蛋白翻译后修饰

蛋白酶 (ubiquitin-spicific processing proteases,
UBPs) ，两者都是半胱氨酸水解酶。泛素化降解蛋白 的过程中对蛋白的特异性识别依赖E3. 由E2s 和E3s 介导的泛素化过程可以被去泛素化酶 (DUBs)逆转通常 情况下, UCHs 主要水解羰基端的酯和泛素的氨基键,
真核生物中20 种以上的修饰类型，比较常见的为 甲基化、乙酰化、糖基化、泛素化、磷酸化以及 近年发现的SUMO化。
2.1 甲基化
蛋白质的甲基化修饰是在甲基转移酶催化下 , 在赖氨酸或精氨酸侧链氨基上进行的甲基化。是 指从活性甲基化合物( 如S － 腺苷基甲硫氨酸)上
将甲基催化转移到其他化合物的过程。可形成各
2.4 泛素化
泛素-蛋白酶系统对蛋白特异性水解机理
2.4 泛素化
DUBs参与的泛素调控
2.5 磷酸化
磷酸化是通过蛋白质磷酸化激酶将 ATP的磷酸基转移到 蛋白的特定位点上的过程。 在有机体内，磷酸化是蛋白翻译后修饰中最为广泛的共
价修饰形式，同时也是原核生物和真核生物中最重要的调
控修饰形式。磷酸化对蛋白质功能的正常发挥起着重要调 节作用，涉及多个生理、病理过程，如细胞信号转导、肿 瘤发生、新陈代谢、 神经活动、肌肉收缩以及细胞的增殖、 发育和分化等。
2.4 泛素化
泛素化也是组蛋白修饰的一种重要形式, 组蛋白的
H2A 和 H2B 是泛素化多发位点 , 已经找到了组蛋白
H2B 泛素化酶[13~15], 并且发现组蛋白H2B 泛素化和 组蛋白甲基化存在关联。 激活子的泛素化对于转录激活是十分重要的。 2001 年 Salghetti 等[19]提出, 泛素化可以作为激活作 用和激活 子重新构 造的双信 号 , 调节 TAD 功能 。 E3Met30 使转录激活子VP16 TAD 泛素化。
组蛋白赖氨酸甲基化.
组蛋白甲基化
组蛋白精氨酸甲基化
组蛋白甲基化
1.组蛋白赖氨酸甲基化 组蛋白赖氨酸甲基化发生在H3-K4,H3-K9,H3K27,H3-K36,H3-K79 和 H4-K20 上 , 还可发生于 H1 N 端。 H3-K9,H3-K27,H4-K20的甲基化与染色体的钝化过程有 关,而H4-K9的甲基化可能与大范围的染色质水平的抑制 有关。H3-K4,H3-K36,H3-K79 位的甲基化与染色体转录
凋亡,从而最终发展成为癌细胞 .
2.5 磷酸化
DNA新陈代谢的研究中：细胞中DNA损伤可导致人的复制蛋 白 A(RPA)32 kD 亚基 N 端的过度磷酸化, 这有助于调控 DNA 的新陈代谢, 促进DNA 修复. 有数据显示, 过度磷酸化会 导致 RPA 构象改变 , 降低 DNA 复制的活性 , 但不会影响
种甲基化合物，或是对某些蛋白质或核酸等进行 化学修饰形成甲基化产物。
组蛋白甲基化
是发生在组蛋白合成之后 , 以硫代腺苷甲硫氨
酸（ SAM ）为甲基供体 , 在组蛋白甲基转移酶的 (histone methyltransferase,HMTases) 的催化下 , 将 基转移到蛋白质的Lys或Arg残基上。
2.2 乙酰化
乙酰化修饰过程主要发生在组蛋白上，是由组蛋白乙 酰转移酶( HATs) 催化的，其反过程去乙酰化由组蛋白去
乙酰酶( histone deacetylases，HDs 或者HDACs) 催化
的。核心组蛋白的 N-末端富含赖氨酸，生理条件下带正 电，可与带负电的DNA 或相邻的核小体发生作用，导致 核小体构象紧凑及染色质高度折叠。乙酰化使组蛋白与 DNA 间的作用减弱，导致染色质构象松散，这种构象有
源自文库
激活过程有关 , 其中 H3-K4 的单甲基化修饰可以对抗 H4K9甲基化所导致的基因抑制。
组蛋白的甲基化
2.组蛋白的精氨酸甲基化
组蛋白精氨酸甲基化位点为H3-R2,H3R8,H3R17,H3-R26,H4-R4它们都可以增强转录。
2.2 乙酰化
乙酰化其主要讲把一种乙酰官能基团添加到另一 种有机化合物上,并进行结合的过程。乙酰化也是细胞 内蛋白质翻译后修饰的一种重要形式。组蛋白等许多 蛋白都可以发生乙酰化。
