基于液相色谱鄄串联质谱的氨基酸代谢组学方法

DOI :10.3724/SP.J.1096.2013.20743基于液相色谱⁃串联质谱的氨基酸代谢组学方法研究黄芪注射液治疗脑缺血吴宏伟1　高健2　李韶菁1　唐力英1　许海玉1　唐仕欢1　杨洪军*11(中国中医科学院中药研究所,北京100700)　2(河北医科大学药学院,石家庄071002)摘　要　建立了基于液相色谱⁃串联质谱技术的氨基酸代谢组学分析方法㊂选用Diamonsil C 18色谱柱,乙腈⁃0.1%甲酸为流动相,梯度洗脱,三重四级杆质谱检测器,MRM 扫描方式,12min 内对血浆中12种氨基酸进行定量分析㊂应用本方法对脑缺血模型和黄芪注射液的治疗作用做出评价㊂通过偏最小二乘判别分析统计发现,脑缺血12h,其血浆中的氨基酸代谢表达存在显著差异,结合载荷图及VIP 值确定丝氨酸㊁天冬氨酸㊁甘胺酸等7种脑缺血生物标识物;采用黄芪注射液治疗后,从得分图上可以看到氨基酸代谢的轨迹发生了较大变化;与脑缺血模型组比较,丝氨酸㊁天冬氨酸㊁甘胺酸等生物标识物均向正常水平趋近㊂关键词　氨基酸代谢组;液相色谱⁃串联质谱;脑缺血;黄芪注射液　2012⁃07⁃17收稿;2012⁃10⁃15接受本文系中国中医科学院自主选题研究项目(No.Z02067)资助*E ⁃mail:hongjun0420@1　引　言代谢组学是对某一生物或细胞所有低分子量代谢产物进行定性和定量分析的学科[1,2]㊂随着转化医学理念的不断深入,代谢组学的分析目标应更加具有针对性㊂从所有小分子代谢产物中筛选出与疾病具有明确相关性的目标成分群进行分析,不仅可以降低分析的难度㊁增加准确性,而且可以使找到的生物标识物更有可能应用于临床及药物的评价㊂氨基酸在脑代谢的过程中具有重要的生理功能㊂研究表明,兴奋性氨基酸的大量释放与脑缺血时神经元的损伤具有密切关系[3,4]㊂本研究建立了一种基于高效液相色谱⁃串联质谱检测血浆中多种氨基酸的分析方法㊂本方法与其它衍生化分析法比较[5,6],操作简单,分析时间短㊂在此基础上对脑缺血的模型及黄芪注射液治疗作用作了评价,脑缺血12h 后,血浆中氨基酸整体表达存在显著差异,确定了丝氨酸㊁天冬氨酸㊁甘胺酸等7种生物标识物;经黄芪注射液治疗后,从得分图上可以看到氨基酸代谢的轨迹发生了较大变化;与脑缺血模型组比较,丝氨酸㊁天冬氨酸㊁甘胺酸等生物标识物均向正常水平趋近㊂2　实验部分2.1　仪器、试剂与材料6410三重四级杆质谱(ESI ⁃QQQ/MS ,Agilent 公司);台式高速离心机(美国Labnet 公司)㊂酌⁃氨基丁酸(Gaba ),甘氨酸(Gly ),丙氨酸(Ala ),丝氨酸(Ser ),谷氨酸(Glu ),天冬氨酸(Asp ),同型半胱氨酸(Hcy ),蛋氨酸(Met ),酪氨酸(Tyr ),N ⁃乙酰天门冬氨酸(Naa ),苯丙氨酸(Phe ),色氨酸(Trp ),氘代丙烯酰胺(Acrylamide ⁃d 3,内标)标准品(Sigma 公司);甲醇(色谱纯,Fisher 公司);实验用水为Milli ⁃Q Water System (Millipore ,Bedfo ⁃rd ,MA ,ΜSA )过滤后的纯水㊂实验动物为Wistar 大鼠(雄性,体重180~220g ,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供)㊂黄芪注射液(神威药业有限公司),生产批号:10083041)㊂2.2　动物实验选取Wistar 雄性大鼠,共分为5组,分别为假手术对照组㊁脑缺血模型组㊁黄芪注射液给药组(高㊁中㊁低3个剂量),每组10只㊂脑缺血造模方法为的线栓法致局灶性脑缺血(Middle cerebral arteryocclusion,MCAO)[7]给药方法为腹腔注射给药,中剂量相当于药品说明书中标识的临床有效剂量,高剂第41卷2013年3月分析化学(FENXI HUAXUE )　研究报告Chinese Journal of Analytical Chemistry第3期344~348量为中剂量的3倍;低剂量为中剂量的1/3㊂通过预实验确定实验过程为:给药后立即进行造模实验,并根据行为学进行打分,确定有效样本,并于术后12h 后取血浆,置于-80℃冰箱备用㊂2.3　样品处理方法取已制备好的血浆样品200μL,加入内标溶液20μL(d 3⁃丙烯酰胺100mg /L),沉淀剂(乙腈)800μL,涡旋混匀,以12000r /min 离心30min,取上清液进样㊂2.4　色谱及质谱条件(1)色谱条件　Diamonsil C 18色谱柱(250mm ×4.6mm,5μm),柱温30℃㊂流动相:A 相为乙腈,B 相为0.1%甲酸,梯度洗脱程序:0~11min,10%~50%A;11~11.2min,50%~10%A㊂流速0.5mL /min,进样量10μL㊂(2)质谱条件　离子源ESI,正离子检测方式,干燥气温度(Gas Temp):350℃,干燥气流速(Gas flow):11.0L /min,雾化气压力(Nebulizer):310.28kPa,毛细管电压(Capil⁃lary current ):4000V,52nA;碰撞诱导解离电压(CID):34eV,扫描方式为多反应监测(MRM),用于定量分析的反应离子见表1㊂表1　多反应监测模式(MRM)各氨基酸的监测离子Table 1　Quantitative parent⁃daughter ions of multiple reaction monitoring序号No.