贝克曼流式细胞仪原理及软件介绍.
流式细胞仪原理深度讲解，文末赠书
流式细胞仪原理深度讲解，文末赠书流式细胞术工作原理是在细胞分子水平上通过单克隆抗体对单个细胞或其他生物粒子进行多参数、快速的定量分析。
它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，具有速度快、精度高、准确性好的优点，是当代最先进的细胞定量分析技术之一。
一、流式细胞技术的应用1.其测定细胞内DNA的变异系数最小，一般在2%以下；2.能准确地进行DNA倍体分析；3.借助于荧光染料进行细胞内蛋白质和核酸的定量研究；4.快速进行细胞分选和细胞收集；5.医学应用：免疫功能研究各种干细胞的检测，癌症病人的多药耐药性，细胞功能及代谢动力学研究，血小板分析（心血管疾病），流式细胞术与分子生物学研究；6 应用于外周血内皮细胞测定、调节性T细胞等尖端领域。
二、流式细胞仪的结构流式细胞仪（FCM）结构一般分为5部分：流动室及液流驱动系统；激光光源及光束成形系统；光学系统；信号检测、存贮、显示、分析系统；细胞分选系统。
01流动室及液流驱动系统流动室（Flow chamber）是仪器核心部件，被测样品在此与激光相交。
流动室充满鞘液，样品流在鞘液的环包下形成流体力学聚焦，保证每个细胞通过激光照射区的时间相等。
图：FCM的流动室和液流系统02激光光源与光束成形系统目前台式机FCM，大多采用氩离子气体激光器。
激光是一种相干光源，提供单波长、高强度、稳定性高的光照，是细胞微弱荧光快速分析的理想光源。
激光光束在达到流动室前，先经过透镜聚焦，形成稍大于细胞直径的光斑。
03光学系统FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片、小孔组成，它们分别将不同波长的荧光信号送入到不同的电子探测器。
在FCM的光学系统中主要光学原件是滤光片（Filter），主要分成3类：长通滤片（long-pass filter，LP）、短通滤片（short-pass filter，SP）及带通滤片（band-pass filter，BP）。
长通滤片：长通滤片使特定波长以上的光通过，特定波长以下的不通过。
美国贝克曼库尔特流式细胞分析仪
美国贝克曼库尔特流式细胞分析仪（Beckman coulter cell）产品型号：Cell Lab Quanta SC当前价格：0.00元产品数量：0新旧程度：全新有效期至：0000-00-00所在地：产品简介：仪器简介：T细胞亚群检测的CD45/CD4/CD8/CD3、CD45/CD56/CD19/CD3；阵发性血红蛋白尿（PNH）检测的CD55、CD59；血小板无力症（GT）检测的CD41、CD61等等详细信息仪器简介：T细胞亚群检测的CD45/CD4/CD8/CD3、CD45/CD56/CD19/CD3；阵发性血红蛋白尿（PNH）检测的CD55、CD59；血小板无力症（GT）检测的CD41、CD61等等。
但对于白血病/淋巴瘤免疫分型，国际上迄今为止也没有统一的抗体组合。
在2000年国际细胞分析学会（ISAC）大会上，临床血细胞计数协会组织了一次国际专家会议，以期对检测血液淋巴系统肿瘤所需最少、最有效的单抗数达成共识。
75%与会者一致认为，对于慢性淋巴系统增殖性疾病（CLD）有9种单抗：CD5,CD19,κ,λ,CD3,CD20,CD23,CD10,CD45对初诊来说是最基本的。
淋巴瘤和CLD相似，需要至少12-16种单抗。
对于急性白血病（AL），75%的与会者认为大约13-15种单抗是最基本的：CD10,CD19,CD79a,CD13,CD33,CD34,CD45,CD2,MPO，CD7,CD14,CD3,HLA-DR等，对初步鉴别白血病系列是必需的。
其他一些（CD16,CD56,CDw65,TdT,cyCD3）可能对某些病例有用。
几乎所有的投票者都认为，要对急性白血病完善分类所需单抗的恰当数量平均为20-24种。
但这些抗体之间组合也是一大难题，目前也无统一规定（如表二）。
大会多数发言者(11/13)指出，对已确诊病人的监护和分期来说，仅需较少单抗。
抗体的质量控制是实验的关键环节。
抗体的质量包括其特异性、灵敏度、精密度。
贝克曼免疫 方法学
贝克曼免疫方法学
贝克曼免疫方法学是一种用于研究免疫系统的方法学，它主要
用于分析和测定细胞表面分子的表达情况、细胞的功能状态以及免
疫细胞的亚群。
贝克曼免疫方法学主要包括流式细胞仪和细胞分选
技术，它们通过利用荧光标记的抗体与细胞表面特异性抗原结合，
然后通过激光激发荧光信号，从而实现对细胞的分析和分选。
在流式细胞仪中，细胞通过流式细胞仪的流动系统单个通过激
光光束，荧光标记的抗体与细胞表面特异性抗原结合后产生荧光信号，流式细胞仪通过检测这些荧光信号来分析细胞表面分子的表达
情况，细胞的功能状态以及免疫细胞的亚群。
而细胞分选技术则是
在流式细胞仪的基础上，通过激光束的定向和细胞排序系统，实现
对特定类型的细胞进行单个分选和分离。
贝克曼免疫方法学在免疫学研究、临床诊断和治疗等领域具有
广泛的应用。
在免疫学研究中，可以通过贝克曼免疫方法学对免疫
细胞的表面标记物进行分析，从而研究免疫细胞的功能和特性；在
临床诊断中，可以利用流式细胞仪对患者的免疫细胞进行表型分析，帮助医生诊断疾病；在治疗方面，贝克曼免疫方法学也可以用于监
测患者接受免疫治疗后免疫细胞的变化情况，指导治疗方案的调整。
总之，贝克曼免疫方法学作为一种重要的免疫学研究工具，在免疫学研究、临床诊断和治疗等领域发挥着重要作用，为我们深入了解免疫系统、诊断和治疗疾病提供了有力的技术支持。
流式细胞技术基本原理及应用
LASER FITC PE
