超好研究生分子生物学课件第九章基因和基因功能分析基本策略07
分子生物学第九章--分子生物学研究方法电子教案精选全文
可编辑修改精选全文完整版•第九章分子生物学研究方法1．课程教学内容(1)核酸技术1—基本操作(2)核酸技术2—克隆技术(3)核酸技术3—测序(4)基因表达和表达分析基因定点诱变(5)蛋白质与核酸的相互作用(6)其他（热点）技术2．课程重点、难点基因克隆技术、杂交技术、测序技术、蛋白质与核酸的相互作用检测技术3．课程教学要求掌握基因克隆技术、杂交技术、测序技术、蛋白质与核酸的相互作用检测等各种技术的原理。
本章内容•核酸的凝胶电泳•DNA分子的酶切割•核酸的分子杂交•基因扩增•基因的克隆和表达•细菌的转化•DNA核苷酸序列分析•蛋白质的分离与纯化•研究DNA与蛋白质相互作用的方法一、核酸的凝胶电泳基本原理：当一种分子被放置在电场当中时，它们会以一定的速度移向适当的电极。
电泳的迁移率：电泳分子在电场作用下的迁移速度，它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷成正比。
由于在电泳中使用了一种无反应活性的稳定的支持介质，如琼脂糖和丙烯酰胺，从而降低了对流运动，故电泳的迁移率又同分子的摩擦系数成反比。
在生理条件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的。
从这个意义上讲，DNA和RNA的多核苷酸链可叫做多聚阴离子，因此，当核酸分子放置在电场中时，它就会向正极移动。
在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移率，取决于核酸分子本身大小和构型。
分子量较小的DNA 分子，比分子量较大的分子，具有较紧密的构型，所以其电泳迁移率也就比同等分子量的松散型的开环DNA分子或线性DNA分子要快些。
Gel matrix (胶支持物) is an inserted, jello-like porous material that supports and allows macromolecules to move through.Agarose (琼脂糖):(1) a much less resolving power than polyacrylamide,(2)but can separate DNA molecules of up to tens of kbDNA can be visualized by staining the gel with fluorescent dyes, such as ethidium bromide (EB 溴化乙锭)Polyacrylamide (聚丙稀酰胺):(1)has high resolving capability, and can resolve DNA that differfrom each other as little as a single base pair/nucleotide.(2)but can only separate DNA over a narrow size range (1 to a fewhundred bp).Pulsed-field gel electrophoresis (脉冲电泳)(1)The electric field is applied in pulses that are orientedorthogonally (直角地) to each other.(2)Separate DNA molecules according to their molecule weight, as wellas to their shape and topological properties.(3)Can effectively separate DNA molecules over 30-50 kb and up toseveral Mb in length.