第二章_沉淀分离技术

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可逆变性：变性因子取出后，变性了的生 物大分子能恢复原来的基本构想，性能也 与变性前相差不大。 不可逆变性：与上述现象相反。 温和条件---变性易恢复 剧烈条件---变性多为不可逆变性
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pH、温度、重金属、有机溶剂、酸碱、其 他因素
3.变性后性质的改变：生物活性丧失、理 化性质变化 4.变性沉淀分离的方法：


2.有机沉淀剂沉淀分离法
多用于小分子物质、多糖、核酸等分离，通常使用有机物 作为沉淀剂，如丙酮、乙醇、甲醇等。


3.非离子多聚体沉淀剂分离法
用于大分子沉淀分离（酶、核酸、蛋白质、病毒、细菌）； 聚乙二醇
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沉淀分离技术常见方法


4.等电点沉淀法
利用两性电解质在等电点状态下的溶解度最低而沉淀析出。 如，大豆蛋白“碱提酸沉”
Cohn表达式





Ks:盐析常数，取决于盐的性质、离子价数及平均半 径 I :离子强度I=1/2 ΣMz2 M:溶液中各种离子的物质的量浓度 Z：各种离子的价数 S0 :蛋白质在纯水（I=0）中的溶解度 S :蛋白质在离子强度为I的溶液中的溶解度 lgS0 = β（截距常数），取决于溶质的性质，与温度和 pH有关。
在含难溶盐的溶液中，加入能与被测定的离子生成 络合物的络合剂时，沉淀的溶解度随络合剂添加量 的增大而增大。
AgCl
Ag+
+ Cl
-
+2NH3 Ag(NH3)2+
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4.盐析后的脱盐：
二 、 无 机 沉 淀 剂 分 离 法 方法： 1）透析 2）电渗析 3）葡聚糖凝胶过滤法 5.硫酸铵使用前的处理及饱和度的调整方法 1 ）使用前的处理：对含巯基蛋白质或酶，在使用硫酸 铵前应除去其中重金属离子，以避免蛋白质或酶活性的 丧失。方法：硫酸铵浓溶液－－通入H2S至饱和－－过夜 后过滤除去重金属沉淀－－滤液蒸发结晶－－晶体 100℃干燥。


（3）生成三元络合物的有机沉淀剂
即配位化合物，为一类具有特征化学结构的化合 物，由中心原子或离子（统称中心原子）和围绕 它的称为配位体（简称配体）的分子或离子，完 全或部分由配位键结合形成。
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（二）有机溶剂的选择



2.沉淀有机成分的有机沉淀剂： 甲醇、乙醇、丙酮、二甲亚风、乙腈、异 丙醇、乙腈等 食品中蛋白质、酶类、核酸、糖类、氨基 酸-乙醇 甲醇、丙酮具毒性

在偏离等电点pI时，氨基酸因带有同种电荷 而相互排斥； 在等电点pI状态下，所带电荷为零，易于相 互接近，溶解度因此变小。
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等电点沉淀法提取谷氨酸

小麦面筋水解液/微生物发酵液提取谷氨酸 +HCl至pH 4.0，出现谷氨酸结晶，继续加至 3，静止一段时间，大部分谷氨酸就沉淀出 来。谷氨酸pI=3.22
Fe(OH)3↓ ， Mg2+
Ksp Fe(OH)3 = 7.1× 10－40 Ksp Mg(OH)2 = 1.8× 10－11
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盐效应：当溶液中有 与构成沉淀的离子不 同的离子存在时，沉 淀的溶解度增大。 原因：大量的无关离 子存在时，溶液的离 子强度增大，离子的 活度系数相应减小， 使原来饱和的难溶盐 溶液变为不饱和。
二 、 无 机 沉 淀 剂 分 离 法 1 ）蛋白质浓度影响：高时，用盐量小，但易产生共沉 淀；低时，不易产生共沉淀，但用量大。溶液中蛋白浓 度为2.5～3％时，效果较好。 2 ）离子强度和离子类型的影响：各种成分盐析常数差 别越大越好。 3 ）不同离子类型的影响：离子半径小、带电荷较高的 离子盐效果比离子半径大、带电荷少的效果好。 4）pH的影响：等电点处的盐析效果最好 5 ）温度的影响：低离子强度下，蛋白质溶解度随温度 升高加大；高离子强度下，蛋白质溶解度随温度升高降 低。酶应该在低温下进行盐析（保持酶活力）。
] [X
n m
]
Ksp是衡量沉淀溶解度的尺度
有效分离：Ksp≤10－6或更小 几种离子均可沉淀时，其Ksp要有足够的差异
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分级沉淀
两种阴离子（或阳离子）与相同的阳离子 （或阴离子）形成难溶盐，其溶度积相差 足够大时，加入沉淀剂可从混合溶液中将 其分别沉淀出来加以分离。
NH4Cl 3+ 2+ Fe 、 Mg NH3 ． H2O
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二 、 无 机 沉 淀 剂 分 离 法
2.盐析法中盐的选择：
硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、磷酸钠、磷酸钾、氯化钾、 醋酸钠、硫氰化钾等。 硫酸铵优点：温度系数小，溶液性质受温度影响小； 溶解度大；对蛋白质和酶的变性影响小；价格低。 硫酸铵缺点：缓冲能力小；含氮，影响蛋白含量测定
3.影响盐析的因素：
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（二）有机溶剂的选择