ECD PI PC5 PC7
488 520
575
615 620 665 770
<390 l 400-450 l 450-500 l
500-570 l 570-590 l 590-620 l
620-750 l
>750 l
violet
bluegreຫໍສະໝຸດ nyellow orange
Beckman Coulter：世界上最主要的高端流式细胞仪技术制造商
贝克曼库尔特细胞组学产品线
Gallios™科研型 CyAn ADP（科研型）
临床型Navios
2009年12月份上市
MoFlo Astrios 高端分选
5色数字化分析型流式 FC500
4 色数字化分析型流式 Epcis XL
Z1/Z2细胞分析计数仪
FC500的光源和光路 先进的单激光激发5色系统
单激光 就能激发5色荧光 20mW @ 488 nm Blue air-cooled argon (氩离子激光)
单激光同时激发5色荧光，确保信号来源于 同一个细胞，结果准确可靠
其它公司同档机器单激光只能激发4色，第5色需要 安装第二根激光激发。由于有两个检测点，在鞘液 压力变化、样品浓度、样品大小不均、转换采样速 度时不能确保信号来源于同一个细胞而是两个细胞 ，信号收集发生错误
(550SP)
<550 nm >550 nm
(550LP)
>550 nm <550 nm
FC500 的光路——固定光路，互换式滤片
矩形反射光路，光路短，能量损失小，易于低强度荧光检测， 并且组合滤片能保证荧光检测的特异性 完全光学线路免校正 客户可自由更换的滤片组合，且无须校正光路，可方便新荧光 染料的使用，扩展机器的功能；
FC500流式细胞仪培训教程
单细胞悬液
106/ml 正常全血
抗凝剂
取 100ul 100ul
EDTA3K （15%）约 10 微升抗凝 1 毫升全血 肝素 若抗凝不佳，有凝块，则不可检测
红细胞裂解
裂解液的选择： 保持细胞形态 红细胞裂解完全
反应温度
抗原抗体结合的最佳温度为 26~27ºC。避光。
- 21 -
FC500 培训教程
- 12 -
FC500 培训教程
- 13 -
FC500 培训教程
原理：
Hale Waihona Puke 免疫荧光分析细胞表面的抗原(或细胞膜受体)与相关的荧光抗体结合， 形成带有荧光的抗原抗体复合物。通过流式细胞仪测定其荧光 量，即可得到细胞群的不同抗原位点表达情况。
意义： 流式细胞术与单克隆抗体结合，可对细胞表面和细胞内抗
原、癌基因蛋白及膜受体进行定量检测，成为临床检验的一项 重要指标。流式免疫荧光技术不仅能将表达不同抗原位点的细 胞群区分开来，而且还能进一步区分各细胞亚群。对于造血系 统疾病、免疫功能障碍及恶性肿瘤的诊断、治疗及预后评估都 起了重要作用。
第五课时
7，免疫荧光(三标记)，示范及练习(1~2hr)
第六课时 9，质控品、自动质控程序及质控数据库介绍：
FlowCheck，FlowSet，CytoTrol，ImmunoTrol， FlowCount，StemTrol
利用 FlowCheck 演示 QC 数据库 10，总结及试剂介绍
第七~第八课时 11，DNA 检测及分析： 检测原理 方案设计：阈值，PEAK 峰的概念，RATIO，设计一个 DNA 数据
能高效校正光谱重叠，从而获得更准确的结果。应用 ADC 技术，生物样品的测定可获得自 动的颜色补偿，并不受乳胶微珠的限制。只有 Beckman Coulter 流式细胞仪提供了享有专利 权的数字信号处理系统（DSP），故能达到最佳的线性效应、无漂移的放大作用和颜色补偿。
流式细胞仪的原理介绍
用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个 参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计 分析精确性。
1.流式细胞仪的基本结构
（1） 液流系统 （2） 光学系统 （3） 数据处理系统
（1）液 流 系 统
由样本和鞘液组成
流式细胞仪的原理及应用
马黎明 生命科学与技术学院
流式细胞术的基本概念
流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以 流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精 确的对单个细胞理化特性（如大小、内部 结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行 多参数定量分析和分选的新技术。
流式细胞术的特点
流式细胞术最大的特点是能在保持细胞 及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状 态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上 获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分 选。
细胞结构 • 细胞大小 • 细胞颗粒度 • DNA含量与细胞周期 • RNA含量 • 蛋白质含量 • ……
细胞功能 · 细胞表面/胞浆/核的特异 性抗原 · 细胞活性 · 细胞内/外的细胞因子 · 激素结合位点 · 细胞受体 · 钙离子浓度 · 线粒体膜电位
· ……
一、流式细胞仪的工作原理
采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与 激发效率；
吸取100ul的细胞(1 x 105)至试管中。 加进适量的荧光标记的annexin-V试剂和PI。 混匀后避光室温下孵育15分钟。（必须在室温
