《菌种的管理和保藏》PPT幻灯片
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菌种的管理和保藏
4～6℃
芽孢菌3～6个月，其他 细菌约1个月
酵母菌 霉菌琼脂或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂 斜面培养基
4～6℃
一般3～6个月
真菌 PDA琼脂或改良马丁琼脂斜面培养基
4～6℃
一般3～6个月
2019/12/21
13
液体冷冻保藏法
菌种
保存液（2mL）
保存温度 保存时间
金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌
大肠埃希菌 乙型副伤寒沙门菌
铜绿假单孢杆菌 生孢梭菌
白色念珠菌 黑曲霉
营养肉汤
1%蛋白胨 甘油水
胆盐乳糖增菌液
疱肉培养基
改良马丁培养 基
10%～40% 甘油
-30～ -80℃
半年以上 或数十年
2019/12/21
14
液体冷冻保藏法
制备方法 1%蛋白胨1.5ml 加入甘油0.15ml ,接种新鲜培养物,培养. 保存条件 -80℃可保存数年.
2019/12/21
35
4 、菌悬液制备后应在2小时内使用，若保存在2～8℃的菌 悬液可以在24小时内使用。黑曲霉也可制成稳定的孢子悬 液保存在2～8℃，在验证过的贮存期内替代对应量的新鲜 孢子悬液使用。
2019/12/21
36
2019/12/21
37
菌种的保藏和管理
杜平华
2019/12/21
1
菌种保藏的重要性
菌种保藏是微生物学检验工作中的一项常规技 术，菌种的科学保藏和管理直接关系到检验结 果的正确性。
2019/12/21
2
菌种的来源
国内或国外认可的菌种收藏机构的 标准菌株，或使用与标准菌株所 有相关特性等效的商业派生菌株。
2019/12/21
菌种传代与保藏PPT
率和产品质量。
食品安全保障
通过菌种传代与保藏技术的优化， 保障食品生产和加工过程中的食品 安全。
环境保护
优化菌种传代与保藏技术，降低生 产过程中的环境污染，促进可持续 发展。
THANKS FOR WATCHING
感谢您的观看
04 菌种传代与保藏的未来发 展
菌种传代与保藏的技术创新
自动化技术
利用机器人和自动化设备 进行菌种传代与保藏，提 高工作效率和准确性。
基因编辑技术
通过基因编辑技术改良菌 种，提高其生产效率和适 应性。
生物反应器技术
利用生物反应器进行大规 模的菌种培养和保藏，实 现工业化生产。
菌种传代与保藏的科研进展
当菌种长到适宜大小时，可将其保存或进 行下一步实验，同时记录相关信息。
02 菌种保藏
菌种保藏的目的
01
02
03
长期保存菌种
通过保藏菌种，可以在长 时间内保持菌种的遗传稳 定性和活性，避免菌种衰 退或变异。
防止菌种丢失
对于具有重要应用价值的 菌种，通过保藏可以防止 意外丢失或遗忘。
维持菌种多样性
保藏多种类型的菌种，有 助于维持生物多样性，促 进微生物资源的保护和利 用。
新型保藏方法研究
研究更加高效、稳定的菌种保藏方法，如低温、真空、 干燥等。
菌种遗传稳定性研究
探究菌种在传代过程中的遗传稳定性，防止菌种变异 和退化。
菌种互作机制研究
研究不同菌种之间的互作机制，为菌种组合和优化提 供理论支持。
菌种传代与保藏的社会影响
工业生产变革
菌种传代与保藏技术的发展将推 动工业生产的变革，提高生产效
保存菌种
通过传代可以将菌种保存起来，以备将来使 用或进行研究。
食品安全保障
通过菌种传代与保藏技术的优化， 保障食品生产和加工过程中的食品 安全。
环境保护
优化菌种传代与保藏技术，降低生 产过程中的环境污染，促进可持续 发展。
THANKS FOR WATCHING
感谢您的观看
04 菌种传代与保藏的未来发 展
菌种传代与保藏的技术创新
自动化技术
利用机器人和自动化设备 进行菌种传代与保藏，提 高工作效率和准确性。
基因编辑技术
通过基因编辑技术改良菌 种，提高其生产效率和适 应性。
生物反应器技术
利用生物反应器进行大规 模的菌种培养和保藏，实 现工业化生产。
菌种传代与保藏的科研进展
