胶原蛋白酶酶解牛骨胶原蛋白的动力学研究
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原 蛋 白水解 过 程 基 本 完 成 。 同一 酶 解 条 件 下 ， 长 波
室温 下 ， 原蛋 白与水形 成 凝 胶 ， 高温 度 才会 胶 提 形成 溶液 。 因此 ， 解前加 热 到 设定 的酶 解 温度 ， 酶 然
后加 入酶 液 ， 解 反 应 开 始 。牛 骨 胶 原 蛋 白 的酶 解 酶
白质 含量 ）×１０ 。 ０％
１ ３ ４ 酶解 液的全 波 长扫描 ．．
图 １ 牛骨胶原 蛋白酶解 液吸光值全 波长扫描
２ ２ 酶解动 态过 程 ．
基 于 以上分 析 ， 择 ５ ０ ｍ可 见 光 和 ２０ ｍ 紫 选 ７ｎ ３ｎ
外 ２个 波 长 ， 别 对不 同时 间 的 酶解 液 样 品进 行 吸 分
生 。在这些 牛 骨 中 ， 部 分被 用 于 骨粉 饲 料 的加 工 ， 一
究 在多 肽形 成 过 程 中的 酶解 动 态 特 性 ， 考 察 影 响 并
酶 解过 程和分 子量 分布 的 因素 。
部分牛犄角 、 牛腿 骨 等被用 于工 艺 品制作 。我 国的骨 加工业仍存 在 很 多弊 端 。畜 骨在 我 国大部 分 都用 来 生产骨胶 、 油 、 粉 等 ， 于 生 产动 物 饲料 ， 附加 骨 骨 用 其 值 都很低 。充 分 利用 当前 畜禽 骨 资 源是 当前 研究 的 热点 。胶原 蛋 白是动物 体 内含量 最大 的一种 蛋 白质 ， 将 胶原蛋 白进一 步水解 可得 到胶 原活 性多 肽 ， 可得 到 性 能更加优 良的胶原 多肽 ， 增加其 附加 值 和活性 。从 牛骨 中提取胶原蛋 白 ， 获取 天然胶 原 蛋 白及 其水 解 是
针 对从 细菌 中提 取 的胶 原 蛋 白酶 酶解 牛 骨胶原 蛋 白的动 力 学性 质 进行 研 究。通过 全 波长 扫描 和
Ｓ Ｓ Ａ Ｅ电泳， Ｄ —Ｐ Ｇ 对酶解的动态 变化及其 多肽分子量的变化 进行 了研 究 ， 考察 了温度 、 酶用量、 底物浓度等 因素 对酶 解动 态的影响， 并对酶解的过程动力学进行 了分析。结果说 明 ： 胶原蛋 白酶酶解牛 骨胶 原蛋 白得到 的 多肽分子 量分 布不均匀， 分子量大小随反应 时间的增大而减小 ； 在一定 范围内， 增大酶浓度 、 高温度 可使酶解反应更彻底 。 提 关键词 胶 原蛋 白酶 牛骨 胶 原蛋 白 胶 原多肽 酶解 动 力学 ’
动 力学的研究 十分 缺乏 。
泳仪 ；Ｄ ２ Ｋ Ｎ一 Ｃ型定氮仪；Ｄ一 真空冷冻干燥机等。 Ｆ １
１ ３ 试验 方法 ．
１ ３ １ 牛骨胶 原蛋 白的提 取 ．．
按 照文献
报道 的提取方法， 由新 鲜 牛 骨 制
备胶 原蛋 白 ， 浓度 为 ６ ｇＬ 其 ０／ 。
． ： ． 产品开发 ・ 试验研究夺
活 性多肽 的一 条重 要 途径 。将 胶 原蛋 白水 解是 一 个
ｌ 材 料 与方 法
１ １ 材 料 ．
牛 骨 ： 自于 华 中农 业 大 学 菜 市 场 ； 原 蛋 白 购 胶 酶 ： 蜡 样芽孢 杆 菌 纯化 分 离 （ ６ Ｕ ｍ ） 其 它 试 从 １５０ ／ ｇ ；
剂均 为市 售 的分析 纯 。
近年来 ， 随着 我 国养 殖 业迅 猛 发 展 ， 宰 所 产生 屠