名称Name分子离子Molecular ion (m /z )监测离子Monitoring ion transitions (m /z )序号No.名称Name分子离子Molecular ion (m /z )监测离子Monitoring ion transitions (m /z )1N ⁃乙酰天门冬氨酸N ⁃Acetyl ⁃L ⁃aspartic acid 176.1176.1>134.32丙氨酸Alanine,Ala 90.190.1>44.23γ⁃氨基丁酸γ⁃Aminobutyric acid 104.1104.1>87.24苯丙氨酸Phenylalanine166.3166.3>103.25酪氨酸Tyrosine 182.3182.3>1656甘氨酸Glycine,Gly76.276.2>48.27蛋氨酸D ,L ⁃Methionine,Met150.2150.2>1338天冬氨酸D ⁃Aspartic acid,Asp 134.2134.2>88.29色氨酸Tryptophan,Trp 205.2205.2>188.310丝氨酸Serine,Ser 106.1106.1>60.211谷氨酸Glutamic acid,Glu 148.2148.2>10212同型半胱氨酸Homocysteine,Hcy 136.1136.1>90.213氘代丙烯酰胺Acrylamide ⁃d 375.175.1.>58.13　结果与讨论3.1　分析条件的优化图1A 为样品的总离子流色谱图,图1B 为各化合物标品的提取离子流图㊂本实验考察了不同类型的色谱柱,包括正相硅胶色谱柱和反相C 18色谱柱,虽然正相柱对氨基酸有较强的吸附,但即便在较长的出峰时间下其分离度与反相柱比较,也并无明显改进㊂因此,最终选用反相色谱系统㊂考察了固相萃取方法㊁溶剂沉淀等方法,由于氨基酸极性较大,固相萃取保留效果差,而且考虑到样品测定的通量,最终确定乙腈沉淀法直接得到待测样品㊂质谱参数考察实验表明,正离子模式比负离子模式更灵敏,所以质谱检测采用正离子模式㊂本实验还考察了干燥气体流速(8.0~20.0L/min )㊁气体温度(300~400℃)㊁毛细管电压(3000~5000V )㊁碰撞诱导解离电压(20~120eV )对各化合物响应的影响㊂根据各化合物响应情况确定最佳参数见2.4节㊂3.2　方法学考察3.2.1　线性范围及检出限　由于所测氨基酸均为内源性组分,无法获得空白血浆溶液㊂结合氨基酸的溶解度,本实验采用纯水作为溶剂,配制标准品溶液㊂首先配制氨基酸混合标准母液(各化合物浓度约为50mg /L),按一定比例稀释成系列浓度㊂分别取各混合标准液1mL,加入20μL 内标物氘代丙烯酰胺(100mg /L),混合均匀,进样㊂各氨基酸浓度线性范围约在0.01~5.0mg /L,在信噪比(S /N =10)的条件下,各氨基酸的检出限为0.1~20μg /L㊂3.2.2　精密度及重复性考察　取中等浓度的混合标准溶液,每天进样5次,每次10μL,连续3d,各氨基酸相对峰面积的日内精密度RSD 范围在0.87%~2.5%;日间精密度为RSD 范围在1.9%~3.5%㊂取同一血浆样本,按样品制备方法平行制备5份样品,相对峰面积的RSD 在2.4%~4.3%之间㊂543第3期吴宏伟等:基于液相色谱⁃串联质谱的氨基酸代谢组学方法研究黄芪注射液治疗脑缺血　图1　血浆氨基酸代谢色谱图Fig .1　Chromatogram of amino acid metabolism in plasmaA:血浆样品总离子流图;B:各氨基酸提取离子图㊂A:Total ion current of plasma samples;B:MRM chromatograms of amino acids.3.2.3　回收率实验　由于各氨基酸为内源性物质,且生物样品中各种氨基酸含量差异较大,本实验按高㊁中㊁低3种浓度加入氨基酸混和标准溶液,中浓度水平约为样品含量的1.5~0.5倍,高浓度水平为中浓度的2倍,低浓度水平为中浓度的1/2㊂中浓度的平均回收率范围在73.1%~120.3%(RSD 为5%~12%,n =6)之间㊂3.3　