下进行） 孵育后加进400ul染色缓冲液，立即上流式细
胞仪分析。
Annexin-V和PI双染的特点和注意事项
单参数直方图
量细 胞 相 对 数
流式细胞仪工作原理
流式细胞仪工作原理流式细胞仪（Flow Cytometer）是一种常用的细胞分析和排序工具，它能够对单个细胞进行高速、高精度的检测和分析。
它的工作原理基于光学和电子技术，结合了细胞生物学和物理学的原理。
流式细胞仪的工作原理可以分为以下几个步骤：1. 细胞样品的准备在使用流式细胞仪之前，需要对细胞样品进行准备。
通常，细胞样品会被染色或标记上特定的荧光染料，以便在流式细胞仪中进行检测和分析。
染色的方式可以根据需要选择，常见的有荧光染料和荧光标记抗体。
2. 样品注射和聚焦细胞样品被注入到流式细胞仪的流体系统中。
流体系统中的压力将样品推动到聚焦点处。
在聚焦点处，细胞样品会形成一个细胞流，每个细胞都会被单独通过激光束进行检测。
3. 激光照射流式细胞仪使用激光器产生高强度的激光束。
这束激光经过透镜和反射镜的调节，最终照射到聚焦点上的细胞流中。
激光的颜色和功率可以根据实验需要进行选择。
4. 细胞信号检测当激光束照射到细胞流中的细胞时，细胞会发出散射光和荧光信号。
流式细胞仪会收集这些信号，并将其转化为电信号进行处理。
常见的检测信号有前向散射光（FSC）、侧向散射光（SSC）和荧光信号。
5. 信号处理和分析流式细胞仪会将收集到的电信号转换为数字信号，并通过计算机进行处理和分析。
计算机可以根据预先设定的参数来分析细胞的大小、形状、荧光强度等特征。
这些参数可以帮助研究者了解细胞的状态和功能。
6. 数据展示和结果分析流式细胞仪会将处理后的数据以图形或表格的形式展示出来。
研究者可以根据需要对数据进行进一步的分析和解读。
通过对细胞的特征进行比较和统计，可以得出一些有关细胞群体的信息，如细胞表型、细胞周期、细胞凋亡等。
流式细胞仪的工作原理基于细胞的散射和荧光特性，通过对细胞的特征进行检测和分析，可以帮助研究者了解细胞的生物学特性和功能。
它在生命科学研究、临床诊断和药物研发等领域发挥着重要的作用。
美国贝克曼库尔特流式细胞分析仪
美国贝克曼库尔特流式细胞分析仪（Beckman coulter cell）产品型号：Cell Lab Quanta SC当前价格：0.00元产品数量：0新旧程度：全新有效期至：0000-00-00所在地：产品简介：仪器简介：T细胞亚群检测的CD45/CD4/CD8/CD3、CD45/CD56/CD19/CD3；阵发性血红蛋白尿（PNH）检测的CD55、CD59；血小板无力症（GT）检测的CD41、CD61等等详细信息仪器简介：T细胞亚群检测的CD45/CD4/CD8/CD3、CD45/CD56/CD19/CD3；阵发性血红蛋白尿（PNH）检测的CD55、CD59；血小板无力症（GT）检测的CD41、CD61等等。
但对于白血病/淋巴瘤免疫分型，国际上迄今为止也没有统一的抗体组合。
在2000年国际细胞分析学会（ISAC）大会上，临床血细胞计数协会组织了一次国际专家会议，以期对检测血液淋巴系统肿瘤所需最少、最有效的单抗数达成共识。
75%与会者一致认为，对于慢性淋巴系统增殖性疾病（CLD）有9种单抗：CD5,CD19,κ,λ,CD3,CD20,CD23,CD10,CD45对初诊来说是最基本的。
淋巴瘤和CLD相似，需要至少12-16种单抗。
对于急性白血病（AL），75%的与会者认为大约13-15种单抗是最基本的：CD10,CD19,CD79a,CD13,CD33,CD34,CD45,CD2,MPO，CD7,CD14,CD3,HLA-DR等，对初步鉴别白血病系列是必需的。
其他一些（CD16,CD56,CDw65,TdT,cyCD3）可能对某些病例有用。
几乎所有的投票者都认为，要对急性白血病完善分类所需单抗的恰当数量平均为20-24种。
但这些抗体之间组合也是一大难题，目前也无统一规定（如表二）。
大会多数发言者(11/13)指出，对已确诊病人的监护和分期来说，仅需较少单抗。
抗体的质量控制是实验的关键环节。
抗体的质量包括其特异性、灵敏度、精密度。
流式细胞仪原理及操作步骤
流式细胞仪原理及操作步骤流式细胞仪（FCM）是八十年代集单克隆抗体、荧光化学、激光、计算机等高技术发展起来的一种先进仪器，已广泛应用于免疫学、生物化学、生物学、肿瘤学以及血液学等方面的研究和临床常规工作。
其中检测人白细胞表面标志可对白血病、淋巴瘤作用迅速正确的诊断，对淋巴细胞群和亚群进行精确分类，还能分离纯化某一群或亚群细胞。
活细胞免疫荧光技术是用于FCM检测的标本准备，染色后也能在荧光显微镜下进行观察，在某些实验条件下，活细胞免疫荧光染色后的特异性和敏感性要优于滴片固定的常规间接免疫荧光的结果。
（一）原理活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。
（二）操作步骤制备活性高的细胞悬液（培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法）↓用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为5×10６～１×10７／ml↓取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb（5～50μl）的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1 ∶20（用DPBS稀释）灭活正常兔血清（或兔抗鼠）荧光标记物，充分振摇↓ 4 ℃30min 用洗涤液洗涤2 次，每次加液2ml 左右1000rpm×5min↓加适量固定液（如为FCM制备标本，一般加入1ml 固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，视细胞浓度加入100～500μl 固定液）↓ FCM检测或制片后荧光显微镜下观察（标本在试管中可保存5～7 天）（三）试剂和器材1. 各种特异性单克隆抗体。