1.沉淀金属离子的有机沉淀剂：
（1）生成螯合物的有机沉淀剂 螯合物是具有环状结构的配合物，是通过两个或 多个配位体与同一金属离子形成螯合环的螯合作 用而得到。

酸性基团：含H+可被金属离子置换，-COOH,SO3H,-SH

碱性基团：以配位键与金属离子结合生成环状
螯合物，-NH2,=NH,=CS
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（二）蛋白质的等电点沉淀分离
例如：大豆蛋白的提取－碱提酸沉法 pH为0.5时，50％左右溶解； pH为2时， 85 ％左右溶解； pH 为 4.2 ～ 4.3 时，基本不 溶解；当pH升至6.5时，溶解达85％，当pH 为12时，达90％。


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碱提酸沉法分离大豆蛋白
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羟基肟类:
具-C=C-结构，能与二价金属离子形成螯合物。 pH 2.5，水杨酸肟能沉淀Ca2+ , Pd2+ pH 5.7,可沉淀Ni2+ pH 7-8,可沉淀Zn2+


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氨基酸类 邻氨基苯甲酸等芳香族氨基酸能与Cu2+、
Zn2+、Cd2+、Co2+、Ni2+、Ag+、Hg+、Pb2+、Fe3+ 等离子形成络合物。
第五节 其他沉淀分离技术

（一）变性沉淀分离法 1.原理 利用生物大分子对物理、化学等外部环境因子敏感性的差 异而选择性地使一种组分发生变性，而让另一些组分保持 不变性，这样就可以达到分离、除杂和提纯的目的。 生物大分子变形时往往形成沉淀。



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酶和蛋白质变性的概念

蛋白水解：一级结构 蛋白变性：二、三、四级结构发生变化， 导致蛋白质物理、化学性质的改变及生物 功能的改变，不涉及一级结构。
2）硫酸铵饱和度的调整：





加固体盐（要求饱和度高）：加入量可参阅相 关手册。 加饱和硫酸铵溶液（要求饱和度不高） 盐析时要求的饱和度及所需加入饱和硫酸铵溶 液体积计算： V=V0(S2-S1)/(1-S2) V:需加入饱和硫酸铵溶液的体积 V0：待盐析溶液的体积 S1：原来溶液的硫酸铵饱和度 S2:需达到的硫酸铵饱和度
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沉淀分离技术应考虑因素



1.方法和技术应具有一定的选择性，使目标 成分得以很好地分离； 2.沉淀方法对酶类、蛋白等目标成分的活性 及化学结构是否具有破坏性； 3.考虑残留在目标成分中的沉淀剂对人体是 否有害（食品、医药）
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沉淀分离技术常见方法


1.无机沉淀剂沉淀分离法
盐析法，多用于各种蛋白质和酶类的分离纯化。通常使用 盐类作为沉淀剂，如硫酸铵，碳酸铵，硫酸钠，氯化钠， 柠檬酸钠等。
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即：lgS=lgS0-KsI
lg(S/S0)=-KsI


分段盐析法： Ks分段盐析法:在一定的pH值和温度条件下， 改变盐的离子强度，使不同的溶质在不同 的离子强度下产生最大的析出。 β -分段盐析法： 在一定的盐离子强度下， 改变溶液的 pH 值和温度，使不同的溶质在 不同的pH值和温度条件下有最大的析出。


5.共沉淀法
利用沉淀的同时，对待分离成分吸附共沉淀而达到除杂目 的，用于多种化合物，特别是小分子物质的沉淀。


6.变性沉淀分离法
特定条件使目标成分变性，导致其性质如溶解度的改变， 从而得以分离。适用于一些变形条件差异较大的蛋白质和 酶。
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溶度积
nMm+ + mXnMnXm（固）
m n
溶度积 Ksp [M


蛋氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸
可螯合一些会促进氧化作用的金属离子 其他如偶氮化合物、吡啶、亚硝基化合物等：强 毒或致癌
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（二）有机溶剂的选择