氨基酸代谢谱数据处理与分析本实验共选用5组实验动物,每组取7个有效数据,共有35个有效样本㊂数据处理采用代谢组学数据处理方法[8,9]㊂采用SIMCA⁃P+12.0(Μmetrics,Sweden)软件对数据进行统计分析,以各样本所测得氨基酸类成分的含量为统计变量,采用偏最小二乘判别分析法(PLS⁃DA)进行建模分析㊂通过得分散点图(Score scatter plot)对样本进行整体评价;通过载荷图(Loading scatter plot)及各变量的VIP 值,确定生物标志物,从氨基酸代谢的角度说明脑缺血模型的生物学基础及黄芪注射液的治疗机理㊂3.3.1　脑缺血模型生物标识物的识别　图2A 为得分图,图中每个点代表一个样本㊂从图2A 可见,脑缺血模型组和假手术组区分明显,说明大鼠脑缺血12h 后,其血浆氨基酸代谢物的表达有了较明显的变化㊂图2B 为载荷图,图中每点代表一个氨基酸变量,离原点距离较远的点可能为生物标志物,进一步通过VIP 值(一般选取VIP>1)确定为生物标识物㊂表2详细列出了脑缺血12h 后其血浆氨基酸代谢的生物标识物及变化趋势,其中,生物标识物谷氨酸(Glu)和天门冬氨酸(Asp)为兴奋性氨基酸,脑缺血时由于大量兴奋性氨基酸的暴发性释放及其受体大量激活,产生 兴奋性毒性”㊂文献[10,11]表明,甘胺酸(Gly)与谷氨酸(Glu)对脑损伤具有协同毒性作用㊂　图2　偏最小二乘判别分析的得分图(A)和载荷图(B)Fig.2　PLS⁃discriminant analysis (DA)score scatter plot (A)and loading scatter plot (B)3.3.2　黄芪注射液治疗脑缺血作用的评价　黄芪注射液是临床上治疗脑缺血的一种常用中药[12,13]㊂从图3A 可见,黄芪注射液3种剂量治疗组样本非常集中,说明在3种剂量治疗下,脑缺血大鼠血浆氨基酸的代谢表达一致,具有一定的量效关系;并且药物治疗组与模型组有明显的区分,说明黄芪注射液对脑缺血模型血浆氨基酸表达具有明显的调节作用;同时药物治疗组与假手术对照组也有区别,说明药物治疗后脑缺血大鼠的血浆氨基酸的表达没有恢复正常,但是药物治疗组与假手术对照组的中心距离小于与模型组的中心距离,说明经药物治疗后,其氨基酸整体代谢情况向正常方向变化㊂由表3及图3B 可知,在3种剂量下,发现7种生物标识物与脑缺血模型的生物标识物基本一致,且变化趋势相反㊂643 分析化学第41卷表2　脑缺血血浆氨基酸生物标识物及其变化趋势Table 2　Amino acid biaomarkers in plasma after 12h of Wistar male rats subjected to middle cerebral artery occlusion变量编号Variables IDVIP 值VIP value 化合物Compounds假手术对照组Sham operation group(mg /L)脑缺血模型组Model group (mg /L)生物标识物变化趋势Trends of biomarkers4 1.288Ser1031±1391656±252↑6 1.279Asp 43.9±17.690±12↑2 1.252Gly 1016±1811453±133↑7 1.098Hcy 198±87353±77↑8 1.029Met 503±79570±87↑51.014Glu 485±138744±163↑12 1.001Trp 1225±3801705±181↑↑:Significance of t ⁃test between Sham operation group and Model group (P <0.01)图3　黄芪注射液对脑缺血血浆氨基酸代谢物的影响Fig .3　Data analysis of administration groups (High/Middle/Low dose ),model group and Sham operation groupA:偏最小二乘判别分析散点图;B:3个剂量下生物标识物的变化㊂A.PLS ⁃DA score scatter plot of data from administration groups (High/Middle/Low dose ),model group and Sham operation group.B.Different content of amino acid biomarkers between administration group (High/Middle/Low dose )and model group.