Taq DAN polymerase的制备
Taq DNA聚合酶的热纯化制备
Taq DNA聚合酶的热纯化制备丁燕华;刘树涛;齐庆远【摘要】[ Objective ] The paper was to improve the preparation efficacy of Taq DNA polymerase. [ Method ] Ni column was used to purify Taq DNA polymerase carrying with 6xHis tag, and recombined vector. Using the thermal -resistant characteristics of TaqDNA polymerase, the crude extract was treated at 75 ℃ for 1 h, and the activity of prepared enzyme solution was verified by PCR test. [ Result] The recombinant pET-32A-Taq could highly express in BL21 (DE3) host bacteria and remove hybrid protein by thermal denaturation. The enzyme preparation with the activity further higher than purchased TaqDNA polymerase was obtained. [ Conclusion ] Taq DNA polymerase prepared by thermal purification method is simple with low cost, and can meet the needs of a large number of conventional PCR amplification.%[目的]提高Taq DNA聚合酶的制备效率.[方法]利用Ni柱亲和色谱纯化载有6xHis标记的Taq DNA聚合酶,并重组载体,利用Taq DNA聚合酶的耐热特性,对粗提液75℃处理1h,之后通过PCR试验验证制备酶液的活力.[结果]所获重组的pET-32A-Taq能够在BL21(DE3)宿主菌中高效表达并可通过热变性去除杂蛋白,获得了活力远高于购买的Taq DNA聚合酶的酶制剂.[结论]使用热纯化法制备的Taq DNA聚合酶工艺简单,成本较低,能满足常规大量PCR实验要求.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2011(039)017【总页数】3页(P10153-10155)【关键词】Taq DNA聚合酶;热纯化;pET-32A;BL21(DE3)【作者】丁燕华;刘树涛;齐庆远【作者单位】浙江师范大学化学与生命科学学院,浙江,金华,321004;浙江师范大学化学与生命科学学院,浙江,金华,321004;浙江师范大学化学与生命科学学院,浙江,金华,321004【正文语种】中文【中图分类】Q786Taq DNA聚合酶由水生嗜热菌(Thermus aquatics)YT-1菌株中分离而得。
热启动酶的原理及应用
热启动酶的原理及应用前言在现代生物科学研究中，热启动酶被广泛应用于DNA特异性放大技术，例如聚合酶链式反应（PCR）。
热启动酶是一种酶类蛋白，能够在高温条件下保持活性，具有特异性结合和扩增DNA的能力。
本文将介绍热启动酶的原理及其在科学研究和生物工程中的应用。
1. 热启动酶的原理热启动酶的原理基于一种天然存在的酶类蛋白，称为热稳定DNA多聚核苷酸激酶（Taq DNA polymerase）。
Taq DNA polymerase是从热温泉中的细菌Thermus aquaticus中分离得到的。
这种细菌栖息在温泉中，能够耐受高温环境。
因此，Taq DNA polymerase具备了在高温条件下保持稳定和具有DNA聚合能力的特点。
热启动酶通过添加特定的抑制剂和改变酶的活性形式，使其在低温下失去或降低DNA聚合酶活性，从而避免在PCR反应体系中的非特异性扩增。
当温度升高时，抑制剂被去除，酶活性被迅速激活，从而实现特异性DNA扩增。
2. 热启动酶的应用热启动酶作为PCR技术中常用的酶类蛋白，其应用非常广泛。
以下列举了一些热启动酶的主要应用领域：•分子生物学研究：热启动酶可用于DNA扩增、基因克隆、DNA测序等领域。
它的高温稳定性保证了PCR反应在高温环境下能够顺利进行，同时能够在DNA复制过程中起到高效率和高特异性的作用。
•医学诊断：PCR技术结合热启动酶的应用在医学诊断领域取得了重大突破。
例如，热启动酶可以检测疾病相关基因的突变，帮助诊断遗传性疾病、癌症等疾病。
•遗传学研究：热启动酶可以用于DNA指纹技术，通过扩增DNA重复序列，快速鉴定个体之间的遗传关系，对犯罪侦破、亲子鉴定等领域非常重要。
•生物工程：热启动酶在基因工程中常被用来扩增外源基因，从而用于遗传转化、重组蛋白表达等目的。
它的高特异性和高效率使得基因工程实验更加准确可靠。
•食品安全检测：热启动酶可以用于食品中病原菌和污染物的检测与鉴定，如大肠杆菌、沙门菌等。
Taq酶——精选推荐
Taq酶Taq 酶(2011-06-07 14:55:51)转载▼标签：taq 酶newprobe普博欣⽣物试剂杂谈分类：分⼦⽣物学试剂DNA polymerase（Taq DNA polymerase ）浓度2 U/µl注意事项：10×PCR Buffer冷冻后，Mg2＋会形成⼀个浓度梯度，使⽤时应该完全化冻并混匀，离⼼后再使⽤。
反应实验例：1.在⼀个⽆菌PCR反应管中加⼊以下成分成分名称加⼊量成分终浓度10×PCR Buffer with MgCl2 5 µl 1×dNTPs, 10mM each 1 µl200µM each上游引物 5–50 pmol 0.1–1.0 µM下游引物 5–50 pmol 0.1–1.0 µMDNA template variable <0.5 µg/50 µlTaq DNA polymerase (2U/µl)1µl 2 U/50 µl⽤⾼压灭菌双蒸⽔补⾄终体积50 µl。
