Taq DAN polymerase的制备

Taq DAN polymerase的制备

生技07-1 吴亚坤指导教师郭江波讲师

摘要为节约试验成本，我们实验室制备了Taq DNA聚合酶，主要方法如下：用含有Taq DNA聚合酶基因的pTaq表达质粒转化BL21(ED)3菌株，用IPTG诱导表达Taq DNA聚合酶，用高速离心法收集菌体，然后用快速冻融法进行纯化，除去细胞碎片以及核酸蛋白等复合物。在SDS-PAGE电泳检测目的蛋白是否诱导表达后，我们用制备的Taq酶进行PCR反应以检测Taq DNA 聚合酶的活力、敏感性和特异性等特征。

关键词Taq DNA聚合酶；表达；纯化

Abstract In order to reduce the costs of molecular biology experiments in our lab, we performed Taq DNA polymerase production in laboratory as following procedures: the strain of BL21(DE)3 was transformed with plasmid pTaq expressing Taq DNA polymerase gene. Then the positive colonies were induced by IPTG and collected with high speed centrifugation. Enzyme was purified with high speed freeze-thaw After SDS-PAGE electrophoresis to test whether target proteins were induced by IPTG, then PCR amplification was carried out to test the activity and purity of extracted Taq DNA polymerase.

Key Words Taq DNA polymerase；expression；purification

前言

自从Randall K.Saiki 等将耐热的Taq DNA polymerase 应用于PCR技术以后,Taq DNA聚合酶在分子生物学试验中越来越重要[1].目前市场上有进口分装和国产两类Taq DNA聚合酶,产品质量在不断提高,而生产成本却在不断降低.目前Taq DNA聚合酶的最低商品价格为0.05~0.1元/单位，部分实验室由于情况不同而自制Taq DNA聚合酶。然而，并非所有采用自制Taq DNA聚合酶的实验室都能制得理想的Taq DNA聚合酶。为此，利用培养载有Taq DNA 聚合酶基因的BL21(DE)3工程菌，通过控制表达条件，可以使Taq DNA聚合酶获得较高的表达效率。在此基础上，通过分离纯化，制得较高纯度的重组Taq DNA聚合酶，为分子生物学创新实验的开设和实验室成本的降低开辟了新的途径[2]。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 Taq DNA聚合酶基因以表达载体

插入Taq DNA聚合酶基因的pTaq表达质粒（由郭江波老师提供），该质粒可在大肠杆菌中高效表达。pTaq质粒全长5166bp，具有T7噬菌体强启动子，在其多克隆位点的上游和下游都含有六聚组氨酸（his taq）标签蛋白基因,载体上还含有一个氨苄青霉素抗性基因的筛选标记。

1.1.2菌种

本实验所用菌种为BL21(DE)3菌株，即宿主菌BL21经噬菌体λDE3溶源化后，λDE3的LacUV5强启动子及其位于其下游的T7RNA聚合酶基因被整合到宿主菌的基因组DNA中。宿主菌在诱导剂非消化性乳糖类似物IPTG（异丙基-β-D-巯基半乳糖甘）诱导下，产生大量

的T7RNA聚合酶，而T7RNA聚合酶能够特异性的识别pTaq质粒上的T7启动子序列，从而高效表达目的蛋白，此蛋白为可溶性蛋白。由于IPTG不能被宿主菌利用，因此，向培养液中加入少量的IPTG就能对LacUV5强启动子产生持久的诱导作用[3]。

1.1.3培养基

菌种的筛选采用LB固体培养基（1g胰化蛋白胨+0.5g酵母提取物+1gNaCL+1.5g琼脂糖，定容至100ml）+氨苄青霉素（终浓度为100mg/L）；菌种的扩大培养采用LB液体培养基（1g 胰化蛋白胨+0.5g酵母提取物+1gNaCL，定容至100ml）+氨苄青霉素（终浓度为100mg/L）；菌种的保存采用LB液体培养基+40%甘油（终浓度）+氨苄青霉素（终浓度为100mg/L）[4]。

1.2方法

1.2.1感受态细胞的制备及转化

用CaCL2法制备感受态细胞[5]，并分装成200μL/份进行保存。取一管感受态细胞，加入0.5μL插入了Taq DNA聚合酶基因的pTaq表达质粒载体，混匀后在冰上放置30min，然后迅速将管放入42℃水浴中90s，再快速转移到冰上2min，接下来向管中加入800μL LB培养基，将管移到37℃水浴摇床上温浴45min，使细菌复苏。

1.2.2筛选阳性克隆子

分别取100μL感受态细胞和100μL上述转化后的细胞分别涂布在含有氨苄青霉素（终浓度为100μg/ml）的LB固体培养基平板上，37℃过夜培养。结果涂有感受态细胞的培养基上不出现菌落，说明所用感受态细胞没有被污染,即没有氨苄青霉素抗性;涂有转化后细胞的培养基上出现菌落，说明转化成功,长出的菌落即为所需阳性克隆子。

1.2.3阳性克隆子生长曲线的测定

从阳性克隆子平板上挑取单菌落接种至5ml加有氨苄青霉素（终浓度为100μg/ml）的LB液体培养基中过夜培养，取1ml过夜培养的菌液接种至100ml含有氨苄青霉素（终浓度为100μg/ml）的LB液体培养基中，从接种1.5h起测定其OD值，直到OD值＞1.5为止[7]，然后制作阳性克隆子的生长曲线图，以便确定下一步加入诱导剂IPTG诱导的时间[6]。

1.2.4阳性克隆子的扩大培养和加入诱导剂诱导蛋白表达

取1ml过夜培养的菌液接种至100ml含有氨苄青霉素（终浓度为100μg/ml）的LB液体培养基中，扩大培养至OD值为0.5时，加入IPTG（终浓度为0.5mmol/L）诱导，继续培养5.0h，4000r./min离心10min收集菌体，以Buffer A(20mmol/LTris-HCL，PH8.0，5mmol/L EDTA)清洗两次，悬浮于Buffer A中，反复6次-70℃、75℃交替冻融；[3,8]12000r/min离心20min，取上清；上清中加入等体积的Buffer B(100mmol/LKCL，50mmol/LTris-HCL，0.2mmol/L EDTA，2mmol/LDTT（二硫苏糖醇）)，75℃水浴30min；12000r/min离心20min，取上清，加入等体积甘油，-20℃保存备用。

1.2.5聚丙烯酰胺凝胶电泳检测Taq DNA聚合酶蛋白是否表达成功。

取上述蛋白提取液100μL，加入等体积的2X溴酚蓝染液混匀，沸水中煮5min，待降至室温后加样进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）[9]。聚丙烯酰胺凝胶的配方如下表1.1和