化学发光免疫分析的基本原理及其技术类型
化学发光免疫分析原理
化学发光免疫分析原理化学发光免疫分析（Chemiluminescence Immunoassay，CLIA）是一种基于化学发光原理的免疫分析技术，它结合了免疫学和化学发光技术的优势，具有高灵敏度、高特异性和广泛的应用前景。
本文将从化学发光原理、免疫分析方法和应用领域等方面对化学发光免疫分析原理进行介绍。
化学发光原理。
化学发光是指在化学反应中产生的光。
化学发光反应的基本原理是两种或两种以上的物质在一定条件下发生反应，通过激发态的分子或离子产生的能量转移到基态的分子或离子上，从而产生光。
化学发光反应是一种放热反应，通常需要一种催化剂来促进反应的进行。
在化学发光免疫分析中，化学发光物质通常被标记在抗体或抗原上，当靶分子与标记的抗体或抗原结合时，激发化学发光反应，产生光信号。
免疫分析方法。
化学发光免疫分析是一种基于免疫学原理的分析方法，它利用抗体与抗原特异性结合的原理，通过检测免疫复合物的形成来定量或半定量地测定样品中的靶分子。
在化学发光免疫分析中，通常使用化学发光仪器来检测化学发光信号的强度，进而确定样品中靶分子的浓度。
与传统的免疫分析方法相比，化学发光免疫分析具有灵敏度高、特异性强、操作简便、快速等优点，因此在临床诊断、药物检测、环境监测等领域得到了广泛的应用。
应用领域。
化学发光免疫分析技术在临床诊断、药物检测、环境监测等领域有着广泛的应用。
在临床诊断中，化学发光免疫分析可以用于检测肿瘤标志物、感染性疾病标志物、内分泌激素等，具有高灵敏度和高特异性，可以帮助医生进行早期诊断和疾病监测。
在药物检测中，化学发光免疫分析可以用于药物代谢产物的检测和药物浓度的监测，有助于指导临床用药。
在环境监测中，化学发光免疫分析可以用于检测水质、空气质量、土壤污染等，具有快速、准确的优势。
总结。
化学发光免疫分析是一种灵敏度高、特异性强的免疫分析技术，具有广泛的应用前景。
通过对化学发光原理、免疫分析方法和应用领域的介绍，我们可以更好地理解化学发光免疫分析的原理和特点，为其在临床诊断、药物检测、环境监测等领域的应用提供理论基础和技术支持。
化学发光免疫分析技术【检验科】--ppt课件
是目前世界公认先进的标记免疫测定技术，化学发光
免疫分析技术具有高度的准确性和特异性，成为检验方法 中最为重要的技术之一。化学发光免疫分析技术作为疾病 诊断的主要手段已被广泛用于机体免疫功能、传染性疾病 、内分泌功能、肿瘤标志物、性激素、甲状腺功能等方面 的体外诊断实验中。
化学发光免疫分析的优势
• 灵敏度高
• 参考范围： FT3：2.3—4.0pg/mL FT4：0.6—1.2ng/dL
• 临床意义：
血清FT3和FT4升高：⑴甲亢；⑵低T3综合征，由于5’脱碘酶受抑制，T4外 周脱碘作用障碍使FT4升高；⑶甲状腺素不敏感综合征， FT3和FT4升 高，而无甲亢表现；⑷某些药物，胺碘酮、肝素等可使FT4升高；FT3 适合于甲亢和左旋甲状腺素治疗中药物是否过量的判断。
电化学发光免疫分析示意图
电化学发光免疫测定示意图
标记磁颗粒在电场中发光工作示意图
目前我院最新引进的迈瑞CL-2000i 全自动化学发光免疫分析系统 主要以化学发光酶免疫分析为主。拥有国内完全自主知识产权，它的 酶促化学发光是目前免疫诊断中最灵敏的化学发光体系之一，其核心 性能达到了国际同类产品先进水平。
• 化学发光免疫分析仪是通过检测患者血清内待测物质从而 对人体进行免疫分析的医学检验仪器。将定量的患者血清 和辣根过氧化物（HRP）加入到固相包被有抗体的白色不 透明微孔板中，血清中的待测分子与辣根过氧化物酶的结 合物和固相载体上的抗体特异性结合。分离洗涤未反应的 游离成分。然后，加入鲁米诺Luminol发光底液 ，利用化 学反应释放的自由能激发中间体，从基态回到激发态，能 量以光子的形式释放。此时，将微孔板置入分析仪内，通 过仪器内部的三维传动系统，依次由光子计数器读出各孔 的光子数。样品中的待测分子浓度根据标准品建立的数学 模型进行定量分析。最后，打印数据报告，以辅助临床诊 断。
化学发光免疫分析
化学发光免疫检测技术临床应用：
1、甲状腺功能类：
T3 、T4、THS、FT3、
FT4、rT3、TG、T-PO 新生儿筛查：T4 sTSH
2、性腺激素类：
HCG、ß-HCG、FSH、
LH、E2、E3、PRL、P、 T、GH等
3、肿瘤检测：
CEA、AFP、Fe、PSA、
CA125、CA153、CA199 CA50、CA211、CA724
肌钙蛋白I的临床意义
• 特异性强、确诊率高
诊断急性心肌梗塞特异性 > 98 % 对极轻微的心肌创伤都能检出 体内周期长，对外地病人延误求诊亦能诊断
•ห้องสมุดไป่ตู้灵敏度低
急性心梗发病后6 h才出现，应与肌红 蛋白一同使用
肌钙蛋白I升高即可确诊为急性 心肌梗塞，及时得到治疗
胸痛
肌钙蛋白I