实际操作中计算好需补加⽔的量后，建议先加⽔，然后按上述顺序添加其它成分。
充分混匀后，离⼼数秒使反应混合物沉到管底。
然后将反应管置于PCR仪中进⾏扩增。
2.PCR反应循环条件设置在PE9600型PCR仪上，扩增1.0 kb DNA⽚段的反应循环条件：94℃预变性5 min，然后按照下参数扩增25-35个循环：94℃变性30 sec，42-65℃退⽕30 sec，72℃延伸1-2 min，完成后，72℃后延伸5-10 min。
具体的退⽕温度由引物的Tm值决定。
各个温度持续的时间由扩增产物长度⽽定。
循环数主要取决于起始模板量。
Taq DNA polymerase的合成速度较快，每分钟延伸1-2 kb。
3.结果检测反应结束后，5µl扩增产物⽤含0.5µg/ml溴化⼄啶（或合适浓度的其它DNA染⾊试剂），合适浓度的琼脂糖凝胶电泳检测，电泳完成后在紫外透射仪下观察结果。
Taq DNA 聚合酶 说明书
Taq DNA Polymerase Taq DNA Polymerase 是耐热的DNA 聚合酶，具有5’-3’ DNA 聚合酶活性和双链DNA 特异的5’-3’外切核酸酶活性，无3’-5’外切酶活性。
使用该产品扩增得到的PCR 产物的3’末端附有一个“A ”碱基，可直接用于TA 克隆。
■产品说明PCR 、TA 克隆。
■应用范围用活性化的大马哈鱼精子DNA 作为模板/引物，在74℃，30分钟内，将10 nmol 脱氧核苷酸摄入为酸不溶物质所需要的酶量定义为1个活性单位（U ）。
■活性定义无核酸内切、外切酶活性，也无核酸污染，其酶纯度检测大于99％。
■品质保证产品内容Taq DNA Polymerase （5U/µl ）2+10×Taq Reaction Buffer （Mg plus ）10 mM dNTP 保存条件：-20 ℃. E coli 重组蛋白。
■来源20mM Tris-Cl (pH 8.0), 100mM KCl, 0.1mM EDTA, 1mM DTT, 0.5%Nonidet P-40, 0.5%Tween-20和50% 甘油。
■储存缓冲液10×Taq Reaction Buffer ：100mM Tris-Cl(pH8.3@25℃), 500mM KCl, 15mM MgCl 。
2■反应缓冲液GeneCopoeia Inc.19520 Amaranth DriveGermantown, Maryland 20874USATel: 301-515-6982; 1-866-360-9531Fax: 301-515-6983Web: 产品套装编号: C0101A , 本套装包含以下产品:产品编号C01010A C01011A C10010C包装规格200µl1.25ml ×20.5mlTaq DNA 聚合酶生产经销商:能基因广州复能基因有限公司广州高新技术产业开发区广州科学城掬泉路3号广州国际企业孵化器D 区8楼 (邮编: 510663)技术热线: 020-******** 电子邮箱: support @ 网址:■基本反应条件体系：1、PCR 10× Reaction Buffer Primer1Primer210mM dNTP TemplateTaq DNA Polymerase ddH O22.5µl0.5µl1~100ng(质粒)10~1,000ng(基因组)0.2µl up to 25µl反应物组成体积终浓度l ×0.2~1µM 0.2~1µM0.2mM1U /Reaction条件：2、PCR 94℃94℃Tm -5℃72℃72℃4℃2 min 30 sec 30 sec 1kb/min 7 min hold30 cycles}1. PCR 反应条件应根据模板、目的片段大小、引物结构等具体条件不同，设定最佳反应条件。
基因重组TaqDNA聚合酶的制备
收稿日期:2007-07-18基金项目:河南省科技厅自然科学基金(编号:511042300),河南省科技攻关资助项目(编号:624410041)作者简介:王天云(1968-),男,山东人,副教授,博士,研究方向为真核基因表达调控与基因工程。
基因重组Taq DNA 聚合酶的制备王天云1,秦 川2,杨 瑞2,杨献军2(1.新乡医学院生物化学与分子生物学教研室,河南 新乡 453003;2.新乡医学院分子生物学研究室,河南 新乡453003)摘要: 目的 制备重组Taq D NA 聚合酶,为PCR 提供试剂。
方法 用Taq D NA 聚合酶基因的p Taq 表达质粒转化E.coli 菌株,异丙基硫代2B 2D 2半乳糖苷(IPT G )诱导12h 表达Taq D NA 聚合酶,溶菌酶、NP40裂解细菌,硫酸铵沉淀、4e 透析,SDS 2聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS 2PAGE )和PCR 扩增分析其纯度和活性。
结果 分离纯化制备的Taq 酶,纯度、活性都可与同类产品相比,能有效扩增DN A 片段。
结论 该方法制备可用于PCR 的Taq 酶具有快速简便的优点。