当菌种长到适宜大小时，可将其保存或进 行下一步实验，同时记录相关信息。
02 菌种保藏
菌种保藏的目的
01
02
03
长期保存菌种
通过保藏菌种，可以在长 时间内保持菌种的遗传稳 定性和活性，避免菌种衰 退或变异。
防止菌种丢失
对于具有重要应用价值的 菌种，通过保藏可以防止 意外丢失或遗忘。
维持菌种多样性
保藏多种类型的菌种，有 助于维持生物多样性，促 进微生物资源的保护和利 用。
新型保藏方法研究
研究更加高效、稳定的菌种保藏方法，如低温、真空、 干燥等。
菌种遗传稳定性研究
探究菌种在传代过程中的遗传稳定性，防止菌种变异 和退化。
菌种互作机制研究
研究不同菌种之间的互作机制，为菌种组合和优化提 供理论支持。
菌种传代与保藏的社会影响
工业生产变革
菌种传代与保藏技术的发展将推 动工业生产的变革，提高生产效
保存菌种
通过传代可以将菌种保存起来，以备将来使 用或进行研究。
5菌种保藏的原理和方法ppt课件
氮菌、分枝杆菌、沙门氏菌、毛霉、根霉等。
5
（三）固体曲保藏法
适用菌种：产孢子的真菌 该法麸皮、大米、小米或麦粒等天然农产品为
产孢子培养基，使菌体产生大量的休眠体（孢 子）后加以保存。 注意：控制适当的水分。 保存期：1-3年
6
（四）沙土管干燥保藏法
原理：低温、寡营养 保藏期：4-5 ℃冰箱 保存期1-2年。 适用菌种：产孢子的丝状真菌和放线菌以及产
冻干燥对微生物引起的冻结损伤。 常采用脱脂牛奶或血清。 ③菌悬液制备：与保护剂混合，放在安瓿瓶内； ④冷冻干燥（用低温酒精或干冰（-15 ℃以下）使之速冻，
在低温下用真空泵抽干）
8 保藏期：将安瓿瓶熔封，低温4-5 ℃，保藏5-10年。
（五）真空冷冻干燥保藏法
影响保藏效果的因素: 菌种、菌龄和样品中的含水量。 适用菌种：适用于各种微生物。 特点：保藏期长、变异小、适用范围广，较理想保藏
养基营养成分、低温、干燥、隔氧及添加保护剂 等方法。
2
二、菌体曲保藏法 沙土管干燥保藏法 真空冷冻干燥保藏法 液氮保藏法 悬液保藏法 低温保藏法
3
（一）斜面保藏法
原理：低温 方法： 将培养好的斜面菌种，置于4-5℃冰箱保存，定
期移植到新的斜面培养基上继续保藏。 一般保存期3-6个月。 注意事项: 冰箱的温度； 培养基水分蒸发情况（用橡皮塞代替棉塞）。 优点：简便，适合于实验室中菌种的短期保藏。 缺点：短期内多次传代，易引起菌种变异、退化，染菌
几率增加。
4 适用菌种：细菌、放线菌、酵母、丝状真菌等短期保藏
（二）穿刺保藏法
原理：低温、缺氧 保藏期： 4-5℃冰箱 保存期6-12个月 适用菌种：各种好气性细菌 液体石蜡作用：防止培养基失水并隔绝氧气 液体石蜡保藏法 （在斜面菌种上加入灭菌后
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（三）固体曲保藏法
适用菌种：产孢子的真菌 该法麸皮、大米、小米或麦粒等天然农产品为
产孢子培养基，使菌体产生大量的休眠体（孢 子）后加以保存。 注意：控制适当的水分。 保存期：1-3年
6
（四）沙土管干燥保藏法
原理：低温、寡营养 保藏期：4-5 ℃冰箱 保存期1-2年。 适用菌种：产孢子的丝状真菌和放线菌以及产
冻干燥对微生物引起的冻结损伤。 常采用脱脂牛奶或血清。 ③菌悬液制备：与保护剂混合，放在安瓿瓶内； ④冷冻干燥（用低温酒精或干冰（-15 ℃以下）使之速冻，
在低温下用真空泵抽干）
8 保藏期：将安瓿瓶熔封，低温4-5 ℃，保藏5-10年。
（五）真空冷冻干燥保藏法
影响保藏效果的因素: 菌种、菌龄和样品中的含水量。 适用菌种：适用于各种微生物。 特点：保藏期长、变异小、适用范围广，较理想保藏
养基营养成分、低温、干燥、隔氧及添加保护剂 等方法。
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二、菌体曲保藏法 沙土管干燥保藏法 真空冷冻干燥保藏法 液氮保藏法 悬液保藏法 低温保藏法
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（一）斜面保藏法