二、DNA分子的酶切割Restriction endonucleases (限制性内切酶) cleave DNA molecules at particular sitesRestriction endonucleases (RE) are the nucleases that cleave DNA at particular sites by the recognition of specific sequences.RE used in molecular biology typically recognize (识别) short (4-8bp) target sequences that are usually palindromic (回文结构), and cut (切割) at a defined sequence within those sequences. e.g. EcoRIThe random occurrence of the hexameric (六核苷酸的) sequence: 1/4096 (4-6=1/46)(1) Restriction enzymes differ in the recognition specificity: target sites are different.(2) Restriction enzymes differ in the length they recognized, and thus the frequencies differ.(3) Restriction enzymes differ in the nature of the DNA ends they generate: blunt/flush ends (平末端), sticky/staggered ends (粘性末端).(4) Restriction enzymes differ in the cleavage activity.三、核酸的分子杂交原理：带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。
基因功能分析的基本策略课件(共 71张PPT)
RNAi 是真核生物中广泛存在的现象
植物：干扰因素自叶脉向外扩散，绿色荧光蛋白 线虫：左侧为 转基因线虫；右侧线虫则经 (GFP) GFP dsRNA 基因 Hela 细胞：经GFP ORC6 siRNA 作用后，细胞出现多核现象。 果蝇：右侧果蝇为野生型，左侧为 shRNA 造成的色素缺乏的 被抑制，显露出红色。 处理。部分细胞 RNAi 相关蛋白表达较低，仍有绿色荧光。 绿色为 tubulin， 缺陷型。 红色为 DNA。ORC6 细胞分裂调控蛋白。
检测的提示重组体存在的基因。GFP、 LacZ、AP、 LUC。
融合基因 (fusion gene): 将特定的目的基因与报告
基因拼接成融合基因，并与顺式作用元件拼接成完 整的转录单位。
动物转基因常用的载体
腺病毒载体 逆转录病毒载体 非病毒类载体：如质粒等。
2. 中游—基因转移、胚胎移植与建系
基本原理
转基因动物
基本过程
上游—基因改造和载体构建
中游—基因转移、胚胎移植与建系 下游—基因整合、表达的检测与细胞筛选
1. 上游—基因改造和载体构建
外源基因: 完整的转录单位, 由顺式作用元件、结构
基因和转录终止信号组成。
报告基因 (reporter gene) : 在表达载体中引入易于
第十二章
基因功能分析的基本策略
转基因模型是研究基因功能的主要手段
转基因生物： 外源基因导入生物体表达。 基因打靶： 外源基因替换内源基因。 基因敲除。 基因敲入。 基因沉默： 导入特定基因，抑制内源性基因表达。
第一节 转基因技术
转基因技术(transgenic technology)：将外源 基因导入细胞，随机整合到受体基因组内， 并随细胞分裂而遗传给后代。 细胞模型。 转基因动物。 转基因植物。
超好研究生分子生物学课件-第九章 基因和基因功能分析基本策略07
高等教育出版社
目录
18