利于转录调节因子的接近，从而可以和转录因子结合，
促进基因的转录; 去乙酰化则抑制基因转录。
蛋白质乙酰化示意图
2.3 糖基化
蛋白质的糖基化是低聚糖以糖苷的形式与蛋白上
特定的氨基酸残基共价结合的过程。
糖基化的过程主要是在糖基转移酶的帮助下，使 低聚糖以糖苷的方式移动到蛋白质分子上，并与蛋白 质分子上特定的氨基酸残基进行共价结合作用而构成 糖苷键的经过。
2.5 磷酸化
磷酸化的过程
作用位点：蛋白上的 Ser, Thr, Tyr 残基
大部分细胞过程实际上是被可逆的蛋白磷酸化所调控的,
至少有30%的蛋白被磷酸化修饰 。可逆的磷酸化过程几乎涉
及所有的生理及病理过程， 如细胞信号转导、肿瘤发生、新 陈代谢、神经活动、肌肉收缩以及细胞的增殖、 发育和分化 等.Fisher 和 Krebs 因其在蛋白质可逆磷酸化作为一种生物 调节机制方面的研究而获得 1992 年诺贝尔生理学及医学奖。
蛋白C 端部位结合，将蛋白连接到细胞膜上。
蛋白质发生糖基化反应，从而有糖蛋白这种物 质的产生，此过程一般在内质网上发生，并且糖 基化拥有很多功效，主要是对调控蛋白质发生修 饰和改善蛋白质的生物作用。
2.3 糖基化
细胞中涉及糖基化的蛋白质
2.4 泛素化
泛素化是指泛素分子在一系列特殊的酶作用下， 将细胞内的蛋白质分类，从中选出靶蛋白分子，并 对靶蛋白进行特异性修饰的过程。
泛素-蛋白酶系统是存在于所有真核生物细胞的调控
系统。降解过程中需要三种酶的参与: 泛素激活酶(E1)、
泛素结合酶(E2)和泛素蛋白质连接酶(E3)。泛素化降解
蛋白的过程中对蛋白的特异性识别依赖 E3. 由 E2s 和 E3s 介导的泛素化过程可以被去泛素化酶(DUBs)逆转.。
2.4 泛素化
目前发现的 DUBs 可分为两大类 : 泛素碳端水解酶 (ubiquitin C-terminal hydrolases,UCHs)和泛素特异性
GlcNAc 部分。
2.3 糖基化
2.3.2 N糖基化
N 糖基化是在内质网上由糖基转移酶催化，在内分 泌蛋白和膜结合蛋白的天冬酰氨残基的氨基上结合寡糖 的过程。普遍认为 N 位糖基化发生在蛋白 Asn-XaaSer/Thr(Xaa 为除脯氨酸外的所有氨基酸残基)序列上, 少数情况下Asn-Xaa-Cys 序列也作为糖基化位点。
DNA 的修复。
2.6 SUMO 化
SUMO为小泛素相关修饰物 (small ubiquitin- related modifier，SUMO)分子，是一种近年发现的泛素样分子，也参与 蛋白质翻译后修饰，但是不介导靶蛋白的蛋白酶体降解， 而 是可逆性修饰靶蛋白，参与靶蛋白的定位及功能调节过程。
3 研究方法及关键技术
2.5 磷酸化
磷酸化调节细胞的过程
2.5 磷酸化
细胞信号转导过程：一些激素或细胞因子与细胞膜受体或
细胞内受体结合并被激酶激活, 激素或信号因子随着激酶的
磷酸化也被磷酸化, 引起细胞内的信号效应。 癌症研究中：微管蛋白的磷酸化可能导致癌症的发生. 细胞 中使用“最后检验点策略”(LCP)控制细胞凋亡, 即将含有 硝基化酪氨酸的 α -微管蛋白组装到微管上, 这将导致微管 功能失常而最终导致细胞凋亡. 但如果微管蛋白酪氨酸连接 酶(TTL)被磷酸化, 将可能使细胞“躲过”LCP 控制的细胞
2.3 糖基化
在真核细胞中普遍存在低聚糖通过糖苷键与蛋白质上 特定的氨基酸共价结合的形式，主要包括 O 糖基化、 N糖 基化、C甘露糖化和GPI ( glycophosphatidlyinositol)锚定 连接。
2.3.1 O糖基化
发生部位：O 糖基化多发生在临近脯氨酸的丝氨酸或苏 氨酸残基上； 构型：糖基化位点处的蛋白多为β构型； 过程：O 多聚糖以逐步加接单糖的形式形成低聚糖， 主要在高尔基体与细胞核或细胞质中形成。
3.1 甲基化研究方法及关键技术
