巯基的化学修饰
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▪ L-asparaginase (EC.3.5.1.1) 抗肿瘤
▪ FDA批准的Oncaspar1994年在美国上 市，为L-天冬酰胺的PEG螯合物
蛋白质改造的分子生物学途径
▪ 基因突变技术：通过在基因水平上对其 编码的蛋白质分子进行改造，在其表达 后研究蛋白质功能的一种方法
▪ 分两类：位点特异性突变和随机突变
▪ 亲和试剂专一性标记在酶的活性部位， 使酶不可逆失活，也称专一性抑制剂。
亲和标记
蛋白质的化学交联
▪ 化学交联是一类重要的化学修饰
▪ 交联剂是具有两个反应活性部位的双 功能基团可以在相隔较近的两个氨基 酸残基之间，或蛋白质与其他分子之 间发生交联反应。
▪ 交联剂种类繁多，在长度、氨基酸专 一性、交联速度和交联效率不同。
最常用的交联剂
酶蛋白化学修饰的应用
▪ 酶蛋白修饰的研究历史
▪ 五十年代，主要研究酶的结构和功能 的关系
▪ 七十年代，人为改变天然酶的某些性 质，创造天然酶所不具备的优良特性， 甚至创造新的活性
酶蛋白化学修饰的应用
▪ 酶经过修饰，会产生的变化： 提高生物活性 增强在不良环境中的稳定性 针对特异性反应降低生物识别能力解除 免疫原性 产生新的催化能力
▪ 修饰剂具有两个邻位羰基的化合物 例：丁二酮，1，2－环己二酮
精氨酸胍基的修饰
巯基的化学修饰
▪ 巯基具有很强的亲核性 ▪ 烷基化:基于碘乙酸的荧光试剂
Enzyme-SH + ICH2COOH Enzyme-S-CH2COOH
巯基的化学修饰
▪ N－乙基马来酰亚胺是专一性强的修饰剂， 产物在300nm有最大吸收
▪ 与DTNB,Ellman试剂反应生成二硫键 ▪ 有机汞试剂专一性强，产物在250nm处有
最大吸收
巯基的化学修饰
巯基的化学修饰
组氨酸咪唑基的修饰
▪ DPC在中性pH下有专一性，产物在 240nm处有最大吸收
▪ 碘代乙酸可修饰不同的N原子
组氨酸咪唑基的修饰
色氨酸的吲哚基
▪ NBS可修饰吲哚基，但酪氨酸干扰 ▪ HNBB，KoshlandⅠ专一水溶性差 ▪ 4－硝基苯硫氯, KoshlandⅡ专一性强 ▪ 注意修饰时对巯基保护
位点特异性突变
▪ 通过寡核苷酸介导的基因突变 ▪ 盒式突变或片段取代突变 ▪ 利用聚合酶链反应（PCR）,以双链
DNA为模板进行的基因突变
寡核苷酸介导的基因突变
▪ 是在含有突变序列的寡核苷引物介导下 进行的
▪ 几种方法： 基于抗生素抗性回复的突变方法 基于去除特定限制酶切位点的突变 利用PCR产生定点突变
酶的表面化学修饰－大分子修饰
▪ 可溶性大分子可通过共价键连于蛋白 质表面，形成覆盖层
▪ PEG, PVP,PAA,葡聚糖，环糊精，CMC， 肝素等
▪ 分子量500－20000u的PEG，是两亲分 子，具有生物相容性
聚乙二醇修饰蛋白质
▪ PEG 修饰时多采用单甲氧基聚乙二醇
聚乙二醇修饰蛋白质
▪ 例：聚乙二醇修饰的L-天冬酰胺酶降 低甚至消除酶的抗原性，提高了抗蛋 白质水解的能力，延长体内半衰期， 提高药效
羧基的化学修饰