关键词: Taq DNA 聚合酶;基因工程;分离纯化中图分类号:Q783 文献标识码:A 文章编号:100427239(2007)0620551203P repar a tion of r eco m b i n an t Taq DNA polym era se WANG T ian 2yun 1,Q IN Chuan 2,YANG Ru i 2,et a l(1.De par t m ent of B ioche m istry and M olecular B iology ,Xinxi a ng M edica l College ,X i nxiang 453003,China;bora tory o f M o 2lecul a r B iology ,X inxi a ng M e d ica l C ollege ,Xinxi a ng 453003,Chi na )Abstr ac t : Ob jec ti ve To prepa re reco m bi nant Taq DNA poly m erase for PCR.M e thods Taq DNA poly m erase was ex 2pressed i n reco mb i nant E .coli stra i n under i sopro py 2B 2D 2thiogalactoside(IPTG)inductio n for 12h ,d isrupted w i th l ysozy m e and NP 40,follo wed d i a l yzed a t 4e .Purificati on and activiti es of pol y m erase were analyzed under sodi u m dodecyl su lfate pol yacryl 2am ide gel electropheres i s (SDS 2PAGE)and pol y me rase cha i n reac ti on(PCR )m e t hods .R esults The prepared pol y m erase pur i 2fi catio n and acti vities could co mpare with the same product can be used to amp lify the DN A frag m ent .C onc l u sion The pre 2pared m e t hods of reco m binant Taq D NA poly m erase i n our laboratory are si m ple and rap i d l y .K ey word s : Taq D NA poly m erase ;gene engi neer i ng ;separa ti on and pur ifi catio n自从1985年Mu llis [1]提出聚合酶链式反应(pol y m erase chai n reaction,PCR )以来,PCR 技术发展十分迅速,并被广泛应用于生物学、医学等相关学科领域。
Taq DNA聚合酶的制备和纯化
Taq DNA聚合酶的制备和纯化詹庆才;詹祎捷;刘之熙;朱克永【摘要】Taq DNA聚合酶是分子生物学研究中最常用的热稳定DNA聚合酶之一.试验利用含Taq DNA聚合酶基因的pTaq表达质粒转化大肠杆菌E.coli菌株,用异丙基硫代-β-D-乳糖苷(IPTG)诱导表达耐热Taq DNA聚合酶;采用热变性沉淀杂蛋白,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测纯度,Bio-Rex 70柱层析纯化蛋白,PCR反应检测Taq DNA聚合酶的浓度和活性.结果表明:分离纯化制备的Taq DNA聚合酶,其纯度、酶活性和酶特异性均达到市售的Taq DNA聚合酶水平.【期刊名称】《湖南农业科学》【年(卷),期】2013(000)013【总页数】3页(P10-11,15)【关键词】Taq DNA聚合酶;Bio-Rex 70柱层析;聚丙烯酰胺凝胶电泳;PCR【作者】詹庆才;詹祎捷;刘之熙;朱克永【作者单位】湖南省水稻研究所,湖南长沙410125;北京联合大学应用文理学院,北京100083;湖南省水稻研究所,湖南长沙410125;湖南省水稻研究所,湖南长沙410125【正文语种】中文【中图分类】Q814.1PCR技术被广泛应用于分子生物学、食品科学、医学等相关研究领域。
作为PCR技术的主要试剂的Taq DNA聚合酶用量日益增多。
而目前大多数实验室主要依赖公司商品化的Taq DNA聚合酶。
为了降低研究和开发成本，一些实验室利用不同的分离纯化方法生产Taq DNA聚合酶[1-4]。
湖南省水稻研究所生物技术室利用含Taq DNA聚合酶基因的p Taq表达质粒转化大肠杆菌E.coli菌株，诱导表达耐热Taq DNA聚合酶，然后提取纯Taq DNA聚合酶，并用考马斯亮蓝法和PCR分析其纯度、浓度和活性。
该技术旨在制备Taq DNA聚合酶，降低分子生物学实验成本。
1 材料与方法1.1 材料含Taq酶基因的载体p Taq由中国科学院遗传与发育研究所提供，氨苄青霉素（Amp）、溶菌酶、苯甲基磺酰氟（PMSF）、异丙基硫代-b-D-半乳糖苷（IPTG）、Taq DNA 聚合酶、DNA Marker等生物化学试剂购自鼎国生物科技有限公司。
Taq DNA Polymerase使用说明书
Taq DNA Polymerase( Buffer+ )使用说明书储存：－20 ℃保存。
浓度：5U/µl制品说明：Taq DNA Polymerase 是从克隆有Thermu aquaticus DNA Polymerase 基因的大肠杆菌经诱导表后分离纯化的，其分子量为94 KD。
Taq DNA Polymerase具有5′-3′DNA聚合酶活性和5′-3′外切核酸酶活性，无3′-5′外切酶活性。
在PCR反应中，Taq DNA Polymerase 延伸速度为1-2kb/分钟，产物3′端带A，可直接用于T/A载体克隆。
活性单位：1 单位（U）Taq DNA Polymerase 活性定义为在74℃、30分钟内，以活性化的大马哈鱼精子DNA 作为模板引物，将10 nmol脱氧核苷酸掺入到酸不溶物质所需的酶量。
质量控制：SDS-PAGE 检测纯度大于99%，经检测无外源核酸酶活性；PCR方法检测无宿主残余DNA，能有效地扩增人基因组中的单拷贝基因；室温存放一周，无明显活性改变。
酶贮存缓冲液：20mM Tris-HCl (pH8.0)， 0.1 mM EDTA， 1mM DTT， 100 mM KCl， Stabilizers， 50% glycerol。