> 8h
+
急性心梗 随访
4、心血管：CK-MB、BNP、Tn-I、 Myoglobin 5、贫血类：铁蛋白、Vite B12、叶酸 6、药物浓度：地高辛、洋地黄、托普霉素 可马西平、苯巴比妥、等 7、糖尿病及代谢：胰岛素、C-肽、PTH 8、过敏源类：过敏源筛选、总过敏源 9、传染病：肝炎系列、风疹、弓形体 10、其他：皮质醇、还有很多待开发项目。
心血管系统:
如何能
更快 更准确
更全面的
诊断AMI
诊断急性心肌梗塞有一定难度
• 一半有不稳定胸口窒息痛的病人，入 院时心电图并不典型。 时心电图并不能典型归类
•
病人再发梗塞诊断困难
导致不能及时诊断AMI 延误及时治疗、护理
•
临床需要
尽早准确诊断AMI方法
T
肌肉组织
化学发光系统工作原理与应用
化学发光系统工作原理与应用化学发光系统工作原理与应用化学发光免疫分析（CLIA）原理与应用化学发光免疫分析(Chemiluminescence analysis,CLIA)诞生于1977年。
根据放射免疫分析的基本原理，将高灵敏的化学发光技术与高特异性的免疫反应结合起来，建立了化学发光免疫分析法。
CLIA具有灵敏度高、特异性强、线性范围宽、操作简便、不需要十分昂贵的仪器设备等特点。
CLIA应用范围较广，既可检测不同分子大小的抗原、半抗原和抗体，又可用于核酸探针的检测。
CLIA与放射免疫分析(RIA)、荧光免疫分析(IFA)及酶免疫分析(EIA)相比，具有无辐射、标记物有效期长并可实现全自动化等优点。
CLIA为兽医、医学及食品分析检测和科学研究提供了一种痕量或超痕量的非同位素免疫检测手段。
1.化学发光免疫分析技术的基本原理化学发光免疫分析含有免疫分析和化学发光分析两个系统。
免疫分析系统是将化学发光物质或酶作为标记物，直接标记在抗原或抗体上，经过抗原与抗体反应形成抗原一抗体免疫复合物。
化学发光分析系统是在免疫反应结束后，加入氧化剂或酶的发光底物，化学发光物质经氧化剂的氧化后，形成一个处于激发态的中间体，会发射光子释放能量以回到稳定的基态，发光强度可以利用发光信号测量仪器进行检测。
根据化学发光标记物与发光强度的关系，可利用标准曲线计算出被测物的含量。
2.化学发光免疫分析法的类型化学发光免疫分析法根据标记物的不同可分为三大类，即化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析法。
2.1 化学发光免疫分析化学发光免疫分析是用化学发光剂直接标记抗体或抗原的一类免疫测定方法。
目前常见的标记物主要为鲁米诺类和吖啶酯类化学发光剂。
2.1.1 鲁米诺类标记的化学发光免疫分析：鲁米诺类物质的发光为氧化反应发光。
在碱性溶液中，鲁米诺可被许多氧化剂氧化发光，其中H2o2最为常用。
因发光反应速度较慢，需添加某些酶类或无机催化剂。
化学发光免疫标记分析技术(基本原理 )
吖啶酯化学发光系统
吖啶 酯化 学发 光系 统
CH3 N+
C=O O
CH3
CH3
N
OH-
H2O2
H+
N + H2O
HO C=O
HOO C=O
O
O
R 光子 + CO2 +
R CH3 N
O
R
CH3
OH
N
+
O
C=O
R
O
碱性磷酸酶化学发光系统
金钢烷（发光底物）及其衍生物的增敏化学发光系统
O
O OCH3
AP
免疫学检测
免疫学检测是应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、抗体、免疫细胞及其 分泌的细胞因子的实验手段及分子生物学技术在免疫学研究中的应用。它包 括：
抗原抗体的检测技术 免疫细胞的检测 细胞因子的检测 免疫相关基因分析 免疫标记技术 免疫PCR(IM-PCR)技术 杂交瘤技术与T细胞克隆技术
免疫分析标记技术的发展
放免 酶免 发光
60年代 70年代 90年代
化学发光
化学发光：由于化学反应（通常是氧化）底物从基态跃迁为激发态，激发态返回基态时， 跃迁能量以光子形式释放的现象。
吸收光谱
物质激发态
吸
放
能
能
物质基态 光谱产生过程基本原理
发射光谱
化学发光免疫分析技术
化学发光免疫分析技术是将化学发光体系与免疫反应相结合，用于检测微量抗原或抗体的一种新 型标记免疫测定技术。
酶标
荧光
放免
发光
几种标记/检测技术线性范围的比较
化学发光免疫分析技术的优越性
试剂有效期长：有效期可长达1年以上，放射免疫分析由于放射性同位素的衰变，一般有效期只有一个月， 而酶免的底物贮存性差，都无法与化学发光相比，有效期长可以降低使用成本，利于推广应用。
化学发光免疫分析原理
化学发光免疫分析原理
化学发光免疫分析是一种常用的生物分析技术，其原理是利用化学发光反应检测目标分析物。
该技术主要应用于生命科学研究、临床诊断和药物研发等领域。
化学发光免疫分析的步骤如下：
1. 样品处理：将待测样品进行处理，通常包括样品的稀释、蛋白质提取、核酸提取等步骤，以满足后续分析的要求。