原理：低温 方法： 将培养好的斜面菌种，置于4-5℃冰箱保存，定
期移植到新的斜面培养基上继续保藏。 一般保存期3-6个月。 注意事项: 冰箱的温度； 培养基水分蒸发情况（用橡皮塞代替棉塞）。 优点：简便，适合于实验室中菌种的短期保藏。 缺点：短期内多次传代，易引起菌种变异、退化，染菌
几率增加。
4 适用菌种：细菌、放线菌、酵母、丝状真菌等短期保藏
（二）穿刺保藏法
原理：低温、缺氧 保藏期： 4-5℃冰箱 保存期6-12个月 适用菌种：各种好气性细菌 液体石蜡作用：防止培养基失水并隔绝氧气 液体石蜡保藏法 （在斜面菌种上加入灭菌后
《菌种传代与保藏》课件
通过菌种鉴定和纯化，可以了解菌种的属性和特征，如形态、染色、生化反应等，以确定其分类地位 和用途。这有助于保证实验结果的准确性和可靠性。
去除杂菌和变异株
在菌种传代和保藏过程中，难免会混入杂菌或产生变异株。通过鉴定和纯化，可以去除这些杂菌和变 异株，保持菌种的纯度和一致性。这有助于保证实验的可重复性和结果的可靠性。
02 菌种传代技术
液体培养传代法
总结词
通过液体培养基进行菌种传代的方法
详细描述
将菌种接种到液体培养基中，经过一定时间的培养后，再进行菌种分离和纯化 ，用于后续的实验和研究。该方法操作简便，适用于大规模生产。
固体培养传代法
总结词
在固体培养基上进行菌种传代的方法
详细描述
将菌种接种到固体培养基表面，经过一定时间的培养后，形成菌落并进行纯化。 该方法常用于分离和鉴定微生物，能够较好地保持菌种的特性。
真空冷冻干燥保藏法
结合低温与干燥两种保藏方法，通过 真空冷冻干燥技术延长菌种存活时间 的方法。
将菌种在低温下进行真空处理，去除 水分，然后保存在干燥的环境中，这 种方法可以显著延长菌种存活时间， 并保持菌种的活性和稳定性。
液氮保藏法
通过将菌种保存在极低温度的液氮中，以延长菌种存活时间 的方法。
将菌种悬浮在液氮中，利用液氮的超低温特性（-196°C）来 延长菌种存活时间。这种方法可以长期保存菌种，但需要专 业的设备和操作技术，且成本较高。
03
及时发现并处理变异菌株
在菌种传代过程中，应密切关注菌种的生长和性状变化。一旦发现变异
菌株，应及时进行分离和鉴定，并采取相应的措施进行处理，以防止其
扩散和影响后续实验结果。
保持菌种的纯度和活性
定期进行菌种鉴定和纯化
去除杂菌和变异株
在菌种传代和保藏过程中，难免会混入杂菌或产生变异株。通过鉴定和纯化，可以去除这些杂菌和变 异株，保持菌种的纯度和一致性。这有助于保证实验的可重复性和结果的可靠性。
02 菌种传代技术
液体培养传代法
总结词
通过液体培养基进行菌种传代的方法
详细描述
将菌种接种到液体培养基中，经过一定时间的培养后，再进行菌种分离和纯化 ，用于后续的实验和研究。该方法操作简便，适用于大规模生产。
固体培养传代法
总结词
在固体培养基上进行菌种传代的方法
详细描述
将菌种接种到固体培养基表面，经过一定时间的培养后，形成菌落并进行纯化。 该方法常用于分离和鉴定微生物，能够较好地保持菌种的特性。
真空冷冻干燥保藏法
结合低温与干燥两种保藏方法，通过 真空冷冻干燥技术延长菌种存活时间 的方法。
将菌种在低温下进行真空处理，去除 水分，然后保存在干燥的环境中，这 种方法可以显著延长菌种存活时间， 并保持菌种的活性和稳定性。
液氮保藏法
通过将菌种保存在极低温度的液氮中，以延长菌种存活时间 的方法。
将菌种悬浮在液氮中，利用液氮的超低温特性（-196°C）来 延长菌种存活时间。这种方法可以长期保存菌种，但需要专 业的设备和操作技术，且成本较高。
03
及时发现并处理变异菌株
在菌种传代过程中，应密切关注菌种的生长和性状变化。一旦发现变异
菌株，应及时进行分离和鉴定，并采取相应的措施进行处理，以防止其
扩散和影响后续实验结果。
保持菌种的纯度和活性
定期进行菌种鉴定和纯化
《菌种的传代与保藏》课件
微生物菌种的保藏。
04
CATALOGUE
菌种传代与保藏的注意事项
防止菌种污染与变异
01
02
03
严格控制传代过程
在菌种传代过程中，应采 取无菌操作，避免污染。
选择适当的培养基
选择适当的培养基，以保 证菌种的正常生长和代谢 。
避免频繁传代