3.RNA酶保护实验 酶保护实验
基因转录后的RNA剪接可 剪接可以直接影响基因活性 使一个基因产生多条多肽链或蛋白质产物。 使一个基因产生多条多肽链或蛋白质产物。RNA 酶保护实验(RNase protection assay, PRA)是一种 酶保护实验 是一种 液相RNA杂交技术，主要是用 杂交技术， 液相 杂交技术 主要是用RNase A 和RNase T1专一性降解单链 专一性降解单链RNA，分析受保护的杂交双链 专一性降解单链 ， RNA，从而确定 确定RNA是否剪接、剪接种类、剪接 是否剪接、 ，从而确定 是否剪接 剪接种类、 位点及内含子的可能位置等。 位点及内含子的可能位置等。 PRA的基本程序主 的基本程序主 要包括待测RNA的分离、 RNA探针的制备、待测 的分离、 探针的制备、 要包括待测 的分离 探针的制备 RNA与RNA探针的液相杂交和 与 探针的液相杂交和RNA酶消化等。 酶消化等。 探针的液相杂交和 酶消化等
高等教育出版社
目录
8
DNA自动测序结果举例
高等教育出版社
目录
目录 9
2. 基因拷贝数变化的分析方法
用Souther blot分析基因拷贝数 分析基因拷贝数
此法通常只能分析已知基因的拷贝数.其成功与否的关 此法通常只能分析已知基因的拷贝数 其成功与否的关 键在于适当的DNA酶切消化和基因探针的标记 酶切消化和基因探针的标记. 键在于适当的 酶切消化和基因探针的标记
高等教育出版社
目录
10
Southern blot 的基本过程
高等教育出版社
目录
11
Northern blot 的基本过程
高等教育出版社
《基因功能分析》课件
蛋白质组学分析
利用质谱等技术对蛋白质进行鉴定 和定量分析，了解蛋白质的表达情 况和功能。
基因突变分析
Sanger测序
通过对目标基因进行双脱氧终止法测序，检测基 因突变位点和类型。
高通量测序
对全基因组或目标区域进行深度测序，发现基因 突变和结构变异。
随着基因技术的进步，相关的伦理和法规 也将不断完善，以保障技术的安全和合理 应用。
THANKS
[ 感是生物多样性的基础。不同物种或同一物种不同种群间的基因变异导致了生物多 样性的产生和发展。了解基因变异对生物多样性的影响有助于保护和利用生物资源。
CHAPTER 04
基因功能研究的应用
医学诊断与治疗
基因诊断
利用基因检测技术，对遗传性疾病进行早期诊断，有助于制定个性 化的治疗方案。
基因与药物反应个体差异
不同个体对同一种药物的反应可能存在差异，这种差异部 分由基因变异引起。了解个体基因变异情况有助于预测患 者对特定药物的反应。
基因与进化
基因变异与物种形成
基因变异是生物进化的驱动力之一。通过自然选择和遗传漂变，基因变异在种群中积累并 最终导致新物种的形成。
基因与适应性进化
生物在适应环境过程中，某些基因变异有助于提高生存和繁殖能力，从而在自然选择作用 下得到保留和传播。这些变异可以影响生物的生理机能、行为和形态等方面。
03
基因与个性化医疗
了解基因变异对疾病的影响有助于实现个性化医疗，为患者提供更精准
的诊断和治疗方案。
基因与药物反应
基因与药物代谢
药物代谢酶的基因变异可以影响药物的代谢速率和效果。 有些变异可能导致药物代谢过快或过慢，从而影响治疗效 果。
基因功能分析的基本策略
基因功能分析的基本策略一、利用转基因模型研究基因的功能1转基因动物：是指用人工方法将外源基因导入或整合到基因组内，并能稳定传代的一类动物。
2基本原理：将目的基因（或基因组片段）用显微注射等方法注入实验动物的受精卵或着床前的胚胎细胞中，使目的基因整合到基因组中，然后将此受精卵或着床前的胚胎细胞再植入受体动物园的输卵管（或子宫）中，使其发育成携带有外源基因的转基因动物。
导入基因的方法有显微注射法、胚胎干细胞法、逆转录病毒感染法、精子载体法。
二、利用基因敲除模型研究基因的功能1基因打靶：是指通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活体内研究此基因的功能。