表3　黄芪注射液对脑缺血模型血浆氨基酸代谢的调节作用Table 3　Amino acids responding for the distinction of administration group and model group变量编号Variables IDVIP 值(VIP value )High dose Middle dose Low dose 化合物Compounds生物标识物变化趋势Trends of biomarkers12 1.126 1.087 1.123Trp ↓6 1.122 1.084 1.115Asp ↓2 1.115 1.096 1.124Gly ↓4 1.108 1.071 1.095Ser ↓7 1.096 1.068 1.104Hcy ↓3 1.095 1.060 1.076Ala ↓81.0901.0551.065Met↓↓:Significance of t ⁃test between administration group (High/Middle/Low dose )and model group (P <0.01) 本研究建立了液相色谱⁃串联质谱的血浆氨基酸代谢组的检测方法,确定了脑缺血模型术后12h 血浆中7种氨基酸生物标识物;从调节氨基酸代谢的角度,说明了黄芪注射液治疗脑缺血的机理㊂References1　XIE Yue⁃Sheng,PAN Gui⁃Xiang,GAO Xiu⁃Mei,LIU Chang⁃Xiao.Chinese J.Anal.Chem.,2006,34(11):1644-1648谢跃生,潘桂湘,高秀梅,刘昌孝.分析化学,2006,34(11):1644-16482　Nicholson J K,Connelly J,Lindon J C,Holmes E.Nat Rev.Drug 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Chinese Materia Medica,China Academy of Chinese Medical Sciences,Beijing100700,China) 2(College of Pharmaceutical Science,Hebei University,Shijiazhuang071002,China)Abstract　An analysis method of blood amino acids metabonomics based on liquid chromatography⁃tandem mass spectrometry was developed.The samples were separated on a Diamonsil C18column using acetonitrile and water(containing0.1%formic acid)as mobile phase by gradient elution.Detection was carried out by multiple reactions monitoring(MRM)on the triple quadruple mass detector.Quantitative analysis of the12 amino acids in plasma was finished within12min.The cerebral ischemia rats and the rats treated by Huangqi injection were detected with the method.By partial least squares⁃discriminant analysis(PLS⁃DA),the results showed that there was significant difference of plasma amino acids metabolite at the12hour after cerebral ischemia operation.According to the loading scatter plot and VIP value,seven amino acid biomarkers were determined such as serine,aspartic acid,glycine,etc.The metabolic trajectory of the groups treated by Huangqi Injection changed obviously compared with the model groups.And the biomarkers such as serine, aspartic acid and glycine were approaching to the normal level.Keywords　Amino acid metabonomics;High performance liquid chromatography⁃tandem mass spectrometry; Cerebral ischemia;Huangqi injection(Received17July2012;accepted15October2012)。