10×Taq Buffer (含Mg2+)：200 mM Tris-HCl (pH 8.4)， 200 mM KCl， 100 mM(NH4)2SO4，15 mM MgCl2，其他成分。
★ 10×Taq Buffer 分为含Mg2+和不含Mg2+ 两种，可自选。
★不含Mg2+ 的Buffer，另外配有25 mM MgCl2。
★如果没有特别指定，通常提供的为含有Mg2+的Buffer。
适用范围：一般用于DNA片断的PCR扩增、DNA标记、引物延伸、序列测定、平末端加A 等，产物可以直接用于T/A载体克隆。
建议的PCR 条件： (以 50 μl 反应体系为例)Template ＜0.5 μgForward Primer (10 μM) 1 μlReverse Primer (10 μM) 1 μl10×Buffer+ （with mgcl2） 5 μldNTP Mixture(各2.5mM) 4 μlTaq DNA polymerase(5U/μl) 0.5～1 μldH2O up to 50 μlPCR 反应循环的设置：94o C: 2-5 min94o C: 30 sec50-60o C: 30 sec30 cycles72o C: 1 min/1-2 kb72o C: 5-10 minNOT FOR HUMAN OR DRUG USE完。
TaqDNA聚合酶
TaqDNA聚合酶科技名词定义中文名称：TaqDNA聚合酶英文名称：Taq DNA polymerase定义：编号：EC 2.7.7.7。
存在于水生嗜热菌(Thermus aquaticus)的嗜热DNA聚合酶，可在74℃复制DNA，在95℃仍具有酶活力。
该酶可在离体条件下，以DNA为模板，延伸引物，合成双链DNA。
这个酶只有5′→3′DNA聚合酶活性和5′→3′的外切酶活性，缺少3′→5′的外切酶活性。
目录Taq DNA聚合酶是从一种水生栖热菌(Thermusaquaticus)yT1株分离提取的.yT是一种嗜热真细菌，能在70～75℃生长.该菌是1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉中分离的。
该酶基因全长2496个碱基，编码832个氨基酸，酶蛋白分子为 94KDa.其比活性为200000单位/mg.75～80℃时每个酶分子每秒钟可延伸约150个核苷酸，70℃延伸率大于60个核苷酸/秒，55℃时为24个核苷酸/秒.温度过高(90℃以上) 或过低(22℃)都可影响Taq DNA聚合酶的活性，该酶虽然在90℃以上几乎无DNA合成，但确有良好的热稳定性，在PCR循环的高温条件下仍能保持较高的活性.在92.5℃、95℃ 、97.5℃时，PCR混合物中的Taq DNA聚合酶分别经130min，40min 和5～6min后，仍可保持50%的活性，实验表明.PCR反应时变性温度为95℃～20sec，50个循环后，Taq DNA聚合酶仍有65%的活性.Taq DNA聚合酶的热稳定性是该酶用于PCR反应的前提条件，也是PCR反应能迅速发展和广泛应用的原因.Taq DNA聚合酶还具有逆转录活性，其作用于类似逆转录酶.此活性温度一般为65～68℃，有Mn2+存在时，其逆转录活性更高.TaqDNA 聚合酶是Mg2+依赖性酶，该酶的催化活性对Mg2+浓度非常敏感.以活性程度 很低的鲑鱼精子DNA 为模板，dNTP 的浓度为0.7～0.8mmol/L 时，用不同浓度Mg2+进行 PCR 反应10min ，测定结果为Mgcl2浓度在2.0mmol/L 时该酶催化活性最高，此浓度能最 大限度地激活TaqDNA 聚合酶的活性，Mg2+过高就抑制酶活性，当Mgcl2浓度在 10mmol/L 时可抑制40～50%的酶活性.由于Mg2+能与dNTP 结合而影响PCR 反应液中游离 的Mg2+浓度，因而Mgcl2的浓度在不同的反应体系中应适当调整，优化浓度.一般反应 中Mg2+浓度至少应比dNTP 总浓度高0.5～1.0mmol/L.适当浓度的KCL 能使Taq DNA 聚合 酶的催化活性提高50～60%，其最适浓度为50mmol/L ，高于75mmol/L 时明显抑制该酶 的活性.该酶无校对活性，易产生错配碱基。
上海硕美生物 Taq DNA polymerase 说明书
使用说明书名称：Taq DNA polymerase包装量：200U浓度：5U/ul10 X Reaction buffer（Mg2+ free）:1ml 25mM MgCl2:1ml保存温度：-20℃制品说明：本制品是94KDa的耐热性Taq DNA聚合酶（简称Taq酶）。
基因来源为Thermus aquaticus DNA polymerase，将其克隆到大肠杆菌中进行表达后，分离提取而得到的。
其具有与天然Taq DNA聚合酶相同的功能。
Taq酶可以催化5’至3’方向的依赖于DNA模板的脱氧核苷酸的聚合。
Taq酶不具有3’到5’的外切酶活性。
活性定义：用活化的大马哈鱼精子DNA 作为模板/引物，在74℃下，30分钟内，将10nmol的全核苷酸转化为酸性不溶物的活性所需要酶量为1个活性单位。
纯度：1）SDS-PAGE电泳纯度：将50U酶行SDS-PAGE电泳，经考马斯亮蓝染色，其纯度大于90%。
2）核酸酶1：将10U的酶与1ug λDNA 在50ul反应体系中，25℃反应8小时，45℃反应4个小时，74℃反应4个小时，经琼脂糖电泳，电泳条带不发生变化。
2：将10U的酶与1ugλDNA/Hind III 在50ul反应体系中，25℃反应8个小时，45℃反应4个小时，74℃反应4个小时，经琼脂糖电泳，电泳条带不发生变化.3：将10U的酶与1ug 超螺旋质粒pGEM3Zf在50 ul反应体系中，25℃反应8个小时，45℃反应4个小时，74℃反应4个小时，经琼脂糖电泳，电泳条带不发生变化.用途：1）PCR法扩增DNA2）DNA标记3）测序PCR反应性能：1）以λDNA为模板，可以很好地扩增8Kbp的DNA片段。
2）以人基因组DNA为模板，可很好的扩增2.9Kbp的DNA片段。
