第二章 现代微生物生态学 PPT课件

➢近年来，不断有从海洋中新类群的发现。
海洋真细菌的分布
海 ➢浮游放线菌是海洋放线菌的重要组成部分，数 洋 量处于中等丰度水平，相关报道较少。
放 线
➢海洋沉积物中最重要的真细细类群。其中浅海
菌 区以链霉菌为主，也有较多游动放线菌；而深海
区沉积物中的优势放线菌为小孢囊菌和诺卡氏菌。
➢无脊椎动物及海洋植物的表面或体内存在着相 当部分的海洋放细线菌，研究得较多的是海绵。
海洋真细菌的分布
海 洋 细
•海洋浮游细菌分布受可利用有机物、季节、深度、盐度、 及叶绿素浓度影响较大而区域性差异影响较小。
菌 •沉积物中的海洋细菌分布表现区带化特征。
➢海洋浮游细菌主要属于α-变形菌纲、γ-变形菌、拟 杆菌纲等。
➢海底沉积物中酸杆菌门、 α-变形菌纲、γ-变形菌、 δ-变形菌纲、拟杆菌纲等多种类型菌种。
最后68~72℃延伸6~10min
缺点：可能出现嵌合产物和扩增偏嗜性现象。
16srRNA基因片段的分析
16SrRNA基因片段的分析方法
1）将PCR产物克隆到质粒载体上进行测序，与16SrRNA 数据库中序列比较，确定其进化树中位置，从而鉴定样品 中可能存在的微生物种类。
特点：该方法获得信息最全面，但在样品复杂情况下测序工作繁重。 主要应用：单株菌的鉴定；两种菌的同源性比较，确定其归属。
和建设
2现代生态学要研究与解决的主要问题
能源短缺问题 环境污染问题 防止自然生态系统的萎缩、保护森林，防止沙漠化等 城市有机废弃物的处理及综合利用的生态工程 建立高产高效、持续发展的生态农业和企业化生态工厂。
如：白色农业 生命活动密切相关元素、化合物及生态效应与人体健康关
系。 海洋资源的生态调查、开发利用、保护的研究
rRNA基因分析方法
• rRNA approach是综合应用多项分子生物技术对 细胞中rRNA基因进行分析，从而揭示微生物多样 性。
• 所使用的技术主要包括环境样品中DNA的提取、 引物及探针的设计、PCR扩增、梯度胶电泳（主 要是DGGE和TGGE）、限构建、斑点杂交和全细胞原 位杂交及巢式杂交等。
3微生物生态系统多样性
陆生微生物生态系统 水生微生物生态系统 大气微生物生态系统 根系微生物生态系统 肠道(消化道)微生物生态系统 极端环境微生物生态系统 活性污泥微生物生态系统 “生物膜”微生物生态系统
海洋微生物的分布
海洋古菌的分布 海洋真细菌的分布 海洋真菌的分布 海洋真核微藻的分布 海洋病毒的分布
• PCR技术使靶序列放大几个数量级，再用探针杂 交探测对被扩增序列作定性或定量研究分析微生 物群体结构。PCR常与其他技术结合起来使用， 如RT-PCR，competitive PCR、nested PCR、 RAPD、ARDRA等。
Nested PCR
第一步：第一对引物 结合。第一对引物也 可能结合到其他具有 相似结合位点的片段 上并扩增多种产物。 第二步：第二套引物 对第一轮PCR扩增的 产物进行第二轮PCR 扩增。
第二章 现代微生物生态学
现代生态学的研究领域 现代生态学要回答和解决的主要问题 微生物生态系统多样性 微生物生态学研究方法
传统方法 分子生物学方法 微生物酶活性测定
1现代生态学的研究领域
生态系统中种群规模的调控 生物生产力的利用和保护 研究人工生物群落的稳定性和提高生产力 环境污染防治 城市生态系统生态学和人类生态学的研究
靶基因与参考标准在同一反应管中共同扩增，但参照标准 通常是一段人工合成的模板而不是内源性基因。竞争PCR 必须构建一个内部标准，此标准能与靶基因竞争聚合酶、 核苷酸和引物分子，具有相同的引物结合位点，其扩增产 物能通过电泳或高效液相色谱(HPLC)等方法区分开来。对 竞争性模板作系列稀释后加入到恒量的样品DNA中进行 PCR，靶基因的量取决于所添加的竞争性DNA片段的量， 使两者的PCR终产物有相等摩尔数。
海洋真核微藻的分布
寒带种：最适温度小于4℃。小于0℃左右为寒带种； 0℃- 4℃来亚源自水 寒带种。平 分
温带种：最适温度4℃- 20℃ 。 4℃- 12℃为冷温带种12℃- 20℃
布 为暖温带种。
热带种：最适温度大于 20℃ 。 20℃- 25℃为亚热带种；大于
25℃为热带种。
垂 直
主要影响因子为光强。分喜光藻与适阴藻。
海洋古菌的分布
古菌的绝对数量大约占微型浮游生物的2%。
游海 古洋 菌浮
表层海水中多为广域古菌，而在150米深以下的水域中则 以泉古菌为主。
浮游古菌的分布还受到季节、海水温度和海流等环境因 素影响。
中沉 古积
不同海域、不同深度的沉积物中古菌分布不均。
菌 物 同一海域沉积物中，影响古菌分布的主要因素是有机物。
16s rRNA基因分析步骤
微生物样品基因组DNA的提取 16srRNA基因片段的获得（pcr）