频繁传代会导致菌种变异 ，因此应合理控制传代次 数。
保持菌种遗传稳定性
通过菌种传代，可以持续获得相同特 性的菌株，为科学研究、产品开发、 质量控制等提供可靠的实验材料。
菌种保藏的原理与重要性
菌种保藏是长期保存菌种的有效方法，其原理在于创造不适宜菌种生长的环境条 件，使其处于休眠状态，从而延长菌种的保存期限。
菌种保藏对于保护生物多样性、防止菌种丢失、保障实验结果的可靠性等方面具 有重要意义。
尊重他人的知识产权，不得侵犯他 人的合法权益。
05
CATALOGUE
菌种传代与保藏的应用前景
在生物科学研究中的应用
要点一
基础生物学研究
菌种传代与保藏技术对于基础生物学研究至关重要，如微 生物分类学、进化生物学和生态学等。通过菌种传代与保 藏，科学家可以深入研究微生物的生理生化特性、基因组 学和蛋白质组学等，以揭示微生物生命活动的奥秘。
03
CATALOGUE
菌种的保藏技术
低温保藏法
总结词
一种常用的菌种保藏方法，通过降低温 度来降低菌种的代谢活性，延长菌种存 活时间。
VS
详细描述
将菌种保存在低温环境下，如冰箱的冷藏 室或冷冻室内，使菌种处于休眠状态，降 低其代谢活性，减少菌种变异和污染的机 会。适用于大多数微生物菌种的短期保藏 。
业的发展。
生物农药和生物肥料
04
CATALOGUE
菌种传代与保藏的注意事项
防止菌种污染与变异
01
02
03
严格控制传代过程
在菌种传代过程中，应采 取无菌操作，避免污染。
选择适当的培养基
选择适当的培养基，以保 证菌种的正常生长和代谢 。
避免频繁传代
频繁传代会导致菌种变异 ，因此应合理控制传代次 数。
保持菌种遗传稳定性
通过菌种传代，可以持续获得相同特 性的菌株，为科学研究、产品开发、 质量控制等提供可靠的实验材料。
菌种保藏的原理与重要性
菌种保藏是长期保存菌种的有效方法，其原理在于创造不适宜菌种生长的环境条 件，使其处于休眠状态，从而延长菌种的保存期限。
菌种保藏对于保护生物多样性、防止菌种丢失、保障实验结果的可靠性等方面具 有重要意义。
尊重他人的知识产权，不得侵犯他 人的合法权益。
05
CATALOGUE
菌种传代与保藏的应用前景
在生物科学研究中的应用
要点一
基础生物学研究
菌种传代与保藏技术对于基础生物学研究至关重要，如微 生物分类学、进化生物学和生态学等。通过菌种传代与保 藏，科学家可以深入研究微生物的生理生化特性、基因组 学和蛋白质组学等，以揭示微生物生命活动的奥秘。
03
CATALOGUE
菌种的保藏技术
低温保藏法
总结词
一种常用的菌种保藏方法，通过降低温 度来降低菌种的代谢活性，延长菌种存 活时间。
VS
详细描述
将菌种保存在低温环境下，如冰箱的冷藏 室或冷冻室内，使菌种处于休眠状态，降 低其代谢活性，减少菌种变异和污染的机 会。适用于大多数微生物菌种的短期保藏 。
业的发展。
生物农药和生物肥料
微生物菌种的保藏_PPT幻灯片
低温定期移植法：
• 把培养好的斜面菌种放在低温干燥处保存， 定期移植，一般3～6个月移植一次(视菌种 特征而定)。也可以用穿刺培养，定期移植 法保藏细菌，其效果也较好。
• 穿刺培养是将含0.6％～0.8％的琼脂培养 基装试管灭菌后直立冷凝后，用接种针尖 挑取少量菌体，垂直刺入琼脂培养基中心， 放在适当温度下培养，待菌长好后即可放 低温保存，此法较斜面保存有利，大肠杆 菌可保藏2年以上不发生明显变异。
• 甘油管保藏法：是利用微生物在甘油中 生长和代谢受到抑制的原理达到保藏目 的。其方法是，将40%的甘油高压蒸汽灭 菌待用。将培养好的斜面菌种用无菌种 用 无 菌 水 制 成 高 浓 度 的 菌 悬 液 (108 ～ 1010/ml)。取1ml灭菌甘油放入与甘油充 分混匀，使甘油浓度约为20%，于-20℃ 下冻存。
菌种菌种保藏
伤细胞。 在缓慢冷冻时，胞外基质一般较快结冰而 形成冰晶使基质浓度增高，造成细胞水分 外渗而大量脱水，可能使细胞死亡。如快 速降温，胞内也很快形成冰晶，胞内外渗 透压基本平衡，同时胞内冰晶较小，对细 胞及原生质膜的损伤也较小，菌株不易死 亡，影响也较小。
• 菌种是从事微生物学及生命科学研究的 基本材料.