3）以人基因组DNA为模板，可在反应体系中目的基因为100拷贝的情况，扩增出目的片段。
4）PCR产物带有3’A，可以直接用于基于T载体的PCR片断克隆。
TaqDNA polymerase酶提纯方法
TaqDNA polymerase酶提纯方法1.划Ampicillin 凝胶平板37℃过夜；2.取单个菌斑，接种3ml LB super broth media+100ug/ml Amp. 37℃过夜，摇床培养；3.取0.1ml过夜细菌培养，加到100ml LB super media+100ug/ml Amp，37℃摇床培养到OD600=0.3，然后加入IPTG到0.5mM，然后继续摇床培养16h（此时，可留2ml作为SDS-PAGE分析（溶于Lammaeli buffer），另2ml作酶活性分析（保存于50% glycerol at -20℃））；4.离心（5000*rpm）搜集细菌，重新溶于3ml Buffer A（50mM Tris-HCl，PH7.9，50mM dextrose，1mM EDTA）+4mg/ml Lysozyme(Sigma),室温裂解15min；5.加入3ml Buffer B（10mM Tris-HCl，PH7.9，50mM KCl，1mM EDTA，0.5% Tween20,0.5% NP-40）。
混匀，于75℃水浴中摇60分钟；6.4℃离心10min，12000*rpm，用Sorvall RC2B超速离心机，SS34 Rotor；7.取上清裂解液，加入等量（6ml）的Storage Buffer（50mM Tris-HCl，PH8.0,100mMNaCl，0.1mM EDTA，0.5mM DTT，1% Triton X-100）含50% Glycerrol；混匀，再加入等量（12ml）的Storage Buffer含75% Glycerol。
再混匀。
储存在-20℃。
8.测蛋白质浓度（Bio-Rad kit，at 595nm）；9.跑SDS-PAGE检测Taq酶的纯度；10.Taq酶活性检测。
将提纯的Taq酶用Buffer B作对倍稀释一直到1:1600倍。
用买来的PromegaTaq酶作参照，进行PCR反应。
Taq DNA polymerase purification
Taq DNA Polymerase Purification Protocol一、菌种复苏从-80℃冰箱取一管Taq菌液，划线接种羧苄（Carbenicillin，100ug/mL）LB平板，37℃培养过夜，挑取单克隆进行实验。
二、培养和诱导（1）从平板上挑单克隆接入10mL LB液体（100ug/ml Carb）中，37℃200rpm培养过夜。
（2）按1:100比例接入新鲜LB液体（100mg/ml Carb）中，37℃200rpm培养6小时。
（3）加入IPTG至终浓度120mg/L，37℃200rpm继续培养12小时。
三、Taq提取（1）将菌液分装到50mL离心管中，4℃3600rpm离心10min收集菌体。
（2）每50mL菌液（一管）加入10mL Buffer A重悬菌体，4℃3600rpm离心10min收集菌体。
（3）每50mL菌液（一管）加入4mL Buffer A及16mg溶菌酶，震荡混匀，室温放置15min（即用Buffer A配制溶菌酶使其浓度为4mg/mL）。
（4）每50mL菌液（一管）加入4mL Buffer B，75℃水浴60min，迅速至冰上冷却10min。
（5）4℃3600rpm离心50min，收集上清至干净的50mL离心管中。
（6）每100mL上清液加入30g(NH4)2SO4粉末（相当于每50mL菌液加入2.4g硫酸铵），加入时迅速搅拌，均匀缓慢加入，约持续2小时。
（7）4℃3600rpm离心50min，收集蛋白沉淀（管底和液体表面一层）。
（8）每管加入1mL Buffer A（可增加Buffer A用量）。
（9）用1L Buffer C透析过夜。
（10）用1L Storage Buffer透析12小时，可重复一次。
（11）PCR鉴定活性，确定适当稀释倍数。
溶液配制：Buffer A：母液100mL的加入量终浓度1M Tris-HCl,pH=8.05mL50mMGlucose0.9g50mM0.5M EDTA,pH=8.00.2mL1mMBuffer B：母液50mL的加入量终浓度1M Tris-HCl,pH=8.00.5mL10mM2M KCl 1.25mL50mM0.5M EDTA,pH=8.00.1mL1mM0.1M PMSF0.5mL1mMTween-200.25mL0.5%NP-400.25mL0.5%PMSF（苯甲基磺酰氟）在水溶液中不稳定，应以异丙醇0.1M母液，使用前加入到工作液中。
Taq DNA Polymerase
Taq DNA Polymerase简介：Taq DNA Polymerase 是通过大肠杆菌表达纯化的重组酶，其基因来源于 Thermus aquaticus polymerase ，该蛋白分子量为 94 kDa ，具有 5′→ 3′DNA 聚合酶活性和 5′→ 3′外切核酸酶活性，无 3′→ 5′外切核酸酶活性，扩增得到的 PCR 产物 3′端附有一个“A ”碱基，因此可直接用于 T/A 克隆。
本产品具有延伸速度快、扩增效率高的特点，主要适用于 PCR 法扩增 DNA 片段、DNA 序列测定等实验。
组成：单位定义：用活性化的大马哈鱼精子 DNA 作为模板 / 引物，在74℃，30 分钟内，将10nmol 脱氧核苷酸掺入到酸性不溶物质所需的酶量定义为1个活性单位（U ），浓度：5U/ul质控：经过多次柱纯化，SDS-PAGE 检测其纯度大于 99%；经检测无外源核酸酶活性；PCR 方法检测无宿主残余DNA ；能有效地扩增人基因组中的单拷贝基因；室温存放一个月，无明显活性改变。
操作步骤(仅供参考)：以下举例为常规 PCR 反应体系和反应条件，实际操作中应根据模板、引物结构和目的片段大小不同进行相应的改进和优化。