若定向敲除某个基因，称为基因敲除，若定向将一段基因序列替代另一段基因序列，称为基因敲入。
2同源重组：是指发生在同源序列间的重组，它通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列之间进行单链或双链片段的交换。
又称基本重组。
3基因敲除：是目前在体内研究基因功能的最佳方法，是指通过DNA同源重组定向的将外源基因插入宿主细胞染色体DNA，从而使特定基因在细胞内或生物或体内失活的过程。
4基因打靶的必备条件：胚胎干细胞（ES）、打靶载体5打靶载体的筛选标志：neo（新霉素）阳性筛选标志；HSV-tk阴性筛选标志。
6基因敲除的基本程序：①打靶载体的构建②打靶载体导入ES细胞③基因敲除ES细胞注射入胚泡④胚泡植入假孕小鼠的子宫中⑤嵌合体的杂交育种7构建打靶载体的基本过程①获得目的基因的同源片段，将此DNA片段克隆到一般的质粒载体中；②从重组质粒中切除目的基因的大部分同源DNA序列，只留部分序列在线性质粒载体的两端；③将neo基因克隆到带有目的基因同源顺序的线性质粒中，使之位于残留目的基因同源顺序的中间；④在目的基因同源顺序的外侧线性化重组质粒载体，将HSV-tk基因克隆到此线性载体中。
三、通过抑制或沉默基因表达对基因的功能进行分析研究1利用反义RNA抑制基因表达水平2利用RNAi技术在细胞中沉默特定基因已研究其功能1。
基因表达与功能分析基本策略共84页文档
1、纪律是管理关系的形式。——阿法 纳西耶 夫 2、改革如果不讲纪律，就难以成功。
3、道德行为训练，不是通过语言影响 ，而是 让儿童 练习良 好道德 行为， 克服懒 惰、轻 率、不 守纪律 、颓废 等不良 行为。 4、学校没有纪律便如磨房里没有水。 ——夸 美纽斯
5、教导儿童服从真理、服从集体，养 成儿童 自觉的 纪律性 ，这是 儿童道 德教育 最重要 的部分 。—— 陈鹤琴
53、 伟 大 的 事 业，需 要决心 ，能力 ，组织 和责任 感。 ——易 卜 生 54、 唯 书 籍 不 朽。——乔 特
55、 为 中 华 之 崛起而 读书。 ——周 恩来
谢谢！
51、 天 下 之 事 常成 于困约 ，而败 于奢靡 。——陆 是活 动。——卢 梭
分子生物学--基因的结构和功能幻灯片
控。
根据基因产物不同，分为蛋白质基因和 RNA基因。
根据基因的功能，分为构造基因和调节 基因。
一、构造基因 概念： 构造基因〔structural gene〕是指能够编码特
定RNA分子或蛋白质分子的遗传单位。 构造基因的特点： 原核生物构造基因 编码序列是连续的。
② 真核生物构造基因 ③ 编码序列是不连续的，称为断裂基因
分子生物学--基因的结构 和功能幻灯片
本课件PPT仅供大家学习使用 学习完请自行删除，谢谢！ 本课件PPT仅供大家学习使用 学习完请自行删除，谢谢！
基因〔gene〕是指核酸分子中贮存与表达遗传 信息的单位。 大多数生物的遗传信息贮存于DNA分子。在某 些生物，如RNA病毒以RNA作为遗传信息的载 体。
在真核生物细胞中， 双螺旋的DNA分子与 蛋白质组装，形成称 为染色质(chromatin) 的高级构造。
染色质的根本构造单位——核小体
由4种核心组 蛋白各2分子 形成八聚体
核心颗粒之间由约 60bp的DNA与组蛋 白H1构成连接区连接
DNA双链缠绕在 组蛋白八聚体上 形成核心颗粒，每 圈80bp，约 146bp
DNA的化学构造
一级构造〔primary structure〕 指DNA分子中核苷酸的排列顺序
二级构造〔secondary structure〕 指两条DNA单链形成的双螺旋构造
三级构造〔tertiary structure〕
在原核生物中，染色 体DNA通常为双链环状， 与蛋白质构成复合体， 以类核〔nucleoid〕构 造存在于细胞中。
现代分子生物学-第九章 分子生物学基本研究法(下)-基因功能研究技术
转录组测序分析和RNA-Seq
