植物蛋白提取

植物全蛋白提取方法：

TCA丙酮沉淀法、Tris-HC1法、Trizol沉淀法提取法。

1 TCA丙酮沉淀法

基于蛋白在酸或疏水条件下变性使蛋白浓缩并去除污染物原理的TCA丙酮沉淀法，最早用于小麦蛋白的提取，是目前提取植物蛋白的常用方法之一。

具有降低次生代物质的干扰、减少蛋白降解等优点。

TCA能有效地抑制蛋白酶对蛋白质的水解作用，保证在制样过程中蛋白质不被降解；丙酮溶液能除去样品中的酚类及色素等干扰物质，同时实验过程中采用的高速离心办法能较好地去除多糖的影响。然而该方法的一个最大缺点是蛋白质很难重新溶解，而且样品中的非蛋白成分很难除去，可能会丢失膜蛋白和疏水性蛋白，导致2-DE图谱上有明显的横纵条纹。

在研磨样品时加入聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或交联聚乙烯基吡咯烷酮(PVPP)用来吸附样品中富含的酚、醌类物质。它们能通过疏水键与酚类形成复合物，离心可以去除该复合物。然而，TCA丙酮沉淀法中与蛋白共沉淀的污染物在随后的有机溶剂清洗步骤常难以去除，可以通过振荡和延长蛋白沉淀在裂解缓冲液中温育时间的方法来增加蛋白的溶解能力。在提取的过程中同时加入了 TCA、β-巯基乙醇及 DTT 3 种药剂可以更好的抑制蛋白质的水解及去除干扰物质。 TCA丙酮提取法耗时少且容易操作，一般作为植物蛋白提取的初始方案，该方法常用于幼嫩组织中蛋白的提取，对更为复杂的植物组织该方法并非最佳选择。但该方法还是在植物蛋白的提取中占有重要位置，很多木本植物的样品应用该方法效果很好，如鹅掌楸叶片、巴东木莲的雌蕊柱头、槟榔叶片、银杏叶片及枝条、茶树叶片及芽、红豆杉的愈伤组织、石斛叶片等。草本植物中的大豆叶片、生菜叶片、黄瓜叶片、番茄子叶、龙胆花芽、灰木相思叶片等应用该方法都获得了较清晰的2-DE图谱。

TCA protein precipitation protocol

Stock Solutions: 100% (w/v) Trichloroacetic acid (TCA)

recipe: dissolve 500g TCA (as shipped) into 350 ml dH2O, store at RT. Precipitation Protocol:

1. Add 1 volume of TCA stock to 4 volumes of protein sample.

i.e. in 1.5ml tube with maximum vol., add 250µl TCA to 1.0ml sample.

2. Incubate 10 min at 4°C.

3. Spin tube in microcentrifuge at 14K rpm, 5 min.

4. Remove supernatant, leaving protein pellet intact. Pellet should be formed from whitish,fluffy ppt.

5. Wash pellet with 200µl cold acetone.

6. Spin tune in microfuge at 14K rpm, 5min.

7. Repeat steps 4-6 for a total of 2 acetone washes.

8. Dry pellet by placing tube in 95°C heat block for 5-10 min to drive off acetone.

9. For SDS-PAGE, add 2X or 4X sample buffer (with or without bME) and boil smaple for

10 min in 95°C herat block before loading smaple onto polyacrylamide gel.

2 Trizol沉淀法

与 TCA 丙酮沉淀法相比，Trizol沉淀蛋白质的方法可有效地除去色素、酚类等干扰电泳的化学物质，特别是对植物样品中高丰度蛋白——Rubisco1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase，通常简写为RuBisCO）。采用此方法能够减少高丰度蛋白对2-DE结果的干扰。植物样品中高丰度蛋白（如Rubisco）

的存在对其他蛋白质，尤其是低丰度蛋白的检测的影响也很大，因此，选择合适的蛋白质制备方法尤其重要。另外，使用聚乙二醇也可以去除该蛋白，效果较好。 Trizol法相对于酚法蛋白质获得产率高，方法操作亦不复杂，但对试剂要求严格，大量制备样品时成本较高。目前使用此方法的植物比较少，对野牛草的种子、幼苗叶片及黄花苜蓿幼苗提取蛋白的效果很好。