2. 特异性结合：将待测样品与特异性抗体结合，这是化学发光免疫分析的关键步骤。
特异性抗体能够与目标分析物结合，形成抗原-抗体复合物。
3. 化学发光：在抗原-抗体复合物形成后，加入一种化学发光底物，底物与复合物发生化学反应，生成激发态分子或产生紫外、可见光等发光物质。
4. 光学检测：利用光学检测系统，测量发光信号的强度或荧光信号的荧光强度。
一般情况下，强度与待测样品中目标分析物的含量成正比。
化学发光免疫分析的优点是灵敏度高、特异性强，且能够同时分析多个目标分析物。
它在临床诊断中广泛应用，例如检测某些疾病标志物、药物浓度和病原微生物等。
此外，化学发光免疫分析还可用于药物研发中的蛋白质相互作用研究、基因表达分析等。
总之，化学发光免疫分析是一种重要的生物分析技术，通过特异性抗体与荧光底物的配对应用，实现对目标分析物的定量检测，具有灵敏度高、特异性强和多重分析的优势。
化学发光免疫分析的基本原理及其技术类型
1. 化学发光剂的概念及常用的化学发光剂。 2. 化学发光免疫分析的基本原理及其技术类 型。 3. 化学发光酶免疫分析基本原理及其分离技 术。 4. 电化学发光免疫分析基本原理。 5. 化学发光免疫技术的临床应用。
4
目录
1 基本知识 2 化学发光免疫分析 3 化学发光酶免疫分析 4 电化学发光免疫分析 5 化学发光免疫技术的临床应用
5.肿瘤标记物 AFP、CEA、PSA、游离PSA、CAl9-9 、CAl25、CAl5-3等。
6．感染性疾病 衣原体抗原、尿衣原体抗原、衣原 体抗原确认、弓形体IgG抗体、弓形体IgM抗体、风 疹病毒IgG抗体、风疹病毒IgM抗体、巨细胞病毒IgG抗
体、巨胞病毒IgM抗体等。
二、 化学发光免疫技术常见的检测项目
三、技术要点
抗原抗体结合反应
结合物与游离物的分离 (磁颗粒分离技术)
化学发光反应
第三节 化学发光酶免疫分析
一、 检测原理
化学发光酶免疫分析（CLEIA）是用参与催化某一化学 发光反应的酶如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸 酶(ALP)来标记抗原或抗体，在与待测标本中相应的 抗体(抗原)发生免疫反应后，经洗涤将结合物与游离 的酶标物分离后，加入底物(发光剂)，酶催化和分解 底物发光，由光量子阅读系统接收，光电倍增管将光 信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至计算 机数据处理系统，计算出测定物的浓度。
发光剂（荧光素）经短波长入射光照射后 进入激发态，当回复至基态时发出较长 波长的可见光。
2.生物发光（bioluminescence）
发生在生物体内的发光现象，如萤火虫的发光，反应底 物为萤火虫荧光素，在荧光素酶的催化下，利用ATP产 能，生成激发态氧化型荧光素，它在回复基态时多余 的能量以光子的形式释放出来。
化学发光免疫分析
化学发光免疫分析化学发光免疫分析，也称为化学发光法或发光免疫测定法，是一种高灵敏度和高特异性的生物分析技术。
它结合了免疫学、生物学和化学的原理，利用特异性抗体与其抗原（或其他生物分子）相互作用，通过化学反应使其辐射出光信号，从而定量地检测目标物质的存在和含量。
一、化学发光免疫分析原理化学发光免疫分析原理基于化学发光原理和免疫学原理。
化学发光原理就是将化学反应的能量通过光子的辐射转换为光的能量。
免疫学原理是利用特异性免疫反应来识别和区分不同的抗原或抗体。
化学发光免疫分析技术的基本步骤如下：1.选择特异性的抗体与目标物质的结合；2.引入辐射源激活化学发光前体（例如，过氧化物或二氧化硫酞）；3.目标物质与抗体发生结合后，释放了辐射源激活前体，使其进一步分解并产生化学发光；4.测定样品中的荧光强度，用于定量分析目标物质的存在和含量。
化学发光免疫分析发出的荧光信号对于抗原-抗体的结合非常敏感和特异。
比较常见的荧光标记物包括酶（如辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、荧光染料（如荧光素和荧光素衍生物）、金纳米粒子等。
二、化学发光免疫分析的应用化学发光免疫分析的应用涉及生物分子、环境污染、中药等领域。
下面将从这些不同应用领域来介绍化学发光免疫分析技术的具体应用。
1.生物分子分析生物分子分析是化学发光免疫分析技术的主要应用领域之一。
常见的生物分子包括蛋白质、核酸、糖等。
如免疫荧光分析技术可以快速、准确地分析细胞表面分子、内部生物分子和变态反应特异性IgE。
同时，化学发光免疫分析技术可以用于患者体液中的特定免疫球蛋白或蛋白质的定量检测。
2.环境污染分析环境污染分析是化学发光免疫分析技术的另一个主要应用领域。
通过测量土壤、水、空气等样品中的污染物含量，可以快速精准地确定其存在和含量。
化学发光免疫分析技术可用于检测重金属、有机污染物、致癌物等。