2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。
3. 10％FCS RPMI1640, DPBS 、洗涤液、固定液（见附录）。
4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。
（四）注意事项1. 整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10 倍的NaN３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。
流式细胞仪的原理及应用-医学资料
荧光补偿原理
• 颜色补偿：采用合适的方法校正荧光染料之间叠加 所造成的误差。在完成双色以上荧光标记的样本时 ，都需要作颜色补偿。
• 带通滤片接受的是一定带宽波长的荧光，故会有干 扰光同时被接收，然后一同进入PMT进行光电转换 并放大。
• 通常干扰光占该染料所发出荧光总量的X%
补偿模型图
定性或定量分析细胞：通过荧光染色对单细胞的某些成分如 DNA含量、抗原或受体表达量、Ca2+浓度、酶活性以及细胞 的功能等均可进行单细胞水平的定性与定量分析
强大的分选功能，在分析的同时可以对特定群体加以分选
流式细胞仪的检测范围
细胞结构
细胞大小 细胞粒度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周
外周全血细胞散射光双参数点图
（红细胞溶解后）
荧光信号
双色直接染色
数据分析
直方图分析
数据分析
点图分析
数据分析
等高图和密度图分析
数据分析
三维图分析
当前生产流式细胞仪的公司
• BD公司 • 贝克曼-库尔特公司 • Cytomation公司 • Bio-Rad 公司 • Partec公司（德国） • Applied Biosystems公司
流式细胞术的基本概念
• Fluorescein ：荧光素，是指在一定波长的电磁 波（常为蓝光或紫外光）照射下能发出荧光的 一类染料 ；常见的荧光素有异硫氰酸荧光素 ( fluorescein isothiocyanate, FITC)、藻红蛋白 （R-Phycoerythrin,R-PE）、别藻青蛋白（ allophycocyanin,APC）、多甲藻叶绿素蛋白 （ peridinin chlorophyll protein, PerCP）等 。
贝克曼z2全自动细胞分析计数仪详细介绍全自动系统操作简易数据
贝克曼Z2全自动细胞分析计数仪详细介绍:全自动系统操作简易,数据准确-使用便捷,只需输入要分析的颗粒直径范围,分析就能在数秒内完成.具有校正系统,保证每次测量可靠.多种数据显示-数据可以以数量或浓度形式显示结果，对于稀释的样品，只需输入稀释因子，仪器自动显示原样本的浓度，同时分析细胞数目及大小分布。
测定快速- 提供各种浓度细胞的计数和测量，每个标本检测只需10秒钟。
安全设置- 为方便用户更换试剂、处理废液及简化连接安装过程，贝克曼库尔特特别为Z2设计了Z PAK试剂包及专用感应装置。
使用Z PAK试剂包可避免用户在更换试剂时，溢出电解液而造成环境污染和试剂浪费。
废液被收集在完全密封包装的环境，既避免了操作者与废液接触，又防止了对环境造成生物污染。
Z2全自动细胞分析计数仪应用：应用领域：- 可应用于生物学和医学的各个研究和生产领域，包括各种细胞的分离、培养及质量控制、生殖研究、环境研究、各种细胞的毒理研究、酵母的发酵监控等应用类型：- 可应用于分析骨髓细胞、基因组与蛋白组的细胞、片层体、肌细胞、药物细胞滋养层、血小板、精子、组织培养、组织工程、白细胞、红细胞、体液、酵母、培养细胞、浮游生物、藻类、海洋生物、植物细胞、细菌、原生生物、干细胞等。
Z2全自动细胞分析计数仪参数：分析范围：1μm to 120μm直径定量分析：100μL, 500μL, 1000μL耗电量：少于55W样品浓度/范围：256:1 (容积)，6.3:1 (直径)电源要求：100-120 VAC±10% 50/60 Hz220-240 VAC±10% 50/60 Hz仪器体积：高：46cm (18”)宽：27cm (10.6”) without keypad深：36cm (14”)重量：13.6kg (30lb)型号：Z1 (Single) 单域值型Z2 (Dual) 双域值型Z2 分布型标准数据显示：数目及浓度(数目/毫升)Z2专配Accucomp软件：细胞或颗粒的数目和大小分布功能输出报告：数目列表—计数与浓度、平均体积、数据列表和图形——计数、浓度和分布分布统计数据：平均值、中值、峰值以及标准偏差贝克曼库尔特Vi-CELL XR细胞存活率分析计数器Vi-CELL XR细胞存活率分析仪细胞活性分析仪参数及特点：功能：测定细胞存活率、总细胞数、存活细胞数、总细胞浓度、存活细胞浓度、细胞的直径及分布、细胞的平均直径、细胞圆度及分布、细胞平均圆度、细胞的生长速度、细胞倍增时间、细胞生长曲线，进行实时细胞凋亡检测、细胞周期检测分析范围：细胞存活率：0%-100%，细胞尺寸：5-70µm / 2-70µm，细胞直径：2mm-70mm；可测细胞浓度范围：50,000-10,000,000个细胞/mL (XR型)应用原理技术：台盼蓝染色排除法，CCD成像技术测量项目：- 总细胞数/总细胞浓度- 存活细胞数/存活细胞浓度- 细胞存活率- 细胞的直径及分布/细胞的平均直径- 细胞圆度及分布/细胞平均圆度- 细胞的增殖速度- 细胞倍增时间技术特点：- 细胞存活率分析计数器能全自动快速准确的进行细胞存活率分析，实时检测细胞密度与活率，令细胞周期及细胞凋亡过程一目了然。