▪ 水溶性的碳二亚胺是特异修ຫໍສະໝຸດ Baidu酶的 COOH，也是最普遍的标准方法
▪ 羧基的甲酯化
氨基的化学修饰
▪ ε－NH2具有亲核性 ▪ 烷基化： 修饰剂有：卤代乙酸、芳基卤
（DNFB)、芳香族磺酸（TNBS） ▪ 烷基化：与醛酮还原烷基化 ▪ 蛋白质序列分析中的 DNS
精氨酸胍基的修饰
色氨酸的吲哚基
酶的亲和修饰
▪ 亲和标记 酶的侧链的化学修饰存在着多个同 类残基与修饰剂反应的问题，对某 个残基的选择性修饰较困难，因此 开发了亲和标记试剂。
亲和标记
▪ 酶的位点专一性修饰时根据酶和底物的 亲和性，修饰剂不仅具有对作用基团的 专一性，而且具有被作用部位的专一性。 这类化学修饰称为亲和标记，这类修饰 剂称为位点专一性抑制剂。
食品生物技术精品课程
▪主讲：刘常金
第二章蛋白质修饰
内容
▪ 酶蛋白的化学修饰 ▪ 酶蛋白化学修饰的应用 ▪ 蛋白质改造的分子生物学途径
酶蛋白的化学修饰
▪ 酶蛋白侧链的修饰 ▪ 酶蛋白的亲和修饰 ▪ 酶的化学交联
酶蛋白侧链的修饰
▪ 羧基的化学修饰 ▪ 氨基的化学修饰 ▪ 精氨酸胍基的化学修饰 ▪ 巯基的化学修饰 ▪ 组氨酸咪唑基的化学修饰
随机突变
▪ DNA shuffling技术
Thanks !
在结构与功能研究中的应用
▪ 研究酶空间结构 ▪ 确定氨基酸残基的功能 ▪ 测定酶分子中某种氨基酸的数量
在医药和生物技术中的应用
▪ 问题的提出：
▪ 医药方面：异体蛋白质的抗原性受蛋白 质水解酶水解和抑制作用，在体内半衰 期短、稳定性差、不能在靶部位聚集， 不在最适pH值，影响使用效果
▪ 生物技术领域：工业用酶遇酸、碱、有 机溶剂变性、不耐热、易受产物和抑制 剂抑制。
▪ FDA批准的Oncaspar1994年在美国上 市，为L-天冬酰胺的PEG螯合物
蛋白质改造的分子生物学途径
▪ 基因突变技术：通过在基因水平上对其 编码的蛋白质分子进行改造，在其表达 后研究蛋白质功能的一种方法
▪ 分两类：位点特异性突变和随机突变
▪ 亲和试剂专一性标记在酶的活性部位， 使酶不可逆失活，也称专一性抑制剂。
亲和标记
蛋白质的化学交联
▪ 化学交联是一类重要的化学修饰
▪ 交联剂是具有两个反应活性部位的双 功能基团可以在相隔较近的两个氨基 酸残基之间，或蛋白质与其他分子之 间发生交联反应。
▪ 交联剂种类繁多，在长度、氨基酸专 一性、交联速度和交联效率不同。
最常用的交联剂
酶蛋白化学修饰的应用
▪ 酶蛋白修饰的研究历史
▪ 五十年代，主要研究酶的结构和功能 的关系
▪ 七十年代，人为改变天然酶的某些性 质，创造天然酶所不具备的优良特性， 甚至创造新的活性
酶蛋白化学修饰的应用
▪ 酶经过修饰，会产生的变化： 提高生物活性 增强在不良环境中的稳定性 针对特异性反应降低生物识别能力解除 免疫原性 产生新的催化能力
▪ 修饰剂具有两个邻位羰基的化合物 例：丁二酮，1，2－环己二酮
精氨酸胍基的修饰
巯基的化学修饰
▪ 巯基具有很强的亲核性 ▪ 烷基化:基于碘乙酸的荧光试剂
Enzyme-SH + ICH2COOH Enzyme-S-CH2COOH
巯基的化学修饰
▪ N－乙基马来酰亚胺是专一性强的修饰剂， 产物在300nm有最大吸收