16srRNA基因片段的分析
肠道微生物样品基因组DNA的提取
➢rRNA的含量很高，易于获得较多的模板，但是RNA易降解，因此 一般研究多采用提取细胞总DNA。
➢肠道环境中存在的细菌种类繁多，形态及性质各异，必须尽可能无 选择性地裂解肠道细菌细胞以得到代表性的核酸分子。
检测特异的DNA或RNA序列。
有
细胞原位杂交
组织切片原位杂交
DNA-DNA
RNA-DNA 三类杂交
RNA-RNA
该法优点：
不需提取核酸，故可完整保持组织或细胞的形态，因而 更能准确地反映组织细胞的功能状态。
PCR特异性扩增技术
• 在环境检测中，靶核酸序列往往存在于一个复杂 的混合物中，且含量极低，若探测这种复杂群体 中特异微生物或某个基因，杂交就显得不敏感。
显著。如含单宁酸的马尾藻真菌极少；红藻上有数量较多的酵
母菌而褐藻相对较少，因后者分泌酚类。
红树林真菌 多数为腐生，能分解红树的枯枝败叶，为海洋提供
有机物碎片。
海草真菌 多栖于海草的叶部和根部，数量少。
寄生动物体真菌 寄生于动物的外骨骼及肠道等。
海底沉积物真菌 发现不同海域沉积物中都有真菌，但鉴定的很少。
海洋真细菌的分布
海 洋 蓝 细 菌
➢迄今为止发现的海洋蓝细菌主要属于原绿球藻属
（Prochlorococcus）和聚球藻属（Synechococcus）。
是海洋初级生产者的重要组成
•聚球菌分布于热带和温带海域。粒径为0.5-1.5um。通常 比其消费者微型原生动物至少高一个数量级，足以作为微 型原生动物的重要食物源。对总初级生产力的贡献在世界
样品的采集
微生物菌量计数
富集培养和 菌种 分离
最大或然值法
活菌计数法
4.2微生物生态学研究中的分子生物学方法
核酸探针杂交技术 PCR特异性扩增技术 rRNA基因同源性分析方法
核酸探针杂交技术
• 核酸杂交技术快速，能灵敏地探测出环境微生物 中特殊的核酸序列，并且用光密度测定法可直接 比较核酸杂交所得到的阳性条带或斑点就能得出 定量的结果，从而反映出相关微生物的存在及功 能。
菌体细胞裂解常用方法
•酶法 •化学法
目前认为最可靠的方法是： 溶菌酶配合微珠振荡裂解，
•机械法
使肠道混合微生物的DNA充分释放，
再用酚-氯仿抽提总DNA。
16srRNA基因片段的获得
16SrRNA通用引物进行PCR扩增的一般程序
94~96℃预变性2~5min 94~95℃变性30~60s 45~55℃退火60s 68~72℃延伸2~4min
2）16SrRNA基因片段的多态性分析（又叫DNA遗传指纹图谱 技术）。经PCR后其产物为序列等长但不同源的DNA混合物， 常用DGGE、TGGE等手段分离。混合物中序列的多样性和不同 序列的丰度在一定程度上反映原始样品中微生物种群的多样性 和不同物种的丰度。
泉古菌目
广古菌目
The marine sponge Axinella mexicana and its archaeal symbiont, Cenarchaeum symbiosum. 3A., Axinella mexicana a bright red demosponge found off the California coast. 3C., FISH experiment showing C.symbiosum population present in the sponge tissues (in green). Many of the C. symbiosum cells are visibly dividing.
分 布
海底的分布与沉积物的组成及大小相关，含沙粒的多于泥泞。
季 双峰模式：温带海域春、秋各有一个高峰（受光强、营养盐影响）。
节 变
单峰模式：寒带海域春季一高峰；某些温带海域（受径流影响）。
化 水平模式：多见热带海域（季节不明显）
海洋病毒的分布
浮 游
➢季节、水深、光密度、温度、盐度等理化因子影响海洋 浮游病毒的分布。
RAPD (randomly amplified polymorphic DNA)
用那些对某一特定基因的非特异性的引物来 扩增某些片段。 RAPD分析用于探测含有混合微生物种群的 各种生物反应器中的微生物多样性。其分析得 到的基因组指纹图谱在比较一段时间内微生物 种群的变化以及比较小试规模和中试规模的反 应器方面是有用的。但不足以用来估测群落的 微生物多样性。
病 ➢赤潮发生期病毒丰度骤增。
毒 ➢丰度随宿主变化而变化。病毒丰度与宿主丰度间的比值
（virus-to-bacterium ratio,VBR）是研究病毒侵染对水
生菌群影响的重要参数。
底 •底栖病毒丰度大于浮游病毒丰度。
栖 病
•VBR也大于浮游病毒
毒 •沉积层深度增加病毒丰度及VBR都降低。