转录组(transcriptome)，广义上指在某一特定生理 条件或环境下，一个细胞、组织或者生物体中所 有RNA的总和，包括信使RNA (mRNA)、核糖体 RNA (rRNA)、转运RNA (tRNA)及非编码 RNA(non-coding RNA或sRNA); 狭义上特指细胞中转录出来的所有mRNA的总和。
转录因子与顺式作用元件结合，激活最基本启动子Pmin， 使报告基因表达。若接入3个以上顺式作用元件，可增强 转录因子的识别和结合效率。
结构域
二者融合 导入酵母 细胞
上游
启动子 下游
酵母单杂交体系主要用于：
确定某个DNA分子与某个蛋白质之间是否存在相互作用；
分离编码结合于特定顺式调控元件或其他DNA位点的功
胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定 了哺乳动物基因敲除的技术基础。
6. 2. 3 植物基因敲除技术
T-DNA插入失活技术是目前在植物中使用最为广 泛的基因敲除手段。
利用根癌农杆菌T-DNA介导转化，将带有报告基 因的DNA序列整合到基因组DNA上，如果这段 DNA插入到目的基因内部或附近，就会影响该基 因的表达，从而使该基因“失活”。
关于基因敲除技术，噬菌体的Cre/Loxp系统、 Gin/Gix系统、酵母细胞的FLP/FRT系统和 R/RS系统是现阶段常用的四种定位重组系统， 尤以Cre/Loxp系统应用最为广泛。
1、完全基因敲除：
Neo基因有双重作用：①形成靶位点的插入突变；②作为
正向筛选标记。
取代型
插入型
由于基因转移的同源重组自然发生率极低， 动物的 重组概率约为10-2～10-5，植物的概率为10-4～10-5， 即使采用双向选择法也很难保证一次就从众多细胞 中筛选出真正发生 了同源重组的胚胎干细胞。
分子生物学--基因和基因组的结构与功能课件
重复序列
将真核生物基因组的DNA进行复性动力学测 定，显示3个不同的时相。
分子生物学--基因和基因组的结构与功能课件
三、基因组的概念
细胞或生物体中，一套完整单体的遗传物质的总 和，即某物种单倍体的总DNA。对于二倍体高等生物 来说，其配子的DNA总和即一组基因组，二倍体有两 份同源基因组。
四、原核生物基因组的特点
病毒基因组
• 1．结构简单，基因组小，所含基因少。
中
度ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
高
重
度
复
重 复 序 列
序 列
单 一
序
列
C0t1/2
真核生物DNA的复性动力学曲线
重复序列的作用
1、编码某些重要的功能性蛋白质及产物等， 如组蛋白、rRNA、tRNA等。
2、与染色体的构象、着丝点的形成有关。 3、参与基因表达调控。
高度重复序列
1.卫星DNA 5-10个bp，大多位于着丝粒和端粒、表达基因的间隔区、内含子。 人的卫星DNA可分为I、II、III、IV四种，各类型由不同的重复顺序家族构
2、基因组远大于原核生物，结构复杂，基因数庞 大，具有许多复制起始点，每个复制子大小不一。
3、基因不存在操纵子结构，功能相关基因分散在 不同的染色体上。基因都由一个结构基因与相关 的调控区组成，转录产物为单顺反子，即一分子 mRNA只能翻译成一种蛋白质。
真核生物基因组结构与功能特点
4、基因组中有大量低度（重复频率<103）、中 度（重复频率<105）和高度重复序列。
分子生物学第9章课件.ppt
•核糖体结合到mRNA分子的起始序列上，沿着密 码序列读码，方向从5’ →3’，合成的多肽链是 从氨基端到羧基端。 在一个mRNA分子上可以
结合多个不同时间开始翻译的核糖体，称为多聚 核糖体。
•原核的转录与翻译同步时行，真核的转录与翻译
在时空上分开，核糖体游离于细胞质或与内质网
膜结合。
演示课件
翻译过程的基本原理
演示课件
演示课件
演示课件
终止密码子的抑制现象 抑制子tRNA
翻译异常终止 ①“无义”突变 ②非终止mRNA（通过“反式翻译”恢复）
利用终止密码子插入非标准氨基酸
核糖体跳过一大段mRNA后继续翻译，称为翻译 跳跃（translation jumping），其发生位置具有 mRNA的特殊序列结构。