• 微生物具有生命活力，在传代过程中易 发生变异甚至死亡，因此菌种保藏是一 项重要的基础工作，是微生物学基础工 作的一项重要内容，也是药品微生物工 作中的一项常用技术。
• 工业微生物菌种保藏，是要使菌 种生产能力和与生产工艺相适应 的优良性状保持稳定，当然做不 到绝对不变，只是力求把这种衰 退现象推迟减缓到最低限度。
常见微生物的菌种保藏及原理ppt课件
要使用菌种时,从液氮罐中取出安瓿瓶,并迅速放到35～40℃温 水中,使之冰冻熔化,以无菌操作打开安瓿瓶,移接到保藏前使用 的同一种培养基斜面上进行培养.从液氮罐中取出安瓿瓶时速度 要快,一般不超过1min,以防其他安瓿瓶升温而影响保藏质量.并 且取样时一定要戴专用手套以防止意外爆炸和冻伤
（三）、菌种保藏的方法
1、斜面低温保藏法 2、石蜡油封藏法 3、砂土管保藏法 4、麸皮保藏法 5、冷冻真空干燥保藏法 6、液氮超低温保藏法
1、斜面低温保藏法
将菌种接种在适宜的斜面培养基上,待菌种生长完全后,置于4℃ 左右的冰箱中保藏,每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面 培养基上,生长后继续保藏,如此连续不断.此法广泛适用于细菌、 放线菌、酵母菌和霉菌等大多数微生物菌种的短期保藏及不宜 用冷冻干燥保藏的菌种.放线菌、霉菌和有芽孢的细菌一般可保 存6个月左右,无芽孢的细菌可保存1个月左右,酵母菌可保存3个 月左右.如以橡皮塞代替棉塞,再用石蜡封口,置于4℃冰箱中保藏, 不仅能防止水分挥发、能隔氧,而且能防止棉塞受潮而污染.这 一改进可使菌种的保藏期延长.
该法的优点是简便易行,容易推广,存活率高,故科研和生产上对 经常使用的菌种大多采用这种保藏方法.其缺点是菌株仍有一定 程度的代谢活动能力,保藏期短,传代次数多,菌种较容易发生变 异和被污染.
2、石蜡油封藏法
此法是在无菌条件下,将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入 培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）上,石蜡油层高出 斜面顶端lcm,使用的液体石蜡要求优质无毒, 化学纯规格,其灭菌条件是：150～170℃烘箱内灭菌lh；或121℃ 高压蒸汽灭菌60～80min,再置于80℃的烘箱内烘干除去水分.
（一）、菌种保藏的目的
微生物在使用和传代过程中容易发生污染、变异甚 至死亡,因而常常造成菌种的衰退,并有可能使优良菌 种丢失.菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原 有性状和活力的稳定,确保菌种不死亡、不变异、不 被污染,以达到便于研究、交换和使用等诸方面的需 要.
（三）、菌种保藏的方法
1、斜面低温保藏法 2、石蜡油封藏法 3、砂土管保藏法 4、麸皮保藏法 5、冷冻真空干燥保藏法 6、液氮超低温保藏法
1、斜面低温保藏法
将菌种接种在适宜的斜面培养基上,待菌种生长完全后,置于4℃ 左右的冰箱中保藏,每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面 培养基上,生长后继续保藏,如此连续不断.此法广泛适用于细菌、 放线菌、酵母菌和霉菌等大多数微生物菌种的短期保藏及不宜 用冷冻干燥保藏的菌种.放线菌、霉菌和有芽孢的细菌一般可保 存6个月左右,无芽孢的细菌可保存1个月左右,酵母菌可保存3个 月左右.如以橡皮塞代替棉塞,再用石蜡封口,置于4℃冰箱中保藏, 不仅能防止水分挥发、能隔氧,而且能防止棉塞受潮而污染.这 一改进可使菌种的保藏期延长.
该法的优点是简便易行,容易推广,存活率高,故科研和生产上对 经常使用的菌种大多采用这种保藏方法.其缺点是菌株仍有一定 程度的代谢活动能力,保藏期短,传代次数多,菌种较容易发生变 异和被污染.
2、石蜡油封藏法
此法是在无菌条件下,将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入 培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）上,石蜡油层高出 斜面顶端lcm,使用的液体石蜡要求优质无毒, 化学纯规格,其灭菌条件是：150～170℃烘箱内灭菌lh；或121℃ 高压蒸汽灭菌60～80min,再置于80℃的烘箱内烘干除去水分.
（一）、菌种保藏的目的
微生物在使用和传代过程中容易发生污染、变异甚 至死亡,因而常常造成菌种的衰退,并有可能使优良菌 种丢失.菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原 有性状和活力的稳定,确保菌种不死亡、不变异、不 被污染,以达到便于研究、交换和使用等诸方面的需 要.