本 文 以牛骨 制 备 得 到 的胶 原 蛋 白为 原 料 ， 用 采
从 蜡样 芽孢 杆 菌 中提 取 的胶 原 蛋 白酶 进 行 酶 解 ， 研
的副产物增多。以牛骨为例， 其约占牛体重的 １％ ～ ２
２％， ０ 即每生产 １０ｇ牛 肉就会 有 ｌ ２ｋ ０ｋ ２～ ０ ｇ的牛骨产
１ ３ ２ 牛骨胶 原蛋 白的酶解 Ｊ ．．
由凌， 业
ＭＥＡＴ Ｉ ＮＤＵＳ ＲＹ Ｔ
２ １ 年第 １ 期 ０１ １ 总 第 ３７期 ６
原蛋 白含量 越 高 。
图 １ 在 酶用 量 为 ４ ０ Ｕ ｍｇ 温度 ４ ￣ 酶 解 是 ． ／ 、 ０Ｃ、
室温 下 搅拌 ２ ， ９ ￣ 处 理 ２ ｒｎ ｈ 于 ０Ｃ热 ０ ｉ。冷 却 后 ａ 加 入蜡样 芽 孢 杆 菌 蛋 白酶 ， 别 在不 同 酶浓 度 和温 分 度条 件下 进行 反应 。反应 过 程 中 ， 隔一 定 时 间 ， 每 取 出样 品液 。酶 解 结束 后 ，０ 灭 酶 １ｍｎ 待 降至 室 ９℃ ０ ｉ，
２ 结 果 与 分 析
２ １ 酶解 液 吸光值 全波 长扫 描 ．
速下降， 说明胶原蛋 白酶解迅速 ； 在反应时间为 ２～
４， ｈ 吸光值 的变化 率减 慢 ， 明原 液 中胶 原 蛋 白 的含 说 量 进 一步下 降 ， 由胶 原 蛋 白断 裂 生 成 多 肽 的 速 率 下 降； 当反应 时 间为 ８ ｈ以后 ， 吸光 率 变 化很 小 ， 明胶 说
３ ｍｉ。在 波长 ５ ０ ｍ 处 测 定 吸光 度 值 。按 线 性 回 ０ ｎ ４ｎ
—
２ ２
１ １
０
０
０ ｎ 寸 Ｉ ｎ 卜 。 。 ０ － ｔｑ ｎ ＿ ＂ 寸
罱 器 罱导荨尊 景
＾（ｎ ） ｍ
暑
归方 程计 算 多肽浓 度 ｃ ｍｇｍ ） （ ／Ｌ。 可溶 性 多肽 得 率 ＝（ 清 液 中多 肽含 量 ／ 蛋 上 总
ｔｏ ｎ ｅ ｅ ａ ｕ ｅ ｉｃ ｅ ｓｎ ． ｉｎ ａ ｄ ｔ ｍｐ ｒ ｔ ｒ ｎ ｒ ａ ｉ ｇ
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光值 ， 符合胶 原蛋 白的特性 。
３
取５ ｍＬ样 品 溶 液 ， 入 ５ ５ （ ｗ ） 氯 加 ｍＬ１％ Ｗ／ 三 醋酸 （ Ｃ 水 溶 液 ， 匀 后 静 置 １ｍｎ４００／ ｉ Ｔ Ａ） 混 ０ ｉ， ０ ｒｍｎ 离心 １ｍｉ， 清 液 稀 释 至 １—１ｍｇｍ ０ ｎ上 ０ ／ Ｌ浓 度 的 溶 液， 取稀 释液 １ Ｌ加入 ４ Ｌ双 缩脲 试 剂 ， 匀 ， 置 ｍ ｍ 混 静
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是一 个复 杂 的化学 过程 ， 在酶 的作用 下 ， 原 蛋 白分 胶 子 的肽键 发生 断裂 ， 生成 分子 质 量 较小 的多 肽 ， 由于
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变化 。
酶解 液 中 ， 原 多 肽 的分 子 量 分 布 和平 均 分 子 胶 量 用 Ｓ Ｓ— Ａ Ｅ进行 测 定 。浓 缩 胶 浓 度 为 ６ ， Ｄ ＰＧ ％ 分
离胶 浓度 为 １ ％ 。 ５
Biblioteka Baidu
图 ２是 在 酶用 量 为 ４ ０Ｕ ｍｇ 温度 为 ４ ℃ 、 ． ／ 、 ０ 波 长为 ２ ０ ｍ下 ， ３ｎ 酶解 液 的 吸 光值 随酶 解 时 间 的变 化 情 况 。 由图可 知 ， 在反 应 开始 的前 ２ ｈ内 ， 吸光 值 迅