该技术不仅检测灵敏，而且简便易行。
3.中药分析中药分析中常用的技术包括高效液相色谱法、气相色谱法、电化学法等。
磁微粒化学发光
一、化学发光免疫分析技术概述化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA)兴起于上世纪70年代中期，发展至今已经成为一种成熟先进的超微量活性物质检测技术，应用范围十分广泛。
该技术近10年发展迅猛，是目前推广应用最快的免疫分析方法，也是目前最先进的标记免疫测定技术，灵敏度和精确度比酶免法、荧光法高几个数量级。
二、化学发光免疫分析技术原理在化学发光免疫分析中包含两个部分，即免疫反应技术和化学发光技术。
其基本原理是免疫反应中的酶作用于发光底物，使之发生化学反应并释放出大量的能量，产生激发态的中间体。
这种激发态中间体回到稳定的基态时，可同时发射出光子。
利用发光信号测量仪器即可测量出光量子产额，该光量子产额与样品中的待测物质的量成正比，由此可以建立标准曲线并计算样品中待测物质的含量。
化学发光免疫分析技术常采用双抗体夹心法、竞争法及间接法等反应模式，如图1-3所示。
图1.双抗体夹心法图2.竞争法图3.间接法三、磁微粒在免疫学检测中的应用磁微粒是指磁性纳米粒子与无机或有机分子结合形成的可均匀分散于一定基液中具有高度稳定性的胶态复合材料。
由于磁微粒具有磁响应性，成本低、能耗少和无污染等特点，人们在磁微粒表面或通过磁微粒表面的功能基团（如氨基、羧基、巯基及环氧乙烷等）将酶、抗体、寡核苷酸等生物活性物质进行固定，可进一步用于酶的固定化、靶向药物载体、细胞分选、免疫检测、蛋白与核酸的分离纯化及杂交检测等领域。
传统的免疫学检测多以酶标板为固相载体，悬浮性磁微粒作为载体具有较高的比表面积，能够更为充分地与样品反应，加之外加磁场的灵活应用，较之酶标板载体具有更高的灵敏度、更快的检测速度和更好的重复性等优点，目前已被广泛应用于生物及医学检测等领域。
四、磁微粒化学发光免疫分析技术介绍磁微粒化学发光免疫分析技术综合了磁微粒载体技术和化学发光免疫检测技术，使测量结果更准确，更稳定。
●磁微粒化学发光--双抗体夹心法：待测抗原同荧光素标记的抗体及酶标抗体结合形成“三明治”结构的复合物。
化学发光免疫分析方法的种类
【化学发光免疫分析种类】
1.直接化学发光
A 吖啶酯发光
原理：纳米磁珠分离后的吖啶酯标记的抗原抗体复合物，在含H2O2的强酸、强碱激发底物的作用下，快速发出可见光，通过光电倍增管进行光子计数，相对光强度RLU与待测抗原浓度成函数关系。
特点：发光过程在5秒内完成，激发发光程序简单，测试速度快，但发光标记物吖啶酯在缓冲液中不稳定，易水解，影响试剂稳定性。
代表仪器：拜耳公司的ACS180。
【化学发光免疫分析种类】
B 异鲁米诺发光
原理：发光过程和原理与吖啶酯完全相同，但激发发光速度更快，在3秒内完成整个过程，测试速度最快，而且克服了吖啶酯在缓冲液不稳定、易水解的缺点。
代表仪器：德国Byk–Sangtec公司的LIAISON
C 电化学发光
原理：纳米磁珠分离后的三联吡啶钌标记的抗原抗体复合物，在三丙胺的作用下，发生氧化还原反应，发出可见光，通过光电倍增管进行光子计数，相对光强度RLU与待测抗原浓度成函数关系。
特点：激发发光过程复杂，时间长，每一个发光过程约需25秒，测试速度慢。
代表仪器：瑞士ROCHE公司的ELECSYS 1010和ELECSYS 2010。
【化学发光免疫分析种类】
•2、酶促化学发光或持久发光
•原理：酶促化学发光一般是将碱性磷酸酶标记在抗体或抗原上，纳米磁珠分离后的碱酶标
记的抗原、抗体复合物在发光底物AMPPD作用下，持续发出可见光，通过光电倍增管读取光信号。
•特点：激发发光时间长，测试速度慢，因为酶易受环境温度的影响，试剂的稳定性不如直接化学发光好。
•代表仪器：美国贝克曼公司的ACCESS，雅培公司的AXSYM。
化学发光免疫分析技术
化学发光免疫分析技术化学发光免疫分析技术（Chemiluminescence Immunoassay，简称CLIA）是一种用于检测物质浓度的生化分析技术。
该技术利用免疫反应，在荧光底物的作用下产生可见光发射，从而实现对物质的检测和定量分析。
化学发光免疫分析技术的基本原理是将待测物与对应的抗原或抗体结合，形成免疫复合物。
然后，将荧光标记的抗体或抗原加入到体系中，与免疫复合物结合。
接下来，加入荧光底物，在适当的条件下，底物被激活，产生化学反应，释放出能量，从而形成荧光。
荧光信号可以通过荧光仪进行检测和定量分析。
荧光仪通过光电倍增管等装置将荧光信号转化为电信号，经过控制和处理，最终得到物质的浓度。
化学发光免疫分析技术的优势在于其灵敏度高。
由于发光底物的特殊性质，即使在低浓度下，也能产生明显的发光信号。
此外，化学发光免疫分析技术的特异性强，能够准确识别目标物质，避免误判。
另外，与其他传统的免疫分析方法相比，化学发光免疫分析技术反应速度快，可以在较短的时间内得到结果。