菌种的保藏PPT教学课件
▪ 此法适用于产孢子的霉菌和某些放线菌，保藏 期在1年以上。因操作简单、经济实惠，工厂较 多采用。
（五）甘油悬液保藏法
▪ 此法是将菌种悬浮在甘油蒸馏水中，置于低温下 保藏，本法较简便，但需置备低温冰箱。保藏温 度若采用－20℃，保藏期约为0.5～1年，而采用 －70℃，保藏期可达10年。
▪ 将拟保藏菌种对数期的培养液直接与经 121℃蒸汽灭菌20min的甘油混合，并使 甘油的终浓度在10％～15％，再分装于 小离心管中，置低温冰箱中保藏。
二、菌种的复壮
狭义的复壮－－消极的措施
是指在菌种已经发生衰退的情况下，通过纯 种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已 衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达 到恢复原菌株固有性状的相应措施。
广义的复壮－－积极的措施
是指在菌种的典型特征或生产性状尚未衰 退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性 状测定工作，以期从中选择到自发的正突变个 体。
一、菌种的衰退
▪ 菌种衰退（degeneration）是指由于 自发突变的结果，而使某物种原有的一系 列生物学性状发生量变或质变的现象。
纯菌种 自发突变 不纯菌种 传代增殖 衰退菌种
突变个体
原始个体
（一）菌种衰退的现象
菌落和细胞形态改变 生长速度缓慢，产孢子越来越少 代谢产物生产能力下降，即出现负突变 致病菌对宿主侵染能力下降 对外界不良条件的抵抗能力下降等
第八章 菌种的保藏
第一节 菌种的衰退和复壮
一、菌种的衰退 二、菌种的复壮
第二节 菌种的保藏
一、菌种保藏的目的 二、菌种保藏的原理 三、菌种保藏的方法
性状稳定的菌种是微生物工作最 重要的基本要求，否则生产或科研 都无法正常进行。
影响微生物菌种稳定性的因素： a）变异；b）污染；c）死亡
（五）甘油悬液保藏法
▪ 此法是将菌种悬浮在甘油蒸馏水中，置于低温下 保藏，本法较简便，但需置备低温冰箱。保藏温 度若采用－20℃，保藏期约为0.5～1年，而采用 －70℃，保藏期可达10年。
▪ 将拟保藏菌种对数期的培养液直接与经 121℃蒸汽灭菌20min的甘油混合，并使 甘油的终浓度在10％～15％，再分装于 小离心管中，置低温冰箱中保藏。
二、菌种的复壮
狭义的复壮－－消极的措施
是指在菌种已经发生衰退的情况下，通过纯 种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已 衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达 到恢复原菌株固有性状的相应措施。
广义的复壮－－积极的措施
是指在菌种的典型特征或生产性状尚未衰 退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性 状测定工作，以期从中选择到自发的正突变个 体。
一、菌种的衰退
▪ 菌种衰退（degeneration）是指由于 自发突变的结果，而使某物种原有的一系 列生物学性状发生量变或质变的现象。
纯菌种 自发突变 不纯菌种 传代增殖 衰退菌种
突变个体
原始个体
（一）菌种衰退的现象
菌落和细胞形态改变 生长速度缓慢，产孢子越来越少 代谢产物生产能力下降，即出现负突变 致病菌对宿主侵染能力下降 对外界不良条件的抵抗能力下降等
第八章 菌种的保藏
第一节 菌种的衰退和复壮
一、菌种的衰退 二、菌种的复壮
第二节 菌种的保藏
一、菌种保藏的目的 二、菌种保藏的原理 三、菌种保藏的方法
性状稳定的菌种是微生物工作最 重要的基本要求，否则生产或科研 都无法正常进行。
影响微生物菌种稳定性的因素： a）变异；b）污染；c）死亡
菌种的管理和保藏 PPT
常用菌种的保藏—2015指导原则
试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的冷冻干燥菌 种为第0代）。 采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。 冷冻保藏：在低温下保藏，一般在低于-30℃或-70℃，是有效的长期储藏方法。 冻干法保藏：是一种长期保藏菌种的方法法。 冷藏：在2～8℃保藏，是短期储藏方法。
鉴定方法
菌种的鉴定
传统方法 增菌→分离(纯菌)→确认试验(菌落形态、革兰染色、显微镜下菌体形态、 生化特性及血清学检查)。
依据 伯杰士细菌鉴定手册
重要的生化试验
氧化酶试验 革兰氏阴性菌、非发酵的棒状细菌+ 肠道菌-
过氧化氢酶试验 葡萄球菌+
链球菌-
凝固酶试验+ 葡萄球菌可能为致病菌
以上信息对大部分类型的生产环境中的微生物的调查及日常分析，已可提供足够的
协调案 ATCC NCIMB
NBRC CIP
美国标准菌种收藏中心 英国食品工业与海洋菌种保藏中心
日本技术评价研究所生物资源中心 法国巴斯德研究所菌种保藏中心
菌种保藏的中心任务
- 广泛收集。 - 选择最适宜的保藏方法，保持菌种的生物学特性。
常用菌种的保藏
菌种保藏的原则 根据微生物菌种的生理、生化特性，尽量降低微生物细胞的代谢 强度，处于休眠状态，以减低菌种的变异率。
菌种的管理和ห้องสมุดไป่ตู้藏
菌种保藏的重要性
菌种保藏是微生物检验工作中的一项常规技术 科学保藏和管理关系到检验结果的正确性.