(1)PCR 反应体系(50μl)试剂加入量 终浓度10×T aq PCR Buffer 5μl 1× dNTP Mix ，2.5 mM each 4μl 200μM each Forward Primer ，10μM 2μl 0.4μM Reverse Primer ，10μM 2μl 0.4μM Template DNA <1μg <1μg/reactionTaq DNA Polymerase(5U/μl) 0.25μlRNase-Free Waterup to 50μl编号 名称NP0101NP0101Storage Taq DNA Polymerase(5U/μl) 500U1000U-20℃ 10×T aq PCR Buffe r 1 ml 2×1ml -20℃使用说明书1份注意：a、引物浓度请以终浓度0.1-1.0μM 作为设定范围的参考，扩增效率不高的情况下，可提高引物的浓度；发生非特异性反应时，可降低引物浓度。
TaqDNAPolymerase（普通PCR酶）
TaqDNAPolymerase（普通PCR酶）产品说明：本酶由克隆有Thermus aquaticus DNA Polymerase基因的大肠杆菌诱导表达、分离纯化而成，其分子量为94 kDa。
T aq DNA Polymerase具有5’→ 3’聚合酶活性和5’→ 3’外切酶活性，无3’→ 5’外切酶活性。
TaqDNA Polymerase配合经优化的2 × TaqPCR Buffer (Mg2+ plus)，具有极高的扩增效率。
应用：●常规快速PCR扩增，最高可扩增8 kb产品规格：产NPP101-01 NPP101-02品组分TaqDNA Polymerase (5 U/ul) 100 ul2 ×TaqPCR Buffer (Mg2+ plus)3 × 2 ml NPP101-01 × 5 dNTP Mix (10 mM each) 250 ul活性定义：用活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物，在74℃，30分钟内，使10 nmol的dNTPs掺入酸不溶性物所需的酶量定义为一个活性单位（U）。
纯度：1）10 U的本酶和0.6 ug的λ-Hind III 在74℃下反应1小时，DNA的电泳谱带不发生变化。
2）10 U的本酶和0.6 ug的supercoiled pUC19 DNA在74℃下反应1小时，DNA的电泳谱带不发生变化。
应用案例：【以λDNA为模板扩增1、3、5、8 kb的DNA片段】1、按下列组份配制PCR反应液H2O 21.5 - x ul2 ×TaqPCR Buffer25 ul(Mg2+ plus)dNTP Mix (10 mM each) 1 ul10 uM 正向引物 1 ul10 uM 反向引物 1 ul模板DNA x ul (< 5 ul)TaqDNA Polymerase (5 U/ul) 0.5 ul2、PCR反应条件95℃ 5 min95℃30 sec60℃30 sec 35 cycles｝72℃ 1 min/kb72℃ 5 min3、PCR扩增结果货号产品名称规格售价备注NPP101-01 Taq DNA Polymerase 500 U 140普通taq酶NPP101-02 Taq DNA Polymerase 500 U×5680。
Taq酶
Taq 酶(2011-06-07 14:55:51)转载▼ 标签：taq 酶newprobe普博欣生物试剂杂谈 分类： 分子生物学试剂DNA polymerase（Taq DNA polymerase ）浓度2 U/μl注意事项：10×PCR Buffer冷冻后，Mg2＋会形成一个浓度梯度，使用时应该完全化冻并混匀，离心后再使用。
反应实验例：1.在一个无菌PCR反应管中加入以下成分成分名称加入量成分终浓度10×PCR Buffer with MgCl2 5 μl 1×dNTPs, 10mM each 1 μl200μM each上游引物 5–50 pmol 0.1–1.0 μM下游引物 5–50 pmol 0.1–1.0 μMDNA template variable <0.5 μg/50 μlTaq DNA polymerase (2U/μl)1μl 2 U/50 μl用高压灭菌双蒸水补至终体积50 μl。
实际操作中计算好需补加水的量后，建议先加水，然后按上述顺序添加其它成分。
充分混匀后，离心数秒使反应混合物沉到管底。
然后将反应管置于PCR仪中进行扩增。
2.PCR反应循环条件设置在PE9600型PCR仪上，扩增1.0 kb DNA片段的反应循环条件：94℃预变性5 min，然后按照下参数扩增25-35个循环：94℃变性30 sec，42-65℃退火30 sec，72℃延伸1-2 min，完成后，72℃后延伸5-10 min。
具体的退火温度由引物的Tm值决定。
各个温度持续的时间由扩增产物长度而定。
循环数主要取决于起始模板量。
Taq DNA polymerase的合成速度较快，每分钟延伸1-2 kb。
3.结果检测反应结束后，5μl扩增产物用含0.5μg/ml溴化乙啶（或合适浓度的其它DNA染色试剂），合适浓度的琼脂糖凝胶电泳检测，电泳完成后在紫外透射仪下观察结果。
Taq酶提取protocal
Rapid Purification of High-activity Taq DNA Polymerase 本次试验历时六天，分为准备工作（两天），酶的诱导表达（一天），酶的提取（一天），酶的透析以及酶的保存（两天）。
下面按时间顺序叙述。
第一天准备工作（1）清洗器皿。
100ml量筒：3－4个1000ml量筒：1－2个500ml量筒：2－3个250ml量筒：1个（没有亦可）1000ml烧杯：2个小烧杯：2个500ml三角瓶：1个150ml三角瓶：2－3个500ml离心管：4个250ml离心管：2or4个50ml离心管：12or6个10ml移液管：5－6个药勺：3－4个透析袋+超纯水（灭菌）透析夹+超纯水（灭菌）细菌滤+滤膜（灭菌，切勿烤干！）枪头（1ml1－2盒，0.2ml2盒）小管（1.5ml1瓶，灭菌）定性滤纸：两包新的10ml离心管：灭菌，保存酶用。