２１ ０ １年第 １ 期 １ 总第 ３ ７期 ６
ＭＡ ＤＳＲ ＥＴＮＵＴＹ Ｉ
由 业 凑工
． ’ ． 。 发 ． ｌ 产品开 ，
．
试 研 究 ’验 Ｖ ｕ，
胶 原 蛋 白酶 酶 解 牛 骨 胶 原 蛋 白 的 动 力 学 研 究
刘丽莉
摘 要
杨协力 河南科技 大学食品与 生物 工程 学院 河南洛 阳 ４ １０ ７０３
用分 光光 度计 对离 心后 的 酶解 液进 行 全 波 长扫
描， 得到 各 波 长下 水 解 液 的吸 光 度 变 化 。扫 描 波 长
范 围 ２０～ ０ ｎ 步长 １ｍ。 ０ ８０ ｍ， ｎ
１ ３ ５ 分子 量分布 的测 定¨ ＿ ．． Ｉ
光 值 扫描测 定 ， 者 的大 小 变 化 可 反 映 出 酶解 过 程 二 中反 应 物 （ 原 蛋 白 ） 产 物 （ 原 多 肽 ） 含 量 胶 与 胶 的
温 ， ０ ｒｍｉ ４０ ０／ ｎ离心 １ ｍ ｎ 得 到 澄清 的水解 液 。 ０ ｉ，
１ ３ ３ 胶 原 多肽 的测 定 ．．
２ 条件下 ， ｈ 用不同波长扫描酶解液吸光值的结果 ， 以
去离子 水为 对照 。 从 图 １可见 ， 在波 长 ２ ０～ ４ ｎ ３ ２ ０ ｍ左 右 有强 烈 吸
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１ ２ 试 验设备 ．
紫外分光 光度 仪 ； 超速 冷 冻离 心机 ；Ｙ Ｄ Ｙ一１ ２电
复 杂的反 应 过 程 ， 水解 动 力 学对 于 了 解 其 水 解 机 其 理、 确定水 解 过程 的关 键影 响 因素 、 择 适 宜 的控 制 选 参数 范围 以及制备 性能 优异 的胶原 多肽 产 品等 ， 具 均 有重 要意义 ¨ 。然而 ， 文献 中对 牛 骨胶 原 蛋 白水 解
室温 下 ， 原蛋 白与水形 成 凝 胶 ， 高温 度 才会 胶 提 形成 溶液 。 因此 ， 解前加 热 到 设定 的酶 解 温度 ， 酶 然
后加 入酶 液 ， 解 反 应 开 始 。牛 骨 胶 原 蛋 白 的酶 解 酶
白质 含量 ）×１０ 。 ０％
１ ３ ４ 酶解 液的全 波 长扫描 ．．
图 １ 牛骨胶原 蛋白酶解 液吸光值全 波长扫描
２ ２ 酶解动 态过 程 ．
基 于 以上分 析 ， 择 ５ ０ ｍ可 见 光 和 ２０ ｍ 紫 选 ７ｎ ３ｎ
外 ２个 波 长 ， 别 对不 同时 间 的 酶解 液 样 品进 行 吸 分
生 。在这些 牛 骨 中 ， 部 分被 用 于 骨粉 饲 料 的加 工 ， 一
究 在多 肽形 成 过 程 中的 酶解 动 态 特 性 ， 考 察 影 响 并
酶 解过 程和分 子量 分布 的 因素 。
部分牛犄角 、 牛腿 骨 等被用 于工 艺 品制作 。我 国的骨 加工业仍存 在 很 多弊 端 。畜 骨在 我 国大部 分 都用 来 生产骨胶 、 油 、 粉 等 ， 于 生 产动 物 饲料 ， 附加 骨 骨 用 其 值 都很低 。充 分 利用 当前 畜禽 骨 资 源是 当前 研究 的 热点 。胶原 蛋 白是动物 体 内含量 最大 的一种 蛋 白质 ， 将 胶原蛋 白进一 步水解 可得 到胶 原活 性多 肽 ， 可得 到 性 能更加优 良的胶原 多肽 ， 增加其 附加 值 和活性 。从 牛骨 中提取胶原蛋 白 ， 获取 天然胶 原 蛋 白及 其水 解 是