▪ 与DTNB,Ellman试剂反应生成二硫键 ▪ 有机汞试剂专一性强，产物在250nm处有
最大吸收
巯基的化学修饰
巯基的化学修饰
组氨酸咪唑基的修饰
▪ DPC在中性pH下有专一性，产物在 240nm处有最大吸收
▪ 碘代乙酸可修饰不同的N原子
组氨酸咪唑基的修饰
色氨酸的吲哚基
▪ NBS可修饰吲哚基，但酪氨酸干扰 ▪ HNBB，KoshlandⅠ专一水溶性差 ▪ 4－硝基苯硫氯, KoshlandⅡ专一性强 ▪ 注意修饰时对巯基保护
位点特异性突变
▪ 通过寡核苷酸介导的基因突变 ▪ 盒式突变或片段取代突变 ▪ 利用聚合酶链反应（PCR）,以双链
DNA为模板进行的基因突变
寡核苷酸介导的基因突变
▪ 是在含有突变序列的寡核苷引物介导下 进行的
▪ 几种方法： 基于抗生素抗性回复的突变方法 基于去除特定限制酶切位点的突变 利用PCR产生定点突变
酶的表面化学修饰－大分子修饰
▪ 可溶性大分子可通过共价键连于蛋白 质表面，形成覆盖层
▪ PEG, PVP,PAA,葡聚糖，环糊精，CMC， 肝素等
▪ 分子量500－20000u的PEG，是两亲分 子，具有生物相容性
聚乙二醇修饰蛋白质
▪ PEG 修饰时多采用单甲氧基聚乙二醇
聚乙二醇修饰蛋白质
▪ 例：聚乙二醇修饰的L-天冬酰胺酶降 低甚至消除酶的抗原性，提高了抗蛋 白质水解的能力，延长体内半衰期， 提高药效
羧基的化学修饰
▪ 水溶性的碳二亚胺是特异修ຫໍສະໝຸດ Baidu酶的 COOH，也是最普遍的标准方法
▪ 羧基的甲酯化
氨基的化学修饰
▪ ε－NH2具有亲核性 ▪ 烷基化： 修饰剂有：卤代乙酸、芳基卤
（DNFB)、芳香族磺酸（TNBS） ▪ 烷基化：与醛酮还原烷基化 ▪ 蛋白质序列分析中的 DNS
精氨酸胍基的修饰
色氨酸的吲哚基
酶的亲和修饰
▪ 亲和标记 酶的侧链的化学修饰存在着多个同 类残基与修饰剂反应的问题，对某 个残基的选择性修饰较困难，因此 开发了亲和标记试剂。
亲和标记
▪ 酶的位点专一性修饰时根据酶和底物的 亲和性，修饰剂不仅具有对作用基团的 专一性，而且具有被作用部位的专一性。 这类化学修饰称为亲和标记，这类修饰 剂称为位点专一性抑制剂。
食品生物技术精品课程
▪主讲：刘常金
第二章蛋白质修饰
内容
▪ 酶蛋白的化学修饰 ▪ 酶蛋白化学修饰的应用 ▪ 蛋白质改造的分子生物学途径
酶蛋白的化学修饰
▪ 酶蛋白侧链的修饰 ▪ 酶蛋白的亲和修饰 ▪ 酶的化学交联
酶蛋白侧链的修饰
▪ 羧基的化学修饰 ▪ 氨基的化学修饰 ▪ 精氨酸胍基的化学修饰 ▪ 巯基的化学修饰 ▪ 组氨酸咪唑基的化学修饰
随机突变
▪ DNA shuffling技术
Thanks !
在结构与功能研究中的应用
▪ 研究酶空间结构 ▪ 确定氨基酸残基的功能 ▪ 测定酶分子中某种氨基酸的数量
在医药和生物技术中的应用
▪ 问题的提出：
▪ 医药方面：异体蛋白质的抗原性受蛋白 质水解酶水解和抑制作用，在体内半衰 期短、稳定性差、不能在靶部位聚集， 不在最适pH值，影响使用效果
▪ 生物技术领域：工业用酶遇酸、碱、有 机溶剂变性、不耐热、易受产物和抑制 剂抑制。