流式细胞仪的原理与应用2
分选速度指FCM每秒从液体中提取所要细胞的个数。
分选纯度指被分选出细胞中目标细胞所占的百分率。 分选收获率指被分选出细胞占原来溶液中该细胞的百分率。
21
2 流式细胞仪的基本结构
光学系统 液流系统 电子系统 数据处理系统 分选系统
19
流式细胞仪的光学系统
经特异荧光染色的细胞需要合适的光源照射激发才能发出荧光供收集检测。 光源的选择主要根据被激发物质的激发光谱而定。 FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片、小孔组成，它们分别将不同波 长的荧光信号送入到不同的电子探测器。 为使细胞得到均匀照射，并提高分辨率，照射到细胞上的激光光斑直径应 和细胞直径相近。因此需将激光光束经透镜会聚。为了进一步使检测的发 射荧光更强，并提高荧光讯号的信噪比，在光路中还使用了多种滤片。 带阻或带通滤片是有选择性地使某一滤长区段的光线滤除或通过。例如使 用525nm带通滤片只允许FITC（Fluoresceinisothiocyanate,异硫氰荧光素） 发射的525nm绿光通过。长(短）波通过二向色性反射镜只允许某一波长以 上（下）的光线通过而将此波长以下的另一特定波长的光线反射。在免疫 分析中常要同时探测两种以上的波长的荧光信号，就采用二向色性反射镜， 或二向色性分光器，来有效地将各种荧光分开。
流式细胞仪的原理与应用
The principles and applications of Flow Cytometry
焦
鹏
概述
流式细胞术(flow cytometry, FCM)是20 世纪70年代发展起来的一种以流式细胞仪为 工具，能快速测量细胞的物理或化学性质， 如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗 原等，并可对其分类、收集的高新技术。
光谱重叠的校正
流式细胞术(贝克曼)
Th1Th2细胞因子分泌细胞测定
根据产生的细胞因子的
类型和生物学功能,人的ＣＤ
4+Ｔ细胞可以分为Ｔｈ1、Ｔ
ｈ2
Ｔｈ1细胞产生ＩＬ 2、ＩＬ 12、ＩＦＮ γ、ＴＮＦ β等细 胞因子,主要参与细胞介导的 免疫反应、迟发性过敏反应, 并在清除病毒等细胞内致病 因子方面起着重要作用
Normal Cell Cycle
M G2
G0
G1
s
C o u n t
DNA Analysis
G0G1
s G2 M
0
200
400
600
800
1000
2N
4N
DNA content
1. 肿瘤的早期诊断。 2. 肿瘤的良恶性判断。 3. 观察细胞的增殖状态及周期分布。 4. 疗效监测
细胞功能分析
1.吞噬功能试验 2.氧爆发试验 3.根据T淋巴细胞分泌细胞因子的不同将CD4+或 CD8+分为介导细胞免疫的I型细胞和介导体液 免疫的II型细胞. 4.药物泵的功能检测 5.NK细胞的肿瘤杀伤活性检测 6.血小板的粘附,聚集功能检测
CD80,CD86,CD83,DR等 2）利用BDCA1,2,3,4对外周血或其它组织DC进行
分析 3）
CD14+16/CD85/CD33,CD14+16/CD85/CD123
T细胞分析
相对计数－淋巴细胞亚群数量检查项目和意义
疾病
CD3 CD4 CD8 CD4/CD8 NK
自身免疫病
降低 增高 降低
降低
AIDS SARS
降低 降低
严重 降低
降低
流式细胞术(贝克曼)
通过将流式细胞术与基因组学、蛋白质组学等技术相结合， 未来有望实现个体化医疗的精准诊断和治疗。这将为患者提 供更加定制化的治疗方案，提高治疗效果和生存率。
THANKS
感谢观看
血液学研究
造血干细胞研究
利用流式细胞术研究造血干细胞的自我更新、分化等 过程，有助于血液疾病的诊断和治疗。
白血病分型与诊断
通过流式细胞术对白血病细胞进行分型和鉴别，有助 于白血病的诊断和治疗。
红细胞与血小板检测
利用流式细胞术检测红细胞和血小板的数量和质量， 有助于贫血和出血性疾病的诊断和治疗。
04
流式细胞术的优缺点
优点
快速
灵敏度高
流式细胞术可以在短时间内处理大量样本 ，提高了检测效率。
流式细胞术能够检测到低浓度的细胞，灵 敏度较高。
多参数分析
自动化程度高
流式细胞术可以对细胞进行多参数分析， 包括细胞表面抗原、细胞内蛋白质和DNA 等。
流式细胞术通常采用自动化仪器进行操作 ，减少了人为误差和操作时间。
发展历程
20世纪50年代
流式细胞术的原理被提出，并开始应用于细 胞计数和大小测量。
20世纪80年代
计算机技术的引入，实现了自动化数据分析。
20世纪70年代
荧光染料和荧光显微镜的引入，使得多参数 检测成为可能。
21世纪
高通量测序技术的发展，推动了流式细胞术 在基因组学和蛋白质组学领域的应用。
应用领域
免疫学研究
用于检测免疫细胞表 面标志物、细胞因子 等，研究免疫细胞的 分化、发育和功能。
血液学研究
用于检测血液细胞， 诊断血液疾病，如白 血病、淋巴瘤等。
肿瘤学研究
用于检测肿瘤细胞的 表面标志物、基因突 变等，为肿瘤的诊断 和治疗提供依据。
FC500流式细胞仪培训教程
自动化调控装置 使日常操作程序标准化的装置以及 PMT 电压和补偿值的质量控制装置，为用户提供多 方便利 自动化地报告质量控制结果