针 对从 细菌 中提 取 的胶 原 蛋 白酶 酶解 牛 骨胶原 蛋 白的动 力 学性 质 进行 研 究。通过 全 波长 扫描 和
Ｓ Ｓ Ａ Ｅ电泳， Ｄ —Ｐ Ｇ 对酶解的动态 变化及其 多肽分子量的变化 进行 了研 究 ， 考察 了温度 、 酶用量、 底物浓度等 因素 对酶 解动 态的影响， 并对酶解的过程动力学进行 了分析。结果说 明 ： 胶原蛋 白酶酶解牛 骨胶 原蛋 白得到 的 多肽分子 量分 布不均匀， 分子量大小随反应 时间的增大而减小 ； 在一定 范围内， 增大酶浓度 、 高温度 可使酶解反应更彻底 。 提 关键词 胶 原蛋 白酶 牛骨 胶 原蛋 白 胶 原多肽 酶解 动 力学 ’
动 力学的研究 十分 缺乏 。
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１ ３ １ 牛骨胶 原蛋 白的提 取 ．．
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报道 的提取方法， 由新 鲜 牛 骨 制
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． ： ． 产品开发 ・ 试验研究夺
活 性多肽 的一 条重 要 途径 。将 胶 原蛋 白水 解是 一 个
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牛 骨 ： 自于 华 中农 业 大 学 菜 市 场 ； 原 蛋 白 购 胶 酶 ： 蜡 样芽孢 杆 菌 纯化 分 离 （ ６ Ｕ ｍ ） 其 它 试 从 １５０ ／ ｇ ；
剂均 为市 售 的分析 纯 。
近年来 ， 随着 我 国养 殖 业迅 猛 发 展 ， 宰 所 产生 屠
本 文 以牛骨 制 备 得 到 的胶 原 蛋 白为 原 料 ， 用 采
从 蜡样 芽孢 杆 菌 中提 取 的胶 原 蛋 白酶 进 行 酶 解 ， 研
的副产物增多。以牛骨为例， 其约占牛体重的 １％ ～ ２
２％， ０ 即每生产 １０ｇ牛 肉就会 有 ｌ ２ｋ ０ｋ ２～ ０ ｇ的牛骨产
１ ３ ２ 牛骨胶 原蛋 白的酶解 Ｊ ．．
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ＭＥＡＴ Ｉ ＮＤＵＳ ＲＹ Ｔ
２ １ 年第 １ 期 ０１ １ 总 第 ３７期 ６
原蛋 白含量 越 高 。
图 １ 在 酶用 量 为 ４ ０ Ｕ ｍｇ 温度 ４ ￣ 酶 解 是 ． ／ 、 ０Ｃ、
室温 下 搅拌 ２ ， ９ ￣ 处 理 ２ ｒｎ ｈ 于 ０Ｃ热 ０ ｉ。冷 却 后 ａ 加 入蜡样 芽 孢 杆 菌 蛋 白酶 ， 别 在不 同 酶浓 度 和温 分 度条 件下 进行 反应 。反应 过 程 中 ， 隔一 定 时 间 ， 每 取 出样 品液 。酶 解 结束 后 ，０ 灭 酶 １ｍｎ 待 降至 室 ９℃ ０ ｉ，
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４， ｈ 吸光值 的变化 率减 慢 ， 明原 液 中胶 原 蛋 白 的含 说 量 进 一步下 降 ， 由胶 原 蛋 白断 裂 生 成 多 肽 的 速 率 下 降； 当反应 时 间为 ８ ｈ以后 ， 吸光 率 变 化很 小 ， 明胶 说