此外，操作简单，无需复杂的设备和技术，具有很高的实用性。
化学发光免疫分析技术在医学诊断中有着广泛的应用。
比如，可以用于检测血清中肿瘤标志物的浓度，从而实现早期诊断和预测疾病进展的风险。
此外，化学发光免疫分析技术还可以应用于感染性疾病的快速诊断，如艾滋病、结核病等。
此外，化学发光免疫分析技术还被广泛应用于生物制药工业中的药物分析。
在食品安全领域，也可以利用化学发光免疫分析技术检测食品中的有害物质，从而保障食品的质量安全。
总之，化学发光免疫分析技术是一种灵敏、特异、操作简单的生化分析技术。
在医学诊断、药物检测、食品安全检测等领域有着广泛的应用前景。
随着技术的不断发展和创新，化学发光免疫分析技术将进一步完善，并在更多的领域发挥重要的作用。
化学发光免疫分析原理
化学发光免疫分析原理化学发光免疫分析（Chemiluminescence Immunoassay，简称CLIA）是一种基于化学发光原理的免疫分析技术，广泛应用于临床诊断、生物医药、环境监测等领域。
它以化学发光信号作为检测信号，具有高灵敏度、高特异性、快速、简便等优点，成为现代生物医学领域中不可或缺的重要技术手段。
化学发光免疫分析的原理主要包括以下几个方面：1. 免疫反应。
免疫反应是化学发光免疫分析的基础。
它利用抗原与抗体之间的特异性结合作用，通过抗原-抗体反应来实现对待测物的定量或定性分析。
在化学发光免疫分析中，待测物与标记物（如酶标记物或荧光标记物）结合形成免疫复合物，这一步是整个分析过程中至关重要的一环。
2. 化学发光反应。
化学发光免疫分析的核心在于化学发光反应。
当免疫复合物形成后，引入化学发光底物，底物在催化剂的作用下发生化学反应，产生激发态的反应产物。
这些激发态的反应产物在退激发过程中释放出光子，产生化学发光信号。
这种化学发光反应具有高度特异性和灵敏度，能够实现对微量物质的检测。
3. 光信号检测。
光信号检测是化学发光免疫分析中的最后一步。
通过光电检测器对化学发光反应产生的光信号进行检测和测量，从而实现对待测物的定量分析。
光信号的强弱与待测物的浓度成正比，因此可以通过测量光信号的强度来确定待测物的浓度。
化学发光免疫分析技术在临床诊断中有着广泛的应用。
它可以用于检测肿瘤标志物、感染性疾病、激素水平等多种生物标志物，具有高灵敏度和高特异性，对于早期诊断和疾病监测具有重要意义。
此外，化学发光免疫分析技术还被广泛应用于生物医药研究、药物残留检测、环境监测等领域。
总的来说，化学发光免疫分析技术以其高灵敏度、高特异性、快速、简便等优点，成为现代生物医学领域中不可或缺的重要技术手段。
它的原理简单清晰，操作方便快捷，适用于各种生物样本的分析，为临床诊断和生物医学研究提供了有力的技术支持。
随着科学技术的不断发展，化学发光免疫分析技术必将在更多领域展现出其巨大的应用潜力。
(完整版)化学发光免疫分析技术原理简介(精)
化学发光免疫分析技术原理简介20 世纪60 年代即有人利用化学发光法测定水样中细菌含量和菌尿症患者尿液检查.1977 年Halman 等将化学发光系统与抗原抗体反应系统相结合，创建了化学发光免疫分析法，保留了化学发光的高度灵敏性，又克服了它特异性不足的缺陷。
近年来对技术与仪器的不断改进，使此技术已成为一种特异，灵敏，准确的自动化的免疫学检测方法。
1996 年推出的电化学发光免疫技术,在反应原理上又具有一些新的特点。
这两种技术目前已在国内一些大型医院实验室用于常规免疫学检验。
一、化学发光免疫分析法化学发光免疫分析法( chemiluminescence immunoassay , CLlA) 是把免疫反应与发光反应结合起来的一种定量分析技术，既具有发光检测的高度灵敏性，又具有免疫分析法的高度特异性。
在CLIA中，主要有两个部分,即免疫反应系统和化学发光系统。
免疫反应系统与放射免疫测定中的抗原抗体反应系统相同化学发光系统则是利用某些化合物如鲁米诺( luminol) 、异鲁米诺（isolu—minol) 、金刚烷( AMPPD）及吖啶酯（ AE）等经氧化剂氧化或催化剂催化后成为激发态产物，当其回到基态时就会将剩余能量转变为光子，随后利用发光信号测量仪器测量光量子的产额。
将发光物质直接标记于抗原(称为化学发光免疫分析)或抗体上(称为免疫化学发光分析），经氧化剂或催化剂的激发后，即可快速稳定的发光，其产生的光量子的强度与所测抗原的浓度可成比例。
亦可将氧化剂（如碱性磷酸酶等）或催化剂标记于抗原或抗体上，当抗原抗体反应结束后分离多余的标记物，再与发光底物反应,其产生的光量子的强度也与待测抗原的浓度成比例。
发光免疫分析的灵敏度高于包括RIA 在内的传统检测方法，检测范围宽，测试时间短,仅需30 — 60min 即可。
试剂货架寿命长，稳定性好，具有大规模自动化测试的功能。
这项技术发展很快，已有许多厂商生产各具特色的测定仪器与配套试剂。