简明的补偿设置及其调节 对执行多种应用的研究者来说是理想的选择 应用 FCS 3.0,20-位数据可进行在线和脱机两种列表方式的补偿 当样品正在采集中或已经采集结束后都可进行数据的处理
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620nmBP
可以允许 610~630nm 的光通过
信号放大方式： 经过 PMT 将光学信号转变为电脉冲信号，并增加 PMT 的电
压及增益，可将脉冲信号进行放大。放大方式有两种： 线性放大(Lin):
AMP
对数放大(Log)
AMP
通常散射光信号用线性放大，荧光信号用对数放大。但是注意 血小板的散射光用对数，而 DNA 的荧光信号用线性。
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流式细胞仪的原理及应用
流式细胞仪的原理及应用1. 导言流式细胞仪（Flow Cytometry）是一种强大的生物学分析技术，可用于对细胞进行精确的多参数分析。
本文将介绍流式细胞仪的原理以及其在不同领域中的应用。
2. 流式细胞仪的原理流式细胞仪通过激光器将单一细胞注入到来自样品的悬浮液中，并对其进行流式检测。
其原理主要包括以下几个步骤：2.1 细胞悬浮液的制备将待测样品进行预处理，并将细胞转化为单细胞悬浮液。
这通常涉及到细胞的离心、洗涤和溶解等步骤，以确保获得单一、可靠的细胞样本。
2.2 细胞的注射将细胞悬浮液注入流式细胞仪中，通过液压系统控制细胞的流速和数量，确保适量的细胞满足检测要求。
2.3 激光照射和荧光检测流式细胞仪使用高功率激光器照射经过细胞的细胞悬浮液。
这些激光器可以刺激样品中的荧光染料、标记物或其他荧光探针。
细胞在受到激光照射后会发出荧光信号，流式细胞仪则利用光电倍增管检测并记录这些信号。
2.4 数据分析流式细胞仪所得到的原始数据将通过计算机进行处理和分析，以提取相关的参数和信息。
数据可以按照细胞数量、细胞表型及细胞活性等不同参数进行分类和分析。
3. 流式细胞仪的应用3.1 生命科学研究流式细胞仪在生命科学领域的研究中扮演着重要角色。
它可以用于研究细胞周期、细胞凋亡、细胞增殖以及细胞表型的分析。
流式细胞仪能够分析多个标记物的表达情况，帮助研究人员识别不同的细胞类型，并进行进一步的功能研究。
3.2 临床诊断流式细胞仪在临床诊断中也得到了广泛的应用。
它可以通过检测多种荧光标记物来识别和分类血液细胞，并进行疾病的诊断。
例如，在白血病的早期诊断中，流式细胞仪能够检测异常细胞的存在，提供重要的诊断依据。
3.3 免疫学研究流式细胞仪在免疫学研究中被广泛应用。
它可以辅助进行免疫表型分析、细胞介导的免疫反应监测以及细胞因子的检测。
流式细胞仪的高通量性能使得大规模分析成为可能，帮助研究人员深入了解免疫系统的功能和疾病的发展机制。
流式细胞仪工作原理
流式细胞仪工作原理流式细胞仪（Flow Cytometer）是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断的仪器，用于分析和计数细胞、细胞表面标记物、细胞内分子和细胞功能等。
它通过激光束照射细胞悬浮液，并测量样品中细胞的荧光和散射信号，从而获得关于细胞特性的详细信息。
流式细胞仪的工作原理可以分为样品处理、激光束照射、细胞信号检测和数据分析等几个关键步骤。
1. 样品处理首先，需要将待测样品进行预处理，以获得单个细胞的悬浮液。
这通常涉及细胞的分离、洗涤和染色等步骤。
分离可以通过离心或筛选等方法进行，洗涤则是为了去除不需要的细胞培养基或其他污染物，染色则是为了标记细胞或细胞内的分子。
2. 激光束照射样品处理后，悬浮细胞被注入流式细胞仪的流体系统中。
激光器产生一束高能激光光束，通常是蓝色、绿色或红色激光。
这束激光通过透镜系统聚焦成一个非常细的光束，并照射到细胞悬浮液中。
3. 细胞信号检测当激光照射到细胞上时，细胞会发生光散射和荧光发射。
光散射是由细胞大小和形状等因素决定的，而荧光发射则是由细胞内的染色剂或标记物决定的。
流式细胞仪通常使用多个探测器来检测细胞发射的信号。
其中，光散射信号通常由前向散射（Forward Scatter，FSC）和侧向散射（Side Scatter，SSC）检测器来接收。
荧光信号则由多个荧光检测器接收，每个检测器用于检测特定波长的荧光发射。
4. 数据分析流式细胞仪将检测到的信号转换为电信号，并通过计算机进行数据采集和分析。
这些数据可以用于细胞计数、细胞周期分析、蛋白质表达分析、细胞亚群分析等。
在数据分析过程中，常用的方法包括设置门（gating）来选择感兴趣的细胞群体，并根据细胞表面标记物或内部分子的荧光强度进行定量分析。
总结：流式细胞仪的工作原理是通过激光照射细胞悬浮液，测量细胞的光散射和荧光发射信号，从而获得关于细胞特性的详细信息。
它在生物医学研究和临床诊断中起着重要的作用，可以用于细胞计数、细胞周期分析、蛋白质表达分析等。
贝克曼au5800工作原理
贝克曼au5800工作原理嘿呀！今天咱们来聊聊贝克曼au5800 的工作原理呢！哎呀呀，首先呢，咱们得知道这贝克曼au5800 那可是个厉害的家伙呀！它在医疗检测领域可是有着重要的地位呢！那它到底是怎么工作的呢？哇，这可得好好说道说道！1. 样本采集嘿，要让贝克曼au5800 发挥作用，第一步当然是采集样本啦！比如血液、尿液等等。
这些样本可都是藏着身体状况的秘密哟！2. 样本运输哎呀呀，采集好的样本得被小心地运输到检测仪器那里呢！这一路上可不能出岔子，不然检测结果就不准确啦！3. 样本处理哇！这一步可关键啦！贝克曼au5800 会对样本进行一系列的处理，比如说分离、提纯啥的。