9.3.5 蛋白质合成的调节
1. 真核生物mRNA分子的稳定性 3'-polyA结构、3'非翻译区的AU序列
2. 5'UTR结构与翻译起始的调节 5'帽子结构、起始密码子AUG与上游AUG、AUG侧翼序 列、mRNA前导序列
3. 蛋白质磷酸化对翻译效率的影响 eIF-4E的磷酸化、eIF-2a的磷酸化
演示课件
示多聚核糖体
演示课件
9.3.2 蛋白质生物合成的分子基础
1. 模板——mRNA：作为中间物质传递DNA分子遗 传信息，含三联密码子组成的可读框。
➢ mRNA上的密码子以连续排列方式组成可读框，可读 框外的序列称为非编码区。
➢ 可读框的5’端由起始密码开始，3'端含有1～3个 终止密码。
➢ 原核生物mRNA分子起始密码上游含有核糖体结合位 点序列，分子内多个基因独立地进行可读框翻译； 真核生物mRNA5'端的核糖体进入部位与核糖体结合， 通过一种迅速扫描机制向3’端移动寻找起始密码， 帽子结构对核糖体进入部位的识别起一定作用。
基因表达及功能分析的基本策略ppt课件
Western blot基本程序
1. 蛋白质样品的制备 2. SDS-PAGE分离 3. 蛋白质转膜 4. 特异抗体（即第一抗体）与膜上的蛋白质（抗原）印
迹杂交 5. 再经偶联了可检测标记信号的第二抗体（即抗抗体，
商品试剂盒中多采用偶联辣根过氧化物酶的Ig） 6. 最后经与酶的底物反应而显影、成像，经扫描后获取
第二节
生物信息学在预测基因 功能中的应用
Bioinformatics Application in Predicting Gene Function
一、利用生物信息学方法进行基因功能 注释
(一）通过序列比对预测基因功能
序列比对是生物信息学最基本的分析技术之一，最常 用的方法是将目的DNA或蛋白质序列与已知的DNA和蛋白 质序列数据库进行比对，搜索到与目的序列高度同源的功 能已知的基因或蛋白质，用这些基因和蛋白质预测目的基 因和蛋白质的功能。局部比对搜索工具BLAST是进行序列 比对的基本工具，它允许用户选择一条查询序列与一个数 据库进行比对，找到数据库中与输入的查询序列相匹配的 项。BLAST是一个序列数据库搜索程序家族，其中包括许 多有特定用途的程序。
高通量筛选(High throughput screening，HTS)技术 是在大量核酸、多肽信息累计（即资料库）基础上，采 用微板作为分子载体，制作集成“芯片”，以自动化操 作系统进行分子杂交的试验过程。
因为快捷、灵敏、信息量大，适合大规模操作，故 称“高通量”。
高通量检测技术适合“组学”（omics）研究，更 适合生命活动过程相关的基因表达谱分析。
原理: 根据蛋白质分子的两个属性——等电点和分子 质量——将蛋白质混合物进行分离。电泳结果经染色后， 即可对不同样品中蛋白质的表达谱进行比较；还可从凝胶 中将特定的蛋白质点切下，经胰蛋白酶消化后得到短肽片 段，利用质谱（mass spectrum）技术进行定性分析，对差 异表达的蛋白质进行鉴定。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
基因和基因功能分析的 基本策略
高等教育出版社
南昌大学医学院 万福生
目录
1
由于基因型得以实现。当前被称 为医学研究的“活试管”的转基因动物和基因敲除动物 两种模型的建立，其前期工作都是要构建基因载体。可 见，基因克隆在基因研究中的重要性。
导入外源基因的方法主要有显微注射法、胚胎干细胞 法及逆转录病毒法等。
高等教育出版社
目录
28
高等教育出版社
目 录 目 录29
高等教育出版社
目录
30
显微注射法的特点：
经此法注射的受精卵的成活率约有60%，由此发育所得 的小鼠中大约有10-40%带有外源基因，其中80%的基因整 合发生在单细胞期，成为转基因动物。另外20%在细胞分 裂后发生整合，这部分动物并不是所有细胞中都带有外源 基因，这类动物称嵌合动物(chimeric animal).