化学发光免疫标记分析技术(基本原理)
04
化学发光免疫标记分析流程
样本准备
01
02
03
样本采集
采集待检测样本，如血液、 尿液等生物样本。
样本处理
对样本进行离心、过滤等 处理，以去除杂质和不必 要的成分。
样本标记
将待检测的抗原或抗体与 荧光物质、酶等标记物结 合，以便后续检测。
加样与反应
加样
将处理后的样本加入化学 发光免疫分析的反应体系 中。
应用领域
临床诊断
环境监测
用于检测肿瘤标志物、激素、传染病 标志物等，为疾病的早期诊断、病情 监测和预后评估提供有力支持。
用于检测环境中的有害物质，如重金 属、有机污染物等，为环境保护和公 共卫生提供技术支持。
生物医药
用于药物研发、药代动力学研究、蛋 白质组学和基因组学分析等领域，加 速新药研发和生物医学研究进程。
提高特异性
针对不同目标分子开发更特异的标记物和探针，提高检测的准确性和 可靠性。
多指标检测
发展多指标联检技术，实现多种生物分子的同时检测，提高检测效率 和应用范围。
THANKS
感谢观看
该技术涉及多个步骤，操作相对 复杂，需要专业人员操作和经验 积累。
化学发光反应过程中可能产生有 害的化学物质，需要采取相应的 安全措施。
技术改进与发展方向
降低成本
通过研发更经济的试剂和仪器，降低化学发光免疫标记技术的成本， 使其更广泛地应用于临床和科研领域。
简化操作
优化试剂和仪器设计，简化操作流程，提高检测效率，降低对专业人 员的依赖。
化学发光反应的能量来源
化学发光反应的能量来源主要是化学能，即通过化学反应释 放的能量。
在化学发光免疫标记分析技术中，通常使用化学能作为能量 来源，通过特定的化学反应激发发光物质，使其发出可见光 。
化学发光免疫分析技术
一些化学反应能释放足够的能量把参加反应的物质 激发到能发射光的电子激发态，若被激发的是一个 反应产物分子，则这种反应过程叫直接化学发光。
反应过程可简单地描述如下：
A + B C* + D C* C + h1
1.2 化学发光的种类
间接化学反应发光
若激发能传递到另一个未参加化学反应的分子F 上，使F分子激发到电子激发态，F分子从激发态 回到基态时发光，这种过程叫间接化学发光。 反应过程可表示如下：
immunoassay， ECLIA
• 在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应， 用电化学发光剂三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+标记Ab，通 过Ag-Ab反应和磁珠分离技术，根据三联吡啶钌在 电极上发出的光强度对待测的Ag或Ab进行定量/定 性。 电化学发光、免疫分析检测、生物素-抗生素、固相磁 珠技术
局限性：方法选择性较差、发光体系相对较少、仪器 商品化不够
A. 吖啶酯
代表性物质：光泽精 (lucigenin)
CH3 N
+
CH3
Oxidation OH N+ CH3 .2NO3
-
N
NMA
*
O
+
LIGHT
N-METHYLACRIDONE (NMA)
Lucigenin
max = 445 nm
氧化剂：H2O2 还原剂：乳酸 尿酸 抗坏血酸
催化剂：过渡金属离子、酶
⑤在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性。
2.2 化学发光剂种类 直接化学发光剂，间接化学发光剂
直接化学发光剂 直接化学发光剂在发光免疫分析过程中不需酶的催 化作用，直接参与发光反应，它们在化学结构上有 产生发光的特有基团，可直接标记抗原或抗体。
化学发光免疫分析技术
化学发光免疫分析技术化学发光免疫分析技术（Chemiluminescence Immunoassay，CLA）是一种利用化学发光原理检测生物分子的技术。
化学发光是指在一定条件下，某些物质能够通过化学反应，产生电子激发，从而在较高的能级上积累能量，最终能通过放射电磁波而发光的现象。
在CLA中，生物分子（如蛋白质、细胞、激素等）与特异性抗体结合后，通过化学发光原理检测分析生物样本中的目标分子。
CLA技术具有非常高的敏感度、专一性和准确性，被广泛应用于学术研究、临床诊断、环境监测和食品安全等领域。
CLA技术的原理CLA技术主要利用化学发光原理，通过测定分子之间的化学反应发生前后所产生的能量变化以及电子跃迁发光的特性，从而进行分析定量。
其基本原理是：利用亲和层析法、固相抗体法、免疫层析法或酶联免疫吸附法等方法，将特异性的抗体固定在固相载体（如聚苯乙烯微球、硅胶等）上形成抗体-抗原复合物；再将待测样品加入反应体系中，与载体上的抗体结合，形成生物活性复合物；接下来，加入发光底物，在过氧化物酶（POD）或碱性磷酸酶（ALP）的催化下，在化学反应的作用下，引发发光反应，利用光学检测仪器测定发光值，并与标准品进行比较，计算出待测样品中抗原的浓度。
