳定、重 复性良好的pH梯度
②有一个抗对流的电泳材料，使已经 分离的样品不再重新混合
③电泳后有适当的方法来鉴定分离的 区带
（一）pH梯度的建立
用多种两性电解质混合物建立稳定 良好的pH梯度
1.理想的载体两性电解质（Carrier ampholytes）应具备的特征：
①分子量要小，以便与被分离大分子物质分离； ②化学性质稳定； ③各成分的pI彼此接近，并在其pI值附近有良好