高等教育出版社
目录
35
(二)采用基因敲除动物模型研究基因功能
研究基因功能最直接的方法就是在被研究的动物基因 组中剔除这个基因。
基因敲除(gene knockout)是指通过DNA同源重组定向 地将外源基因插入宿主细胞染色体中，使某特定基因在细 胞或活体内失活的过程。它是目前在体内研究基因功能的 最好方法。
高等教育出版社
目录
17
2. RT-PCR分析基因转录水平
通过RNA的分析,一是可以确定基因表达的组 织分布;二是可以确定基因的表达时相。前者是 用Nothern blot技术，对不同组织来源RNA进行 定性杂交检测，以确定特定基因的组织分布。后 者是分析同来源的组织细胞在不同培养时间中 RNA的表达特点。
高等教育出版社
目录
18
3.RNA酶保护实验
基因转录后的RNA剪接可以直接影响基因活性, 使一个基因产生多条多肽链或蛋白质产物。RNA 酶保护实验(RNase protection assay, PRA)是一种 液相RNA杂交技术，主要是用RNase A 和RNase T1专一性降解单链RNA，分析受保护的杂交双链 RNA，从而确定RNA是否剪接、剪接种类、剪接 位点及内含子的可能位置等。 PRA的基本程序主 要包括待测RNA的分离、 RNA探针的制备、待测 RNA与RNA探针的液相杂交和RNA酶消化等。
基因敲除动物(gene knockout animal)是指通过同源重 组定向地在活体内剔除特定基因的动物。
基因敲除小鼠是指在两条染色体上的等位基因都失去功能 的小鼠。
高等教育出版社
目录
36
(三)采用转录后基因沉默或抑制研究基因功能
1. 利用RNA干扰技术研究基因功能
RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指由短双链 RNA诱导的同源mRNA的降解过程。 RNA干扰过程主要分 两个阶段：一是siRNA的生成，二是siRNA与细胞内某些酶 或蛋白质形成RNA诱导的沉默复合体(RISC), RISC可识别 与siRNA有同源性的mRNA，并在特异彩位点切割该mRNA。
高等教育出版社
目录
16
(二)RNA定性定量分析观察基因表达活性
1. Nothern blot分析基因转录水平
Nothern blot 是定性分析mRNA水平的常 用方法，也可相对定量分析特定RNA。其基本程 序与Souther blot相似。 RNA样品制备和电泳 分离成为关键步骤，操作人员的实验技巧是实验 成功与否的重要因素之一。现都倾向用RT-PCR 方法。
高等教育出版社
目录
34
2.利用细胞模型研究特定基因的功能
在细胞水平上进行转基因，以建立基因转染细 胞模型，可在DNA、RNA及蛋白质水平上研 究特定转染基因的功能。
转染细胞是研究基因功能的常用细胞模型。 利用转染细胞研究基因功能时，可在细胞水平
上进行，也可在动物体内进行，如将转染某一 抑癌基因的肿瘤细胞接种到小鼠体内。目前许 多基因工程的重组蛋白的功能研究都采用转染 细胞模型。
(一) 采用转基因模型研究基因功能 (二)采用基因敲除动物模型研究基因功能 (三)采用转录后基因沉默或抑制研究基因功能
高等教育出版社
目录
26
(一) 采用转基因模型研究基因功能 研究基因功能的转基因模型目前主要有动物 模型和细胞模型两种。转基因小鼠模型是应用最 多的转基因动物模型。 1.利用转基因动物研究基因在体内的功能 转基因动物(transgenic animal)是指用人工 方法(转基因技术)将外源基因导入或整合到基因组 上，培育出带有外源基因并能稳定表达的动物。其 中将外源基因导入或整合到基因组上的过程称转基 因(transgene)。上述这种能够产生转基因动物的 方法称转基因技术(transgenic technology)。
高等教育出版社
目录
20
DNA芯片技术分析基因转录活性的原理与核酸 分子杂交方法是一样的，都是用已知核酸序列 与靶核酸序列杂交，定性定量分析基因表达情 况，但不同的是DNA芯片表面集成了大量的核 酸分子探针，能在同一时间内平行分析大量的 基因转录产物。 DNA芯片技术还可用于基因 组研究、基因诊断、法医鉴定及药物研究等。
高等教育出版社
目录
27
第一次获得了转基因小鼠是1982 年。
由美国科学家Brinster和Palmiter将大鼠生长激素基 因(GH)与小鼠的金属硫蛋白基因(MT)连在一起，构成 MTrGH融合基因，然后用显微注射法注射到小鼠受精卵 中，再移植到假受孕的子宫中，待其发育生长。这次共产 了21只小鼠，其中7只带有GH基因，而6只的体形较原小 鼠大一倍左右，即称超级小鼠或巨型鼠。转基因小鼠模型 是医学领域中应用最广泛的动物模型。
高等教育出版社
目录
3
核酸序列分析的基本原理 化学裂解法 (Maxam-Gillbert法) DNA链的末端合成终止法 (sanger法)
高等教育出版社
目录
4
A、化学裂解法(Maxam-Gillbert法)
基本原理
基于某些化学试剂可以使DNA链在1个或2个 碱基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应 强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同 分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同 的DNA片段，将这些片段经电泳分离。
高等教育出版社
目录
8
DNA自动测序结果举例
高等教育出版社
目录 目录 9
2. 基因拷贝数变化的分析方法
用Souther blot分析基因拷贝数
此法通常只能分析已知基因的拷贝数.其成功与否的关 键在于适当的DNA酶切消化和基因探针的标记.