（2）生成离子缔合物的有机沉淀剂
由金属配位离子与异电性离子以静电引力的作用 结合成不带电的化合物，称为离子缔合物，此缔 合物具有疏水性而能被有机溶剂萃取。
第二章
沉淀分离技术
Separation by precipitation
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沉淀分离技术是经典的化 学分离技术。
沉淀是指溶液中的溶质在适当条 件下，由液相变成固相而析出 的过程。
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Leabharlann Baidu
第一节 沉淀分离的目的和方法

目的： 1.通过沉淀使目标成分达到浓缩和去杂质 2.通过沉淀可将已纯化的产品由液态变成固 态，便于保存和进一步地加工处理。
（二）盐析法：常用于蛋白质和酶的分离 1.原理： 盐溶：低浓度下蛋白质和酶类的溶解度随着盐的浓度提 高而增大，这个过程称盐溶现象。 盐溶原因：中性盐离子对蛋白质分子表面活性剂团水活 度的影响。 盐析：盐浓度增加到一定程度时，在盐离子的作用下， 水活度大大降低，蛋白质表面电荷被大量中和，蛋白质 分子外表面的水化膜被破坏，蛋白质分子相互聚集而沉 淀析出。


2.酸解
Ca3(C6H5O7)2•4H2O+H2SO4+H2O2C6H8O7•H2O+3CaSO4•H2O
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影响沉淀效果的因素

温度 pH 中和的反应条件： 温度70-85℃，pH=5.0 酸解的条件： 温度60-85℃ ，pH=1.8-2.0
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二 、 无 机 沉 淀 剂 分 离 法


2.脱水作用
减少溶质与水的作用，使溶质脱水相互聚集沉淀。
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有机沉淀剂的优点



1.选择性比较高 一定浓度的有机沉淀剂只沉淀分离某一种 或某一类溶质组分 2.沉淀后所得产品不需要脱盐 残留沉淀剂易于挥发
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有机沉淀剂的缺点


1.容易导致某些生物活性大分子物质如酶类 失活； 2.常需要低温下操作。
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2）盐浓度：
太大或太小都不利于沉淀，有机溶剂中盐的浓度不 超过5％为宜。


3）溶质相对分子量与有机溶剂用量间的关系：
待分离组分的相对分子质量越小，有机溶剂的用量 越多。 不同浓度的有机溶剂能使溶质中不同的组分先后沉 淀，起到分步沉淀的效果。

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4）温度：有机溶剂存在时，蛋白质溶解度 随温度降低而降低。酶类对温度较敏感， 宜低温操作。 低温对于提高沉淀效果比较有利。 5）pH值：等电点处溶解度最小。 等电点处的pH可最大限度进行沉淀，可用 于有选择的沉淀。 注意：有盐存在时，待分离溶质的最小溶 解度对应的pH常常发生偏移。改变pH值， 分段沉淀
核酸提取-异丙醇、a-二氨基乙醇
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有机溶剂的浓度、加入量之间的关系
V=V0(S2-S1)/(1-S2) V:需加入有机溶剂的体积 V0：原溶液的体积 S1：原溶液中有机溶剂的浓度 S2：要求达到的有机溶剂的浓度
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3.影响沉淀效果的因素


1）金属离子：Zn2+、Ca2+等金属离子存在时， 能大大降低一些大分子溶质如蛋白质的溶 解度，可减少有机溶剂用量。 要求：不影响目标成分的生物活性
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无机沉淀剂沉淀分离法缺点

分离的选择性较差 分离的灵敏性较差
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第三节 有机沉淀剂沉淀分离法
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基本原理



有机沉分离法能够将溶质如酶和蛋白质等 从溶液中沉淀出来，主要原因： 1.有机溶剂降低了溶液的介电常数
溶质分子间静电作用力增强，溶质与溶剂分子间 相互作用降低，导致溶质分子发生聚合而析出；
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无机沉淀剂沉淀分离法

原理： 利用金属离子的各种盐类形式，如硫酸盐、 碳酸盐、草酸盐、铬酸盐、有机酸盐等， 溶解度都很小。
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一、金属盐类沉淀分离法


利用金属离子与酸根在形成盐类时溶解度低而得 以沉淀分离。 柠檬酸生产： 1.钙盐中和

C6H8O7•H2O+3CaCO3Ca3(C6H5O7)2•4H2O+3CO2+H2O
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第四节 等电点沉淀分离法


（一）基本原理
主要利用两性电解质分子在电中性时溶解度最低，不同的 两性电解质具有不同的等电点（PI）而进行分离的一种方 法。 甘氨酸（Gly）为例 pK1+pK2=2pH



pk1=2.34
pK1=9.6 PI=pH-=1/2(pK1+pK2)=5.97
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