菌种的—2015版指导原则
原则： 应来自认可的国内或国外菌种保藏机构的标准菌株，或使用与标准菌 株所有相关特性等效的商业派生菌株。
使用菌种来源
微生物菌种保藏ppt课件
(四）－80℃冰箱冻结法
将菌种悬浮于保护剂中，在－80℃冰箱中冻结保 存的一种长期菌种保藏方法。
准备冷冻 管
准备保护剂（10%-15%甘油) 准备菌悬液（细胞、孢子或芽孢悬液） 制备冷冻管（取菌悬液和保护剂至冷冻管）
保藏（-80℃，2～5年）
方法总结
使用比较方便； 保藏时间较长； 对设备要求高(-80℃冰箱)； 运输不方便。
灌注石蜡
液面高出斜面顶部1cm
保藏
4～6 ℃，干燥处； 直立放置； 保藏时间1 ～2年。
方法总结
操作简单，使用比较方便；
对设备要求不高，对人员操作水平有一定要求； 工作劳动强度大，保藏成本较高；
菌种易退化、污染。
(三)真空冷冻干燥法
指将保藏的菌种细胞或孢子悬浮于保护剂中，经 预冻后在真空条件下使水分升华，再经真空封存 后保存的一种长期菌种保存方法。 安瓿管，又叫安瓿瓶，简称安瓿，指装注射剂用 的密封的小玻璃瓶，用药时将瓶颈的上端弄破。
（五）液氮超低温冻结法
指悬浮于保护剂中的菌种经程控降温后，移置于 －196℃的液氮或－150℃左右的液氮气相中保存 的一种长期菌种保藏方法。
（二)液体石蜡法
亦称矿物油保藏法，定期移植保藏法的辅助方法。 指将菌种接种在适宜的斜面培养基上，最适条件 下培养至待得到健壮的菌体后注入灭菌的液体石 蜡，使其覆盖整个斜面，再直立放置于低温（4～ 6℃）干燥处进行保存的一种菌种保藏方法。
操作步骤：
液体石蜡预处理
斜面培养物制备
优质化学纯液体石蜡 灭菌： 121℃湿热灭菌30min，蒸发 水分； 160 ℃干热灭菌2h； 冷却至室温。
1、安瓿管的准备
清洗
选用中性玻璃材质的安瓿管； 2%盐酸浸泡8～10h，自来水冲洗至中性，蒸馏水冲洗2～3次； 置于烘箱中烘干。 棉塞 打棉塞，160℃定型2h； 标签 激光打印标签，标明菌株编号和保藏日期，大小约10×20mm。 喷码于安瓿管外，160℃固定20min。 灭菌 同一菌种安瓿管包在一起， 121 ℃湿热灭菌30min.
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培养后微生物的生长判断 固体培养基 液体培养基
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三、菌种的检查与复壮
菌种的衰退 菌种经过长期人工传代培养或保藏，由自发突变 的作用而引起某些优良特性变弱或消失的现象。 控制菌种的衰退方法 ⑴控制传代次数 尽量避免不必要的接种和传代， 降低突变几率。采用良好的传代保藏方法。《中 国药典》2010年版规定，传代次数不得超过5代。
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四、菌种的管理
1、使用菌种的单位，应具备从事微生物工作的 条件和设备。 菌种应由专人负责管理，管理人 员应具有微生物专业知识和技术水平，并应具有 较强的责任心。
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2、实验室必须建立菌种保存和使用文件化的程序管理
制度；
包括：每支菌种标注名称、标准号、接种日期、传代 次数、进出、收集、贮藏、保存、确认试验以及销毁 的记录、标准菌种的申购记录、从标准菌株到工作菌 株操作记录，如菌种定期转种传代，鉴定（纯度、特 性）、培养基和培养条件、菌种保存的位置和条件及 其它需要的程序。
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常用菌种保藏方法
标准菌株的复活或培养物的制备应按供应商 提供的说明或按验证的方法进行。 标准储备菌株-从国内、外菌种收藏机构获得 的标准菌株经复活并在适宜的培养基中生长后, 既为标准储备菌株。
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低温、干燥、缺氧、缺乏营养等环境条件都可 以抑制微生物的代谢和生长繁殖，因此低温、 干燥和真空是菌种保藏的重要手段。 标准储备菌株经纯度和特性确认后保存时，可 将培养物等份悬浮于抗冷冻的培养基中，并分 装于小瓶中,建议采用低温冷冻干燥，液氮储存， 超低温冷冻(低于-70℃)等方法保存。
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菌种保藏的重要性
菌种保藏是微生物学检验工作中的 一项常规技术，菌种的科学保藏和管 理直接关系到检验结果的正确性。
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菌种的来源
药品微生物检验用的试验菌应来自认 可的国内或国外菌种收藏机构的标准菌株， 或使用与标准菌株所有相关特性等效的商 业派生菌株。
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菌种保藏的中心任务
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低于-70℃或低温冷冻干燥可以延长菌种的保 存时间.标准储备菌株可用于制备每月或每周一 次转种的工作菌株。
冷冻菌株一旦解冻转种制备工作菌株后,不得 重新冷冻或再次使用。