采用PCR技术分析基因拷贝数
一般说来,传统PCR不合用于分析基因拷贝数变化,但 差异PCR和实时PCR(real-time PCR)可以用于基因拷 贝数的分析。有时也可通过对PCR产物含量的多少估计 基因拷贝数在不同个体之间的差异，一般常用actin等管 家基因作内参照。
高等教育出版社
目录
19
4 DNA芯片(DNA chips)技术
DNA芯片是生物芯片(bio chip)中的一种,又称 基因芯片、DNA阵列(DNA array) 、c DNA芯片 等。生物芯片是指通过微电子、微加工技术在芯 片表面形成的微型生物化学分析系统，以实现对 细胞DNA、蛋白质及其它物质高效、敏感而又 快速的处理。 bio chip又分为DNA芯片、蛋白质 芯片及其它芯片三类。
分析前，用同位素标记DNA的5´末端，经放 射自显影即可在X胶片上读出DNA链的序列。
高等教育出版社
目录
5
B、DNA链末端合成终止法
高等教育出版社
目录
6
高等教育出版社
目录 目录 7
C、DNA自动测序
采 用 荧 光 替 代 放 射 性 核 素 标 记 是 实 现 DNA 序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四 种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反 应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后， 通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光 分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集 荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。
3.免疫组化对细胞内蛋白的定位和半定量分析
高等教育出版社
目录
25
二、基因功能分析的基本策略
随着人类基因组计划(HGP)的完成，人们对未知基 因功能的预测和研究成为21世纪的热点之一，其主要任 务就是在基因组上找出每项个基因和基因产物及其的功 能。制定合适的分析策略是进行基因功能分析的重要步 骤。基因功能分析可以在DNA、RNA和蛋白质水平上采 用不同的技术和模型来进行，转基因小鼠和基因敲除小 鼠是当前研究基因功能最常用的动物模型。下面简要介 绍几种用于基因功能分析的常用技术方法。
分析基因可在DNA，RNA和蛋白质三个层面上进行， 研究者应根据研究目的筛选适当的实验方法和制定研究 技术路线。
基因分析是一种策略性非常强的工作，能用于基因 分析的实验技术和方法很多，选择适当的实验方法和切 入点是基因分析首先要考虑的，即要有一个周密的基因 分析的策略。
高等教育出版社
目录
2
一、基因分析的基本策略
外源基因整合的拷贝数从1-几百不等，一般是在染色体 单个位点整合，偶尔有在不同染色体不同位点整合。外源 基因可几个片段首尾相连插入整合位点。
此技术的优点：导入基因的速度快、操作简单、对DNA 大小无限制（可达200kb以上）。
高等教育出版社
目录
31
胚胎干细胞法导入基因的基本过程
高等教育出版社
目录
32
用原位杂交技术确定基因在染色体上的分布 首次将原位杂交(in situ hybridization, ISH)技 术用于基因定位是1977年,用此法确定了人α和 β珠蛋白基因分别在11和16号染色体上的位置. 荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)是用特殊荧光标记DNA探 针,可在细胞、染色体及组织切片上检测细胞 内是否存在特定的DNA或RNA序列，其分辩率小 于100kb。