磁转子：蒸馏水洗，不必灭菌。
同时准备一大瓶超纯水备用。
Note：（一）整个清洗过程都要戴手套（干燥后操作要戴PE手套）。
（二）器皿最后都要用超纯水润洗，倒放在滤纸上干燥。
包上牛皮纸灭菌。
（三）离心管干燥后封口灭菌。
（四）药勺用盐酸处理除去污渍锈斑，灭菌。
（2）配LB培养基。
（按照分子克隆实验指南配方）2L灭菌。
预备明晚摇菌。
（3）菌种活化，划单斑。
取98.11的DJP菌种划单斑，37℃培养，预备明晚摇菌。
Note：提取Taq酶每次只用上次保存的菌种，每次摇菌后都要保存菌种！PROCEDURAL EXPLANATION：作蛋白表达的细菌和感受态细菌都要经过转瓶活化过程。
第二天准备工作（1）将昨晚划的平板放在4℃预备晚上摇菌。
（2）配溶液Buffer A，Lysis Buffer，Storage Buffer并灭菌。
Buffer A：50mM Tris－HCl pH7.950mM Dextrose1mM EDTA－K+配法：（FOR 400ml induce Pre－Lysis Buffer）1M Tris－HCl（pH7.9）20ml0.5M EDTA－K+（pH7.9）0.8mlDextrose 3.6g加超纯水至390ml，pH计调至7.9，定容至400ml。
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Taq DAN polymerase的制备生技07-1 吴亚坤指导教师郭江波讲师摘要为节约试验成本，我们实验室制备了Taq DNA聚合酶，主要方法如下：用含有Taq DNA聚合酶基因的pTaq表达质粒转化BL21(ED)3菌株，用IPTG诱导表达Taq DNA聚合酶，用高速离心法收集菌体，然后用快速冻融法进行纯化，除去细胞碎片以及核酸蛋白等复合物。
在SDS-PAGE电泳检测目的蛋白是否诱导表达后，我们用制备的Taq酶进行PCR反应以检测Taq DNA 聚合酶的活力、敏感性和特异性等特征。
关键词Taq DNA聚合酶；表达；纯化Abstract In order to reduce the costs of molecular biology experiments in our lab, we performed Taq DNA polymerase production in laboratory as following procedures: the strain of BL21(DE)3 was transformed with plasmid pTaq expressing Taq DNA polymerase gene. Then the positive colonies were induced by IPTG and collected with high speed centrifugation. Enzyme was purified with high speed freeze-thaw After SDS-PAGE electrophoresis to test whether target proteins were induced by IPTG, then PCR amplification was carried out to test the activity and purity of extracted Taq DNA polymerase.Key Words Taq DNA polymerase；expression；purification前言自从Randall K.Saiki 等将耐热的Taq DNA polymerase 应用于PCR技术以后,Taq DNA聚合酶在分子生物学试验中越来越重要[1].目前市场上有进口分装和国产两类Taq DNA聚合酶,产品质量在不断提高,而生产成本却在不断降低.目前Taq DNA聚合酶的最低商品价格为0.05~0.1元/单位，部分实验室由于情况不同而自制Taq DNA聚合酶。
然而，并非所有采用自制Taq DNA聚合酶的实验室都能制得理想的Taq DNA聚合酶。
为此，利用培养载有Taq DNA 聚合酶基因的BL21(DE)3工程菌，通过控制表达条件，可以使Taq DNA聚合酶获得较高的表达效率。
在此基础上，通过分离纯化，制得较高纯度的重组Taq DNA聚合酶，为分子生物学创新实验的开设和实验室成本的降低开辟了新的途径[2]。
1 材料与方法1.1材料1.1.1 Taq DNA聚合酶基因以表达载体插入Taq DNA聚合酶基因的pTaq表达质粒（由郭江波老师提供），该质粒可在大肠杆菌中高效表达。
pTaq质粒全长5166bp，具有T7噬菌体强启动子，在其多克隆位点的上游和下游都含有六聚组氨酸（his taq）标签蛋白基因,载体上还含有一个氨苄青霉素抗性基因的筛选标记。
1.1.2菌种本实验所用菌种为BL21(DE)3菌株，即宿主菌BL21经噬菌体λDE3溶源化后，λDE3的LacUV5强启动子及其位于其下游的T7RNA聚合酶基因被整合到宿主菌的基因组DNA中。
宿主菌在诱导剂非消化性乳糖类似物IPTG（异丙基-β-D-巯基半乳糖甘）诱导下，产生大量的T7RNA聚合酶，而T7RNA聚合酶能够特异性的识别pTaq质粒上的T7启动子序列，从而高效表达目的蛋白，此蛋白为可溶性蛋白。
由于IPTG不能被宿主菌利用，因此，向培养液中加入少量的IPTG就能对LacUV5强启动子产生持久的诱导作用[3]。
1.1.3培养基菌种的筛选采用LB固体培养基（1g胰化蛋白胨+0.5g酵母提取物+1gNaCL+1.5g琼脂糖，定容至100ml）+氨苄青霉素（终浓度为100mg/L）；菌种的扩大培养采用LB液体培养基（1g 胰化蛋白胨+0.5g酵母提取物+1gNaCL，定容至100ml）+氨苄青霉素（终浓度为100mg/L）；菌种的保存采用LB液体培养基+40%甘油（终浓度）+氨苄青霉素（终浓度为100mg/L）[4]。