它就像一个聪明的小工匠，把样本里有用的成分挑出来，准备进行检测。
4. 检测分析嘿哟！到了最重要的检测分析环节啦！仪器会利用各种先进的技术和方法，对样本中的各种成分进行检测和分析。
比如说，检测血液中的血糖、血脂、肝功能指标等等。
这可真是神奇呀！5. 数据生成哎呀呀，检测完了，就得生成数据啦！这些数据可都是非常重要的信息，医生们就是根据这些数据来判断咱们的身体是不是健康呢！6. 数据传输哇！生成的数据可不能就放在仪器里，得传输出去呀！这样医生才能及时看到，做出准确的诊断和治疗方案。
在整个工作过程中，贝克曼au5800 依靠着先进的传感器、精密的光学系统和强大的计算机处理能力，确保每一个环节都准确无误呢！哎呀呀，这可真是让人惊叹不已呀！它的工作原理可不简单哟，需要多个部分协同合作，就像一个团队在共同努力完成一项艰巨的任务呢！而且呀，正是因为有了贝克曼au5800 这样先进的仪器，医疗检测的效率和准确性都大大提高啦！这对于咱们的健康保障来说，可真是太重要啦！总之呢，贝克曼au5800 的工作原理充满了科技的魅力和神奇之处！哇，真希望这样的好仪器能越来越多，让咱们的医疗水平不断提高，让大家都能健健康康的哟！。
流式细胞仪工作原理
流式细胞仪工作原理流式细胞仪是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断的仪器，它能够对单个细胞进行高速、高精度的分析和排序。
下面将详细介绍流式细胞仪的工作原理。
1. 光学系统流式细胞仪的光学系统包括激光器、光学滤波器、光散射器和探测器。
激光器产生高强度的单色光束，常用的波长包括488nm、633nm等。
光学滤波器用于选择特定波长的光线，以激发样本中的荧光染料。
光散射器通过控制激光束的聚焦和散射来调整样本中细胞的流速和光散射角度。
探测器用于检测样本中的荧光信号和散射光信号。
2. 样本处理系统样本处理系统主要包括细胞样本的制备和染色。
首先，需要将细胞样本进行离心分离，以获得单细胞悬浮液。
然后，将细胞悬浮液与荧光染料进行染色，以标记不同的细胞类型或细胞内的特定分子。
染色后的样本通过注射器被引入流式细胞仪的流动系统。
3. 流动系统流动系统由注射器、流动池和射流装置组成。
注射器用于将样本引入流动池，流动池中的样本通过射流装置以恒定速度流动。
流动池中的样本细胞在流动过程中形成单个细胞的连续流，并经过激光束的照射。
4. 光散射和荧光检测当激光束照射到流动池中的细胞时，细胞会散射光线。
光散射信号可以通过散射器和探测器检测到，并记录下来。
同时，染色的细胞还会产生荧光信号。
流式细胞仪的探测器可以根据荧光染料的特定波长来检测荧光信号的强度。
5. 数据分析流式细胞仪通过探测器收集到的光散射和荧光信号，生成细胞的散射图和荧光图。
散射图可以用来分析细胞的大小、形状和复杂度等信息，荧光图可以用来分析细胞的荧光强度和染色情况。
通过对这些图像的分析，可以确定细胞的类型、数量和功能。
总结：流式细胞仪是一种基于光散射和荧光信号的细胞分析和排序仪器。
它通过光学系统、样本处理系统、流动系统和数据分析系统实现对单个细胞的高速、高精度分析。
流式细胞仪在生物医学研究和临床诊断中具有广泛的应用前景，可以帮助科学家和医生更好地理解细胞的结构和功能。
贝克曼流式细胞仪原理及软件介绍
Scale
1000 200 100 50 40 30 20 15 8
Neutrophils
Monocytes
Lymphocytes
0 200
400
600
800
1000
90 Degree Scatter
贝克曼流式细胞仪原理及软件介绍
第24页
光路-荧光信号
每种荧光染料都有特定激发波长, 并激发后会有 发射波长,流式细胞仪检测即是它特定发射波长.
贝克曼流式细胞仪原理及软件介绍
第14页
光路
光源 与经过细胞聚焦在同一点上
激光
空冷
488nm blue, 633nm red, 325nm UV, 514nm green, 空冷/水冷
Enterprise II 水冷 Innova300系列
Innova70系列
贝克曼流式细胞仪原理及软件介绍
第15页
贝克曼流式细胞仪原理及软件介绍
第42页
分析系统
以FC500机型CXP软件介绍
贝克曼流式细胞仪原理及软件介绍
第43页
贝克曼流式细胞仪原理及软件介绍
第44页
道绝对无菌。
贝克曼流式细胞仪原理及软件介绍
第6页
基础原理
流路（液流系统）
流动室 鞘液SHEATH 样本流SAMPLE 单细胞悬液5*105~1*106个/ml
光路（光学系统）
光源 滤片 光电倍增管PMT HV
电路（电路系统）
放大电路HV及GAIN 增益 A/D转换
分析系统：计算机
贝克曼流式细胞仪原理及软件介绍
贝克曼流式细胞仪原理及软件介绍
第29页
FALS Sensor
Freq
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90 Degree Scatter
Forward Scatter Projection
Neutrophils
Forw ard Scatter
800
光路-荧光信号
每种荧光染料均有特定的激发波长, 并激发后会 有发射波长,流式细胞仪检测的即是它特定的发射 波长. 利用各种不同波长的光学滤片来收集(检测)这些 光学信号
Beckman Coulter Celllab Family
EPICS XL-ADC
QUANTA SC
Gallios/Navios MoFlo XDP
Cytomics FC500
Cyan ADP
FC500硬件
What is flow cytometry?