CLA技术的优势CLA技术作为一种高灵敏、高稳定、高特异性的检测方法，具有以下优势：1. 高灵敏度：CLA技术的灵敏度高于其他检测方法，能够检测到极低浓度的生物分子，特别是针对低丰度蛋白质、代谢产物、激素或其他生物标志物，其敏感度更是达到了pg/mL 级别。
2. 高特异性：CLA技术具有极高的特异性，可以区分目标分子和其他非靶分子，降低了假阳性和假阴性的风险，有利于准确判断样本中的目标分子。
3. 高通量：CLA技术可以进行高通量检测，同时检测多个样品，提高了检测效率和样本处理量。
4. 稳定可靠：CLA技术执行简便，无需高端仪器和特殊要求，检测结果稳定可靠，不受样品污染和干扰的影响。
化学发光免疫分析技术原理和类型
化学发光免疫分析技术原理和类型化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,CLIA),是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。
是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。
1、化学发光免疫分析原理化学发光免疫分析包含两个部分, 即免疫反应系统和化学发光分析系统。
化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化, 形成一个激发态的中间体, 当这种激发态中间体回到稳定的基态时, 同时发射出光子(hM) , 利用发光信号测量仪器测量光量子产额。
免疫反应系统是将发光物质(在反应剂激发下生成激发态中间体) 直接标记在抗原(化学发光免疫分析) 或抗体(免疫化学发光分析) 上, 或酶作用于发光底物。
2、化学发光免疫分析的类型化学发光免疫分析法以标记方法的不同而分为两种:(1)化学发光标记免疫分析法(2)酶标记、以化学发光底物作信号试剂的化学发光酶免疫分析法2. 1 化学发光标记免疫分析化学发光标记免疫分析又称化学发光免疫分析(CL IA ) , 是用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析方法。
常用于标记的化学发光物质有吖啶酯类化合物——acridin ium ester (A E) , 是有效的发光标记物[ 3 ] , 其通过起动发光试剂(N aOH2H2O 2 ) 作用而发光, 强烈的直接发光在一秒钟内完成, 为快速的闪烁发光(见图1)。
吖啶酯作为标记物用于免疫分析, 其化学反应简单、快速、无须催化剂; 检测小分子抗原采用竞争法(见图2) , 大分子抗原则采用夹心法(见图3) , 非特异性结合少, 本底低; 与大分子的结合不会减小所产生的光量, 从而增加灵敏度。
2. 2 化学发光酶免疫分析从标记免疫分析角度, 化学发光酶免疫分析( chem ilum inescen tenzym e imm unoassay,CL E IA ) , 应属酶免疫分析, 只是酶反应的底物是发光剂, 操作步骤与酶免分析完全相同[ 5 ]: 以酶标记生物活性物质(如酶标记的抗原或抗体) 进行免疫反应, 免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物, 在信号试剂作用下发光, 用发光信号测定仪进行发光测定。
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③激发态分子必须具有一定的化学发光量子效率释放 出光子, 或者能够转移它的能量给另一个分子使之进 入激发态并释放出光子
二.化学发光剂
在化学发光反应中参与能量转移并最终以发射光子的形 式释放能量的化合物称为化学发光剂或发光底物。
作为化学发光免疫技术的化学发光剂应符合以下几个条 件：
发光的量子产率高 物理-化学特性要与被标记或测定的物质相匹配 能与抗原或抗体形成稳定的偶联结合物 其化学发光常是氧化反应的结果 在所使用的浓度范围内对生物体没有毒性
常用的化学发光剂或发光底物有 1.直接化学发光剂 2.酶促反应的发光底物 3.电化学发光剂
三、技术要点
抗原抗体结合反应
结合物与游离物的分离 (磁颗粒分离技术)
化学发光反应
第三节 化学发光酶免疫分析
一、 检测原理
化学发光酶免疫分析（CLEIA）是用参与催化某一化学 发光反应的酶如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸 酶(ALP)来标记抗原或抗体，在与待测标本中相应的 抗体(抗原)发生免疫反应后，经洗涤将结合物与游离 的酶标物分离后，加入底物(发光剂)，酶催化和分解 底物发光，由光量子阅读系统接收，光电倍增管将光 信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至计算 机数据处理系统，计算出测定物的浓度。
一个电子而发生氧化反应。
