诱导细胞融合——电 场 法

诱导细胞融合——电场法

实验目的

本实验学习掌握电场法诱导细胞融合的方法。

实验原理

电融合技术的原理是：在短时间强电场(高压脉冲电场，场强为kV／cm量级，脉冲宽度为卜q量级)的作用下，细胞膜发生可逆性电击穿，瞬时地失去其高电阻和低通透特性，然后在数分钟内恢复原状。当可逆电击穿发生在两个相邻细胞的接轴区时，即可诱导它们的膜相互融合，导致细胞融合。该方法具有直观、定向、高效的优点。

实验材料、用品

材料：小麦叶片原生质体，烟草叶片原生质体。）

试剂：1%(W／V) 纤维素酶,1% (W／V)果胶酶,0.7mol／L甘露醇;10mmol/L CaCl2.2H2O,0.7mmol/L KH2PO4,pH 6.8～7.0。

***用具：离心机，振荡器，电融合仪，细胞融合池。

实验步骤

1、将制备原生质体悬液以1000r／min离心5min，用超纯水配制的0.6 M甘露醇清洗，重复两次。

2、吸去上清夜，再用0．6 M甘露醇将细胞密度调整成5*104个／ml混匀。

3、开启电融合仪电源，将正弦交变电场频率选择在1～1．30MHz 左右，正弦交变电场电压峰值为15V左右，占空比为50％，直流脉冲电压为200V，电脉冲宽度为10～100 μs，脉冲个数为2个。

4、用移液枪将原生质体悬液吸入电融合室中，置于显微镜下接上电极，待观察。

5、给原生质体悬液施加正弦交变电场，由低到高分别调节交变电场频率和电压，直流脉冲可调节参数为电压、脉冲宽度、间隙时间、脉冲个数等，在原生质体相互成串后，发生有效接触后，立即庙低到液施以电脉冲。高在显微镜下观察，可见原生质体迅速排列成串。

6、静止片刻在显微镜下观察原生质体在被施加电脉冲前后的变化及融合的情况选择确定。

7、用移液器向电融合室中吸出原生质体悬液滴片，马上进行台盼蓝染色，观察并计算原生质体的融和率和成活率，计三个视野，取其平均数。

作业

1.将观察到的细胞融合绘图。

2.计算用倒置显微镜观察的细胞融合率。

思考题

1.比较不同方法诱导细胞融合的优点和改进的方面。

2.哪些因素影响细胞融合?