流式细胞术是单个细 胞/颗粒流过检测装置 过程中，检测到的物 理和/或化学的特性。 Howard Shapiro, Practical Flow Cytometry, 3rd Edition
长通滤片 – 允许长于设定波长的光通过
短通滤片 – 允许短于设定波长的光通过 带通滤片 – 允许一定带宽的波长通过
光路 - 滤片特性
当以 45o 角放置滤片时,该滤片可以通过一定波 长的光,同时也可以阻断并折射该波长以下的光
这种方式的滤片称为二向色性滤片( dichroic filter)
A/D转换
分析系统：计算机
流路构造
流
路
单细胞悬液
大多数仪器是在50-300 µm 大小的孔径中,将细 胞悬液注射进入鞘液中 这一过程,成为流体动力学聚焦
FLOW CELL
Injector Tip
Sheath fluid
Fluorescence signals
Focused laser beam
流式细胞仪 FLOW CYTOMETER
原理及软件介绍
Beckman Coulter流式细胞仪发展史
年Wallace Coulter发明了库尔特原理，用于血细胞分析 1953年推出了世界上第一台流式细胞分析仪Coulter Counter Model A 1972年推出世界上第一台激光流式细胞仪EPICS II 1975年研制出世界上第一台带计算机的流式细胞仪 1997年推出世界上第一台单激光四色数字化流式细胞仪EPICS XL/MCL 2000年首先将高精度数字化颜色补偿技术ADC（Advanced Digital Compensation）应用于流式平台，引领流式进入全新的全矩阵补偿、全自动 补偿和脱机补偿时代 2003年推出世界上第一台单激光五色的流式细胞仪FC500/MCL，2005年升级 为FC500/MPL 2006年推出世界上第一台具有EV参数同时进行无成本绝对计数的多功能细胞 分析系统Quanta SC， 将流式细胞术与库尔特原理完美结合，2007年推出 MPL进样系统 2007年收购Dako公司的Moflo和Cyan，使Beckman公司成为高端流式市场的 领导者 2009年，推出世界是第一台三激光十色的分析型流式细胞仪Gallios/Navios
分类
分析型：只能分析用，液流进入废液筒 分选型：回收目标细胞，用于后续实验。要求管 道绝对无菌。
基本原理
流路（液流系统）
流动室
鞘液SHEATH 样本流SAMPLE 单细胞悬液5*105~1*106个/ml
光路（光学系统）
光源 滤片 光电倍增管PMT HV
电路（电路系统）
放大电路HV及GAIN 增益
前向散射光
Laser
FALS Sensor
前向散射光
散射光信号 – 侧向散射光
SS-Side (Angel Light) Scatter 与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器, 也称 为90度散射光检测器
SS用于检测细胞内部结构 如:胞浆内颗粒多少, 核质比
侧向散射光
Laser
FALS Sensor
620
675 620 755 670
免疫荧光
免疫荧光 DNA染色 免疫荧光
橙红
红 橙红 深红
APC
633
670
5 Color Single Laser (488nm)
FITC/PE/ECD/PC5/PC7
荧光染料比较(平均荧光强度)
Q-Prep / ImmunoPrep 试剂系统
CD8-FITC
荧光染料的特性
•激发波长(EXCITING)
•发射波长(EMISSION)
常用荧光染料的特性
荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm)
FITC PE(RD1) 488 488 525 575
用途
免疫荧光 免疫荧光
颜色
绿色 橙色
ECD
PeCy5 PI PECy7 PerCP
488
488 488 488 488
光路构造
光
光源
路
检测信号 散射光信号 FS: 前向角散射光 SS: 侧向角散射光(90度散射光)
荧光信号 荧光染料 光学滤片
光
路
光源 与通过的细胞聚焦在同一点上 激光
空冷 488nm blue, 633nm red, 325nm UV, 514nm green, 空冷/水冷 Enterprise II 水冷 Innova300系列 Innova70系列
CD8-PE
CD8-ECD
CD8-PC5
CD8-PerCP
CD8-APC
PerCP < APC < FITC < ECD < PC5 < PE
FALS Sensor
Freq
Fluorescence
Fluorescence detector ( FL1,FL2,FL3,FL4,FL5,SS)
光路 - 滤片特性
90LS Sensor
侧向散射光
Light Scatter Gating
Side Scatter Projection
1000
Scale
1000 200 50 40 20 15 8
200 400
600
100
30
Monocytes Lymphocytes
0
0 200 400 600 800 1000
常用激光器及其通道分配表
检测信号
散射光信号—前向散射光(FS)
FS----Forward (Angel Light) Scatter 在激光束正前方的检测器, 为前向散射光检测器 FS的强度与细胞或其他颗粒的大小, 形状及 optical homogeneity 有关 FS用于检测细胞或其他粒子的表面属性 如:大小