1.2方法1.2.1感受态细胞的制备及转化用CaCL2法制备感受态细胞[5]，并分装成200μL/份进行保存。
取一管感受态细胞，加入0.5μL插入了Taq DNA聚合酶基因的pTaq表达质粒载体，混匀后在冰上放置30min，然后迅速将管放入42℃水浴中90s，再快速转移到冰上2min，接下来向管中加入800μL LB培养基，将管移到37℃水浴摇床上温浴45min，使细菌复苏。
1.2.2筛选阳性克隆子分别取100μL感受态细胞和100μL上述转化后的细胞分别涂布在含有氨苄青霉素（终浓度为100μg/ml）的LB固体培养基平板上，37℃过夜培养。
结果涂有感受态细胞的培养基上不出现菌落，说明所用感受态细胞没有被污染,即没有氨苄青霉素抗性;涂有转化后细胞的培养基上出现菌落，说明转化成功,长出的菌落即为所需阳性克隆子。
1.2.3阳性克隆子生长曲线的测定从阳性克隆子平板上挑取单菌落接种至5ml加有氨苄青霉素（终浓度为100μg/ml）的LB液体培养基中过夜培养，取1ml过夜培养的菌液接种至100ml含有氨苄青霉素（终浓度为100μg/ml）的LB液体培养基中，从接种1.5h起测定其OD值，直到OD值＞1.5为止[7]，然后制作阳性克隆子的生长曲线图，以便确定下一步加入诱导剂IPTG诱导的时间[6]。
1.2.4阳性克隆子的扩大培养和加入诱导剂诱导蛋白表达取1ml过夜培养的菌液接种至100ml含有氨苄青霉素（终浓度为100μg/ml）的LB液体培养基中，扩大培养至OD值为0.5时，加入IPTG（终浓度为0.5mmol/L）诱导，继续培养5.0h，4000r./min离心10min收集菌体，以Buffer A(20mmol/LTris-HCL，PH8.0，5mmol/L EDTA)清洗两次，悬浮于Buffer A中，反复6次-70℃、75℃交替冻融；[3,8]12000r/min离心20min，取上清；上清中加入等体积的Buffer B(100mmol/LKCL，50mmol/LTris-HCL，0.2mmol/L EDTA，2mmol/LDTT（二硫苏糖醇）)，75℃水浴30min；12000r/min离心20min，取上清，加入等体积甘油，-20℃保存备用。
1.2.5聚丙烯酰胺凝胶电泳检测Taq DNA聚合酶蛋白是否表达成功。
取上述蛋白提取液100μL，加入等体积的2X溴酚蓝染液混匀，沸水中煮5min，待降至室温后加样进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）[9]。
聚丙烯酰胺凝胶的配方如下表1.1和表1.2所示：表1.1 12%聚丙烯酰胺凝胶配方（分离胶，15 ml）试剂体积蒸馏水 4.95 ml1.5mol/LTris-HCL(pH=8.8) 3.75 ml30%丙烯酰胺 6.0 ml10%SDS 0.15 ml10%APS 150 μlTEMED 6.0 μl表1.2 5%聚丙烯酰胺凝胶配方（浓缩胶，3.95ml）试剂体积蒸馏水 2.75 ml1.0mol/LTris-HCL(PH8.8) 0.5 ml30%丙烯酰胺0.67 ml10%SDS 0.04 ml10%APS 0.04 μlTEMED 6.0 μl1.2.6自制酶的PCR反应及琼脂糖凝胶电泳检测所制Taq DNA聚合酶的生物活性在SDS-PAGE检测确实已诱导表达出目标蛋白后，取自制Taq DNA聚合酶做PCR反应，然后用反应产物进行琼脂糖凝胶电泳试验，检测自制酶的生物活性。
PCR所需各种试剂如下表1.3所示，PCR反应体系如下表1.4所示：表1.3 PCR所需要的各种试剂试剂生产厂家上下游引物上海生物工程有限公司Taq Reaction Buffer 南京博尔迪生物科技有限公司dNTPs 南京博尔迪生物科技有限公司Taq DNA polymerase 南京博尔迪生物科技有限公司MgCl2 南京博尔迪生物科技有限公司100 bp Marker 宝生物工程（大连）有限公司（TakaRa）1 Kbp Marker 南京博尔迪生物科技有限公司Lording Buffer 宝生物工程（大连）有限公司（TakaRa）表1.4 PCR反应体系体系药品①②③④⑤⑥⑦ddH2O 17.5ul 17.0ul 16.5ul 16.0ul 15.5ul 15.0ul 17.5ul 10×Taq buffer 2.5ul 2.5ul 2.5ul 2.5ul 2.5ul 2.5ul 2.5ul MgCl2 2.0ul 2.0ul 2.0ul 2.0ul 2.0ul 2.0ul 2.0ul 10M dNTP Mix 0.5ul 0.5ul 0.5ul 0.5ul 0.5ul 0.5ul 0.5ul 上游引物0.5ul 0.5ul 0.5ul 0.5ul 0.5ul 0.5ul 0.5ul下游引物0.5ul 0.5ul 0.5ul 0.5ul 0.5ul 0.5ul 0.5ul自制Taq DNA聚合酶0.5ul 1.0ul 1.5ul 2.0ul 2.5ul 3.0ul 3.5ul商品Taq DNA聚合酶------ ------ ------ ------ ------ ------ 0.5ul 模板DNA 1.0ul 1.0ul 1.0ul 1.0ul 1.0ul 1.0ul 1.0ul总体系25ul 25ul 25ul 25ul 25ul 25ul 25ul2 结果与分析2.1转化后的含有pTaq质粒的大肠杆菌BL21(ED)3阳性克隆子的筛选结果大肠杆菌BL21(ED)3本身不含有Amp抗性基因，因此不能在含有氨苄青霉素的LB固体培养基上生长。
而重组的表达质粒pTaq质粒上含有氨苄青霉素的抗性基因，会使转化后的菌体获得氨苄青霉素的抗性。
因此，在进行进一步试验以前，验证菌体是否已经获得氨苄青霉素抗性，成为检验是否可以诱导出Taq DNA聚合酶的一步至关重要的步骤。
阳性克隆子的筛选结果结果如下图2.1：由图2.1A可知，转化后的细胞在含有Amp的培养基上出现稀疏的菌落，说明转化成功，图A上的菌落为转化成功含有pTaq质粒的大肠杆菌BL21(ED)3菌落。