３ ｍｉ。在 波长 ５ ０ ｍ 处 测 定 吸光 度 值 。按 线 性 回 ０ ｎ ４ｎ
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１ １
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光值 ， 符合胶 原蛋 白的特性 。
３
取５ ｍＬ样 品 溶 液 ， 入 ５ ５ （ ｗ ） 氯 加 ｍＬ１％ Ｗ／ 三 醋酸 （ Ｃ 水 溶 液 ， 匀 后 静 置 １ｍｎ４００／ ｉ Ｔ Ａ） 混 ０ ｉ， ０ ｒｍｎ 离心 １ｍｉ， 清 液 稀 释 至 １—１ｍｇｍ ０ ｎ上 ０ ／ Ｌ浓 度 的 溶 液， 取稀 释液 １ Ｌ加入 ４ Ｌ双 缩脲 试 剂 ， 匀 ， 置 ｍ ｍ 混 静
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酶解 液 中 ， 原 多 肽 的分 子 量 分 布 和平 均 分 子 胶 量 用 Ｓ Ｓ— Ａ Ｅ进行 测 定 。浓 缩 胶 浓 度 为 ６ ， Ｄ ＰＧ ％ 分
离胶 浓度 为 １ ％ 。 ５
Biblioteka Baidu
图 ２是 在 酶用 量 为 ４ ０Ｕ ｍｇ 温度 为 ４ ℃ 、 ． ／ 、 ０ 波 长为 ２ ０ ｍ下 ， ３ｎ 酶解 液 的 吸 光值 随酶 解 时 间 的变 化 情 况 。 由图可 知 ， 在反 应 开始 的前 ２ ｈ内 ， 吸光 值 迅
２１ ０ １年第 １ 期 １ 总第 ３ ７期 ６
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胶 原 蛋 白酶 酶 解 牛 骨 胶 原 蛋 白 的 动 力 学 研 究
刘丽莉
摘 要
杨协力 河南科技 大学食品与 生物 工程 学院 河南洛 阳 ４ １０ ７０３
用分 光光 度计 对离 心后 的 酶解 液进 行 全 波 长扫
描， 得到 各 波 长下 水 解 液 的吸 光 度 变 化 。扫 描 波 长
范 围 ２０～ ０ ｎ 步长 １ｍ。 ０ ８０ ｍ， ｎ
１ ３ ５ 分子 量分布 的测 定¨ ＿ ．． Ｉ
光 值 扫描测 定 ， 者 的大 小 变 化 可 反 映 出 酶解 过 程 二 中反 应 物 （ 原 蛋 白 ） 产 物 （ 原 多 肽 ） 含 量 胶 与 胶 的
温 ， ０ ｒｍｉ ４０ ０／ ｎ离心 １ ｍ ｎ 得 到 澄清 的水解 液 。 ０ ｉ，
１ ３ ３ 胶 原 多肽 的测 定 ．．
２ 条件下 ， ｈ 用不同波长扫描酶解液吸光值的结果 ， 以
去离子 水为 对照 。 从 图 １可见 ， 在波 长 ２ ０～ ４ ｎ ３ ２ ０ ｍ左 右 有强 烈 吸
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１ ２ 试 验设备 ．
紫外分光 光度 仪 ； 超速 冷 冻离 心机 ；Ｙ Ｄ Ｙ一１ ２电
复 杂的反 应 过 程 ， 水解 动 力 学对 于 了 解 其 水 解 机 其 理、 确定水 解 过程 的关 键影 响 因素 、 择 适 宜 的控 制 选 参数 范围 以及制备 性能 优异 的胶原 多肽 产 品等 ， 具 均 有重 要意义 ¨ 。然而 ， 文献 中对 牛 骨胶 原 蛋 白水 解