miR-205在胆碱能抗炎通路中降低HMGB1表达

miR-205在胆碱能抗炎通路中降低HMGB1表达目的：既往研究发现,miRNA在胆碱能抗炎通路中参与早期炎症TNFa和IL-6的调控,而晚期炎症因子是脓毒症持续发生的基础。本研究目的为：(1)胆碱能抗炎通路作为一种转录后调节,与miRNA调节方式相同,那么在胆碱能抗炎通路中

是否存在调节晚期炎症因子HMGB1的miRNA,利用miRNA芯片筛选确定差异miRNA。

(2)从细胞学水平验证筛选的niRNA能靶向调节HMGB1。(3)通过动物实验,

在组织学水平判断目的miRNA在体内能发挥胆碱能抗炎通路的作用,并对各器官中调节作用的差异进行研究。

方法：(1)利用miRNA芯片筛选RAW264.7在脓毒症和胆碱能抗炎通路中,晚期炎症因子表达高峰时miRNA表达的差异,利用差异倍数值(Fold change, Fc)

找出在胆碱能抗炎通路中表达升高大于脓毒症组2倍以上的目的miRNA, GeneSpring 12.5软件,分别用PITA, TargetScan, microRNAorg三个数据库对

符合要求的差异miRNA进行靶基因预测,选出三个数据库筛选出基因的交集,进

行后续的基因本体(Gene Ontology, GO)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)的富集分析研究。(2) Real-time PCR 验证目的miRNA芯片表达的准确性。

利用miR-205 mimics和inhibitor转染RAW264.7,通过对脓毒症组和胆碱

能抗炎通路组miR-205、 HMGB1和HMGB1 mRNA的表达验证miRNA作用的靶基因。

(3)检测脓毒症小鼠和胆碱能抗炎通路小鼠血清、脑、心、肺、肾、肝、脾、大肠组织中miRNA、HMGB1和HMGB1 mRNA表达的差异,观察miRNA在组织中的抗炎作用。

结果：(1)本研究优化了RAW264.7细胞脓毒症LPS浓度和激活胆碱能抗炎通

路的GTS-21药物剂量,分别是50ng/ml和8μg/ml。BALB-c小鼠的最佳药物剂量LPS为15mg/kg,GTS-21为4mg/kg。

(2)利用差异倍数值,在胆碱能抗炎通路中表达升高大于脓毒症组2倍以上的目的miRNA共38个,其中只在胆碱能抗炎通路中升高的miRNA有4个,分别是miR0205、196a、193b、31。对miRNA进行靶基因预测出2019个靶基因分布于66条通路。

(3)选取胆碱能抗炎通路组浓度升高倍数较大的miR-205进行qRT-PCR验证,与芯片的检测结果一致。通过对RAW264.7转染miR-205 mimics和inhibitor,转染miR-205 mimics的RAW264.7加入LPS后HMGB1表达显著低于脓毒症组；转染miR-205 inhibitor组加入LPS+GTS-21抗炎作用消失,HMGB1表达明显升高。

两组HMGB1 mRNA表达差异没有显著性。(4)在对血清、肺、肝脏、脾脏、大肠、脑、肾、心脏等组织的脓毒症组和胆碱能抗炎通路组miR-205做qRT-PCR

检测,观察两组不同组织中miR-205的表达变化。

检测的8个器官的组织表达差异均有显著性。胆碱能抗炎通路组的miR-205比sepsis组明显升高。

其中GTS-21组中血清、肝、肠、的组织表达超过sepsis组3倍以上。而脑、肾组织的miR-205在CAP组表达升高2倍左右,在心肌组织中升高不足一倍。

血清、脑、肾、肠组织,p<0.0001；肝p=0.0011,脾p=0.0054,心p=0.0049肺p=0.0032。用ELISA法对各组织中HMGB1浓度检测,胆碱能抗炎通路组各器官HMGB1较脓毒症组表达下降。

血清p=0.0063,脑、肾p<0.0001,心p=0.0561,肠p=0.0068,肺p=0.0010,脾p=0.0090,肝p=0.0006。脓毒症组和胆碱能抗炎通路组HMGB1 mRNA表达差异

没有显著性(p>0.05)。

结论：(1)通过miRNA芯片对激活胆碱能抗炎通路时调控晚期炎症因子的miRNA进行首次全基因谱筛选。发现至少有4个miRNA与晚期炎症因子表达调控有关,分别是miR-205、miR-193b、miR-196a和miR-31。

预测出2019种靶基因并进行KEGG分析,共得到66条有意义的通路。(2)通过miR-205 mimics和inhibitor转染RAW264.7,证明miR-205在胆碱能抗炎通路中靶基因为HMGB1。

(3)通过实验证实miR-205的调控发生在转录后。(4)miR-205在不同组织中,表达量和降低HMGB1的作用均不相同。