甲基化特异性的 PCR ： 其 基 本 原 理 是 把 所 有 的 基 因 组 DNA 用亚硫酸氢盐进行处理，如此做是因为尚未发生甲基 化修饰的胞嘧啶都会被作:用变为尿嘧啶，但进行甲基化修 饰的胞嘧啶则不会发生改变。由上面的原理可知，采用不 同种类的引物做 PCR，即可检测出这种微弱的变化， 这 样就能确定基因是否存在甲基化。 亚硫酸氢盐测序法：利用重亚硫酸盐对 DNA 进行处理， 此过程会使没有进行甲基化的胞嘧啶变为尿嘧啶，但进行 甲基化的基团则不会。然后把经作用的物质为基础，加入 甲基化特异性的物质(primerI)或者非甲基化的物质 (primerII)，使其进行特异性的扩增。 高分辨率熔解曲线法
蛋白翻译后修饰
1 定义
翻 译 后 修 饰 （ 英 语 ： Post-translational modification ，缩写 PTM ；又称后转译修饰）是 指蛋白质在翻译后的化学修饰。对于大部份的 蛋白质来说，这是蛋白质生物合成的较后步骤。
2 蛋白质翻译后修饰的类型
蛋白质翻译后修饰是一个复杂的过程，目前在
3 研究方法及关键技术
基于特异性识别乙酰化赖氨酸残基的乙酰化抗体：对于赖
氨酸的乙酰化修饰， Kim 及其同事用免疫亲和纯化技术富
集赖氨酸乙酰化修饰的肽段， 在 Hela 细胞的细胞质、细 胞核和线粒体中发现了 195 种赖氨酸乙酰化修饰蛋白。但 是， 赖氨酸乙酰化抗体只能特异性识别赖氨酸残基发生修 饰的蛋白质或肽段， 不能检测到丝氨酸和苏氨酸的乙酰化
也可以分解泛素前体, 生成活泼的泛素分子; UBPs 分
解泛素多聚体链。
2.4 泛素化
2.4.2 泛素化在生命体中的作用
泛素化对于细胞分化、细胞器的生物合成、细胞凋 亡、DNA 修复、新蛋白生成、调控细胞增殖、蛋白质 输运、免疫应答和应激反应等生理过程都起到很重要的 作用。 Bence 等发现, 蛋白的沉积可直接削弱泛素 -蛋 白酶系统的功能. 两种不相关但有聚合倾向的蛋白的瞬 时表达, 几乎可以完全抑制泛素 -蛋白酶系统.由于泛素 介导的蛋白质水解在调节细胞活动中的重要地位, 引起 蛋白聚集的潜在机制将导致细胞的紊乱和细胞凋亡。
2.3 糖基化
发生在高尔基体上：起始于丝氨酸和苏氨酸羟基 上连接N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡萄糖胺、甘露糖及
海藻糖等的还原端;
发生在细胞核和细胞质中：在丝氨酸或苏氨酸残 基上连接一个单糖——N-乙酰葡萄糖胺。在哺乳动物 体内最常见的O 糖基化形式是由GalNAc 转移酶催化 的O-GalNAc 糖基化，进而连接Gal，GalNAc 或者
3 研究方法及关键技术
3.2 乙酰化研究方法及关键技术
通过生物质谱鉴定乙酰化修饰位点 ：质谱技术通过检
测到的肽段的质量与预测的肽段的质量进行对比，如果
二者质量相差 42amu则认为在氨基酸残基或在蛋白质 末端发生乙酰化修饰。通过从鉴定到的肽段的N末端或 C 末端逐个分析得到的b离子或 y 离子，就可以确定发 生乙酰化修饰的氨基酸位点。
泛素由 76 个氨基酸组成，高度保守，普遍存在 于真核细胞内，故名为泛素。
共价结合泛素的蛋白质能被蛋白酶识别并降解, 这是细胞内短寿命蛋白和一些异常蛋白降解的普遍 途径. 与消化道内进行的蛋白质水解不同,从泛素与 蛋白的结合到将蛋白水解成小的肽段, 整个水解过 程需要能量参与。
2.4 泛素化
2.4.1 泛素-蛋白酶系统
修饰。用特异性识别丝氨酸或苏氨酸乙酰化修饰的抗体将
大大有利于丝氨酸和苏氨酸乙酰化修饰的蛋白质组学分析。
3 研究方法及关键技术
以标记底物为基础的方法： Yu及其同事在酶 GNAT 的作用 下，用氯代乙酰化CoA与其作用底物L12反应，导致氯代乙 酰化L12的生成。然后将氯代乙酰化L12与荧光素His18俘 获的肽段一起孵育，经过氯消除后，纯化后的标记的底物
2.3.3 C甘露糖化
C甘露糖化是将一分子α-mannopyranosyl残基通过 C-C键连接到色氨酸吲哚环C-2上，这种糖基化方式多 发生在模体W-X-X-W，W-XX-C 或者W-X-X-F的第一个 色氨酸残基上。
2.3 糖基化
2.3.4 GPI锚定连接
GPI锚定连接指的是磷脂酰－ 纤维糖组在靠近