免疫组化操作步骤

免疫组化操作步骤

（一）、仪器设备

1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.

2. 水浴锅

（二）、试剂

1. PBS缓冲液（ph7.2―7.4）：NaC137mmol/L，KCl

2.7mmol/L ,Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L. 2．0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6.0,1000ml）：柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g。

3．0.5mol/L EDTA缓冲液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTA& 8226;2H2O,用10mmol/L NaOH调至ph8.0,加水至1000ml.

4. 1mol/L的TBS缓冲液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至ph8.0, 加水1000ml。

5. 酶消化液：a. 0.1%胰蛋白酶：用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。

6. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制

7. 风裱剂：a. 甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（ph9.0–9.5）等量混合 b 油和TBS(PBS)配制

8．TBS/PBS PH9.0–9.5,适用于荧光纤维镜标本;ph7.0-7.4适合光学纤维标本

（三）、操作流程

1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。

a 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟

b 无水乙醇中浸泡五分钟

c 95%乙醇中浸泡五分钟

d 75%乙醇中浸泡五分钟

2、抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片：

A 抗原热修复

a 高压热修复在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液（ph6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。将玻片置于金属染色加上，缓慢加压，是玻片在缓冲液中浸泡五分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后除去热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。此方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。

b 沸热修复电炉或水浴锅加热0.01枸橼酸钠缓冲液（ph6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10-15分钟。

c 微波炉加热在微波炉里加热0.01枸橼酸钠缓冲液（ph6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5-10分钟，反复1-2次。适用的抗原： .AR.PR.C-fos.x-jum.z-kit.c-myc.E-cadherin. n.ER.in..P53.P34.P15...Rb.等

B 酶消化方法常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热37℃，消化时间约为5-30分钟。适用于被固定遮蔽的抗原：包括 . eratin..LN.等

3、免疫组化染色SP法

（1）脱蜡、水化

（2）PBS洗2-3次各5分钟

（3）3%H2O2(80%甲醇)滴加在TMA上，室温静置10分钟

（4）PBS洗2-3次各5分钟

（5）抗原修复

（6）PBS洗2-3次各5分钟

（7）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟，甩去多余液体

（8）滴加Ι抗50μl,室温静置1小时或4℃过夜或37℃1小时

（9）4℃过夜后需在37℃复温45分钟

（10）PBS洗3次每次2分钟

（11）滴加Ⅱ抗45-50μl,室温静置或37℃1小时

（12）Ⅱ抗中可加入0.05%的 tween-20.

（13）PBS洗3次各5分钟

（14）DAB显色5-10分钟，在显微镜下掌握染色程度

（15）PBS或自来水冲洗10分钟

（16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化

（17）自来水冲洗10-15分钟

（18）脱水、透明、封片、镜检。

4、SABC法

（1）脱蜡、水化

（2）PBS洗2次各5分钟

（3）用蒸馏水或PBS配制新鲜的3%H2O2，室温封闭5-10分钟，用蒸馏水洗3次（4）抗原修复

（5） PBS洗5分钟

（6）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟，甩去多余液体

（7）滴加Ι抗50μl,室温静置1小时或4℃过夜或37℃1小时

（8）PBS洗3次各2分钟

（9）滴加生物素化Ⅱ抗，20℃-37℃ 20分钟

（10）PBS洗3次各2分钟

（11）滴加试剂SABC 20℃-30℃ 20分钟

（12） PBS洗4次各5分钟

（13） DAB显色：试剂盒或自配显色剂显色

（14）脱水、透明、封片、镜检。

免疫组化问题解答

1、染色过强

原因解决方法

a 抗体浓度过高或孵育时间过长降低抗体滴度、抗体孵育时间：室温1小时或4度过夜

b 孵育温度过高超过37度一般在室温20-28度

c DAB显色时间过长或浓度过高显色时间不超过5-12分钟，以显微镜下观察为准

2、非特异性背景染色

原因解决方法

a 操作过程中冲洗不充分每步冲洗3次每次5分钟

b 组织中含过氧化物酶未阻断可再配置新鲜3%H2O2封闭孵育时间延长

c 组织中含内原性生物素正常非免疫动物血清再封闭

d 血清蛋白封闭不充分延长血清蛋白封闭时间

3、染色弱

原因解决方法

a 抗体浓度过低、孵育时间过短提高抗体浓度、孵育时间不能少于60分钟

b 试剂超过有效使用时间应更换试剂

c 操作中添加试剂时缓冲液未沥干每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液

使试剂稀释（应防止切片干燥）

d 室温太低低于15度要改放在37度孵育箱孵育30-60分钟或4 度冰箱过夜

e 蛋白封闭过度封闭不要超过12分钟

4、染色阴性

原因解决方法

a 操作步骤错误应重试设阳性对照

b 组织中无抗原设阳性对照以验证试验结果

c 一抗与二抗种属连接错误仔细确定一抗二抗种属无误

三步法（SP系列），实验步骤使用说明：

SP9001（兔）适用于兔来源的一抗

SP9002（小鼠）适用于小鼠来源的一抗

SP9003 （山羊）适用于山羊来源的一抗

SP9000 (通用型) 适用于兔，小鼠，大鼠来源的一抗

3.0ml- 价格￥230.00 / 6.0ml- 价格￥380.00 / 18ml- 价格￥1080.00

试剂盒规格及贮存条件

规格：3ml（50片）/6ml(120 片)/18ml(360 片)

贮存条件：本试剂盒宜4℃保存，稳定期1 年

一﹑试剂盒内容

试剂1 封闭用非免疫的驴血清工作液（含10%驴血清）即用型

试剂2 生物素化二抗（驴抗兔/鼠/山羊）即用型

试剂3 链酶卵白素-碱磷酶轭合物即用型

试剂3 过氧化物酶标记链酶卵白素即用型

实验步骤简介：

1. 细胞爬片：冷丙酮或4%的多聚甲醛固定的细胞爬片，置0.1mol PBS 室温10分钟复水。

2. 修复：滴加复合消化液（0.125胰蛋白酶% +0.1胃蛋白酶%+0.01 EDTA% ）（0.1molPBS 配制）4度30-40分钟0.1mol PBS 洗三次，每次一分钟

3. 血清封闭：（试剂1）室温10分钟，倾去。

4. 一抗：37℃1小时或4度过夜

5. 0.1mol PBS 洗三次------每次三分钟

6. 相应的生物素化二抗（试剂2）37℃30-40分钟

7. 0.1mol PBS 洗三次------每次三分钟

8. 链酶卵白素-碱磷酶轭合物或过氧化物酶标记链酶卵白素（试剂3）37℃40分钟

9，NBT/BCIP或DAB显色，切片经梯度酒精脱水干燥，(二甲苯透明)，中性树胶封固；如果

用AEC显色，则切片不能酒精脱水，而直接用水性封片剂。

灏洋生物15:14:49

名称：connexin 43

产品编号：CM7269