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工作菌株不可代替标准菌株，标准菌株的商业 衍生物仅可用作工作菌株。
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1代是指将活的培养物接种到新鲜培养基中，任 何亚培养的形式均被认为是转种或传代一次。必要 时，实验室应对工作菌株的特性和纯度进行确认。
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细菌的接种、分离和培养 常用培养基种类 斜面培养基 半固体培养基。 液体培养基 平板培养基
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接种方法 涂布法 划线法 穿刺法 直接加入法等
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3 、菌种应冷藏或冷冻保存，保存菌种的冰箱不得 放置食品和易挥发性药品，放置菌种应有专用的冰 箱，应上锁管理。 4、由专人按操作规程和有关要求定期进行传代，并 定期对保存的菌种进行检查，一般每年1～2次， （或定期更换冻干菌种）。发现菌种的异常情况应 及时检查。一旦发现菌种污染和变异现象，应立即 报告、研究处理。尤其长期保存时。
⒈广泛收集各种有用的微生物菌种。 ⒉选择最适宜的保藏方法。 ⒊研究、检验、交换和使用。
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国外的菌种保藏机构
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常用菌种保藏方法
菌种保藏的原则
根据微生物菌种的生理、生化特性，在人工 创造的条件下尽量降低微生物细胞的代谢强 度，使细胞基本上处于休眠状态，生长繁殖 受到抑制但不至于死亡，以减低菌种的变异 率。
菌种的保藏和管理
杜平华
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前言
试验过程中，生物样本可能是最敏感的，因 为它们的活性和特性依赖于合适的试验操作和 贮藏条件。实验室菌种的处理和保藏的程序应 标准化，使尽可能减少菌种污染和生长特性的 改变。
按统一操作程序制备的菌株是微生物试验结 果一致性的重要保证。
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详细记录
菌种的来源、接收、传代、分离、复壮、使用 和鉴定等均应做好详细记录。包括菌保存位置、 环境(温度)、种传代或使用时间、名称、菌号、 代数、传代或保存形式、分离、复壮方式、使 用内容、鉴定情况等都应进行详细的记录。
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菌种不得随意带出实验室，外单位索取、购买 应有证明和登记，并包装严密。 菌种处理应严格按操作规程进行，灭菌处理应 有详细记录。
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菌悬液的制备与保存
菌悬液的制备与保存 参照《中国药典》2010版培养基适用性 试验。
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⑵创造适宜的培养条件 ⑶用不同类型的细胞进行传代 ⑷采用有效的保藏方法
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定期检查
主要检查项目 菌落形态、革兰染色、显微镜下菌体形
态、生化特性及血清学检查。
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菌种的复壮 使衰退的菌种重新恢复原来的优良特性的 过 程验室主要采用分离纯化的方法。
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不同的微生物，应根据其生物特征来选择最适 宜的保藏方法，菌种的保藏方法一般分四个阶 段：
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⑴ 挑选特征典型的纯菌菌落。 ⑵确定保藏的合适菌体。 ⑶选择最适宜的方法保藏。 ⑷定期对保藏的菌种进行检查。
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二、菌种的传代和使用
工作菌种的传代次数应严格控制，不得超过5代， （从菌种保藏中心获得的标准菌株为第0代）防止 过度的传代造成菌种变异。
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分离：为了获得纯菌种（株），采用的 将细菌分离成单个细胞，使其独立分裂繁 殖形成单个菌落的操作技术。
分离一般采用平板培养基。
分离方法主要有分段划线法、连续划线法、 涂布分离法、倾注分离法等。
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培养 ：接种后的培养基，根据不同微生物
生长条件的要求，将培养基放在适宜微生物 生长的环境中（温度、湿度、氧气等），使 其生长繁殖的过程。 需气菌培养法 厌氧培养法