1.取冻存组织加入1ml Trizol（invitrogen）匀浆，样品量不可超过总体积的10%，室温孵育5min，超声粉碎至组织完全溶于液体中；

2.加入0.2ml氯仿，剧烈晃动15s，室温孵育2-3min，4℃12000×g离心15min；此时溶液分为水相和有机相。

3.小心吸取并丢弃上层水相（该水相中富含细胞总RNA，用于提取RNA，进行PCR实验）；

4.在剩下的中间层及有机相中加入0.3ml无水乙醇，颠倒充分混匀后室温放置2-3min，4℃下2000×g离心5min；

5.小心吸取并收集上层有机相（沉淀为DNA），转移到新的离心管中，加入1.5ml异丙醇，轻轻混匀后室温放置10min，4℃下12000×g离心10min；此时沉淀为蛋白。

6.弃上清液，加2ml 0.3M盐酸胍（95%乙醇溶解）清洗沉淀3次，每次清洗过程中，先将沉淀保存于清洗液中20min，然后在4℃下7500×g离心5min。最后一次清洗后，丢弃上层液相，将沉淀悬浮于2ml乙醇中，涡旋震荡15s后在室温下放置20min，然后在4℃下7500×g离心5min。

7.丢弃上层液相，将沉淀真空干燥5-10min。然后将沉淀溶解于1% SDS（十二烷基硫酸钠）中。在50℃水浴中反复吹打以助溶。不溶物在4℃下10000×g离心10 min去除。收集上清，转移到新的收集管中。该上清中的蛋白样品可直接用于Western Blotting实验或保存于-20℃。常见问题：

1. 得率低：样品裂解或匀浆处理不彻底；最后得到的蛋白质沉淀未完全溶解

2. 蛋白质降解：组织取出后未马上冷冻

3. 电泳时条带变形：蛋白质沉淀洗涤不充分

3 Tris-HC1法

Tris-HCl法在膜蛋白和疏水性蛋白的提取方面有所改善。用含SDS的Tris-HCl与TCA 丙酮联合使用提取蛋白质；用80%的丙酮洗涤以除去水溶性杂质(包括高浓度的盐离子)，比TCA丙酮法利用高速离心与丙酮洗涤的方法能更有效地排除杂质，也比传统的脱盐和透析方法要省时省力。Tris-HC1法提取的蛋白图谱效果明显比用TCA丙酮法提取的效果好，主要表现在不同分子量围蛋白点的数目及分离效果方面。TCA丙酮法所提取蛋白在小分子量区域分布不均匀，蛋白点不清晰，水平条纹与竖直条纹较为严重，而Tris-HC1法克服了上述缺点，并分离出TCA丙酮法所不易分离出的酸性蛋白，TCA丙酮法能够得到较多中等分子量蛋白而 Tris-HC1法除了分离到较多的中等分子量的蛋白质外，还得到了很多的高分子量和低分子量蛋白质。另外，Tris-HC1法操作简便，时间较短，成本适中，提取步骤简单，减少了因处理步骤繁多而造成的蛋白质的损失，大大提高了实验结果的重复性。 Tris-HC1法对箭毒木种子、白桦花芽及苹果叶片的提取效果非常好。在清洗步骤中，用 10 倍体积的-20℃预冷 10% TCA 丙酮沉降蛋白质，实验表明 Tris-HCl 提取法所得图谱背景清晰，没有横纵条纹及弥散状的蛋白质点，蛋白质点数最多。

（1）准确称取0.5g叶片，剪碎后加入0.25mLTris-HCL溶液冰浴研磨。

（2）加入0.75mL提取液。（7moL/L尿素，2moL/L硫脲，0.4%CHAPS，10mmoL/LDTr）（3）研磨至匀浆后，转移至1.5mL离心管中，10000r/min。

（4）取上清，即为含蛋白样品。

植物提取蛋白定量：

总蛋白定量分析