第二节 化学发光免疫分析
一、 检测原理
用化学发光剂（如吖啶酯）直接标记抗体(抗原)，与 待测标本中相应的抗原(抗体)和磁颗粒性的抗体 （抗原）发生免疫反应后，通过磁场把结合状态 （沉淀部分）和游离状态的化学发光剂标记物分离 开来，这时只需加入氧化剂（H2O2）和NaOH使成碱 性环境，吖啶酯在不需要催化剂的情况下分解、发 光。由集光器和光电倍增管接收、记录单位时间内 所产生的光子能，可从标准曲线上计算出待测抗原 (抗体)的含量
2.酶促反应的发光底物
是利用标记酶的催化作用，使发光剂（底物）发光。 目前化学发光酶免疫技术中常用的酶有辣根过氧 化物酶（HRP）和生物，ALP的发光底物 为金刚烷（AMPPD）
（1）鲁米诺或其衍生物
鲁米诺在碱性条件下可被一些氧化剂氧化，发生化 学发光反应，辐射出最大发射波长为425nm的光。
3.化学发光
某些物质(发光剂)在化学反应时，吸收了反应 过程中所产生的化学能，使反应的产物分子 或中间态分子中的电子跃迁到激发态，当电 子从激发态回复到基态时，以发射光子的形 式释放出能量，这一现象称为化学发光。
一个化学反应要产生化学发光现象，必须满足以下条件：
①该反应必须提供足够的激发能, 并由某一步骤单 独提供, 因为前一步反应释放的能量将因振动弛豫 消失在溶液中而不能发光
发光剂（荧光素）经短波长入射光照射后 进入激发态，当回复至基态时发出较长 波长的可见光。
2.生物发光（bioluminescence）
发生在生物体内的发光现象，如萤火虫的发光，反应底 物为萤火虫荧光素，在荧光素酶的催化下，利用ATP产 能，生成激发态氧化型荧光素，它在回复基态时多余 的能量以光子的形式释放出来。
碱性磷酸酶化学发光酶免疫分析双抗体夹心法原理示意图
二、方法类型
1.根据标记酶不同分类 可分为辣根过氧化物 酶标记的化学发光酶免疫分析和碱性磷酸 酶标记的化学发光酶免疫分析。前者常以 鲁米诺或其衍生物作为发光底物，后者常 以AMPPD作为发光底物。 2. 根据免疫学反应模式分类 同化学发光 免疫分析，主要有双抗体夹心法、双抗原 夹心法和固相抗原竞争法等主要模式，所 不同只是相应抗原或抗体上标记的是酶而 不是直接标记发光剂。
化学发光免疫分析双抗体夹心法原理示意图
二、方法类型
1.分离方法 常用磁颗粒分离技术，即用抗原或抗体包被磁颗粒 ，与标本中相应抗体或抗原及吖啶酯标记的抗体或 抗原通过一定模式的免疫学反应后,最终通过在磁场 中冲洗将结合到免疫复合物中的标记物和游离标记物 进行分离的技术。
2.常用的免疫学反应模式
双抗体夹心法 双抗原夹心法 固相抗原竞争法
1.直接化学发光剂
在发光免疫分析过程中不需酶的催化作用，直 接参与发光反应，它们在化学结构上有产生 发光的特有基团，可直接标记抗原或抗体。 如常用的吖啶酯（acridinium，AE） 。
吖啶酯在碱性条件下被H2O2氧化时,发出波长 为470nm的光，具有很高的发光效率，其激发
态产物N-甲基吖啶酮是该发光反应体系的发光体。
标记免疫技术
放
酶
射
免
免
疫
疫
技
技
术
术
化
荧
金
学
光
免
发
免
疫
光
疫
技
免
技
术
疫
术
技
术
第一节 基本知识
一、发光
发光是指分子或原子中的电子吸收能量后，由低能级 的基态跃迁到高能级的激发态，然后再返回到基态， 释放出的能量表现为光的发射。根据形成激发态的激 发能不同可将发光分为光照发光、生物发光和化学发 光。
1.光照发光（photoluminescence）
本章要点
1. 化学发光剂的概念及常用的化学发光剂。 2. 化学发光免疫分析的基本原理及其技术类 型。 3. 化学发光酶免疫分析基本原理及其分离技 术。 4. 电化学发光免疫分析基本原理。 5. 化学发光免疫技术的临床应用。
4
目录
1 基本知识 2 化学发光免疫分析 3 化学发光酶免疫分析 4 电化学发光免疫分析 5 化学发光免疫技术的临床应用
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前言
• 化学发光免疫技术是将具有高灵敏度的化学发光 测定技术与高特异性的抗原抗体反应相结合，用 于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸 、维生素和药物等的检测分析技术。该技术具有 特异性高、灵敏度高、分离简便、 快速、试剂无 毒、安全稳定、可自动化分析等特点，在免疫学 检验中应用广泛。
鲁米诺增强发光反应原理
（2）AMPPD
〔3-(2‘-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3“-磷酰氧基)苯1,2-二氧杂环丁烷〕〕
3．电化学发光剂
电化学发光剂是指通过在电极表面进行电化学反应而发 光的物质。如化学发光剂三联吡啶钌[Ru(bpy)3]2+和 电子供体三丙胺（TPA）在阳性电极表面可同时失去