流式细胞仪BDFACSCantoII
流式细胞仪BD FACSCanto II
流式细胞术检测样本
0.4um
40um
流式细胞术检测指标
流式细胞术提供的信息： - 相对细胞大小 - 相对细胞颗粒密度和内部复杂度 - 染色过细胞的相对荧光强度
流式细胞术的应用
细胞结构 细胞大小 细胞粒度 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量 染色体分析
LP 500
SP 500
BP500/50
电子系统
Laser
Voltage Time Voltage
Laser
Time
Voltage Time
Laser
电子系统
电子系统
Review
液流系统
悬浮状态的细胞 单个流过流动室 细胞被激发
光学系统
产生散射光和荧光 信号
电子系统
信号被采集 转换成数字信号
1000
% Compensation is independent of fluorescence intensity
100
FL2
10
1
0.1 0.1 1 10 100 1000
FL1 (FITC)
Fraction A B C D E
FL2 - %FL1 21.3 22.0 20.2 20.5 21.4
细胞功能 细胞表面/胞浆/核的特 异性抗原 细胞活性 细胞内细胞因子 酶活性 激素结合位点 细胞受体 细胞凋亡
在上述信号基础上的细胞分选
流式细胞仪组成
液流系统：形成层流系统，聚焦细胞 光学系统：产生和收集光学信号 电子系统：光信号转化为电信号，进行信号处理
Fluidics Diagram
1.) Compensation - Too Little; Too Much
流式细胞仪11-FACSCanto Clinical 四色免洗淋巴细胞亚群的绝对计数
FACSCanto Clinical 四色免洗淋巴细胞亚群的绝对计数【实验原理】：用已知总数的荧光微球Beads 作标准内参，加入血中，再加入荧光抗体，应用流式细胞仪中的获取和分析软件，就可以得出血中CD3、CD4，CD8、B 、NK 细胞的绝对数。
【主要试剂】：（1） 抗体：CD3/CD8/CD45 /CD4；CD3/CD16+56/CD45 /CD19四色荧光抗体。
（2）Trucount tube （内含数量已知的Beads ）。
（3）FACS Lysing Solution （溶血素）（10×,使用前用蒸馏水稀释成1×）。
【实验步骤】：1、 取两支TruCount Tube ，编号A 和B ；2、 用反向加样法在Tube 中加入50ul 充分混匀的抗凝全血，注意血不要碰到试管底部的微球（Beads ）。
3、 取20ul CD3/CD8/CD45/CD4抗体加入到A 管中、取20ul CD3/CD16+56/CD45/CD19标记的抗体加入B 中，注意：不要碰到血。
涡旋混匀，室温避光放置15－20min 。
4、 取出加入450ul 1×FACS 溶血素，充分混匀，避光放置15min 。
5、 24小时内上机用FACSCanto Clinical 软件获取2500个淋巴细胞进行检测，上机前应充分混匀。
；【注意事项】：1、 样本使用EDTA 抗凝全血，室温放置，24小时内处理，处理前充分混匀。
2、 取血时要采用反向加样法，即加样枪吸取血样时，打到第二档，放时打到第一档，保证血量的准确，减少误差。
3、 染色和溶血步骤应在室温避光进行，并充分混匀过程中，尽量防止血样的飞溅，以免血样留在管壁上。
4、 本实验为免洗试剂，操作简单，减少细胞的丢失提高工作效率和计数精确度。
5、TruCOUNT 管2-25°C 保存，从冰箱取出后，应恢复室温再打开封条，保证TruCOUNT 管包装袋密闭，袋内干燥剂变成粉红色时，TruCOUNT 管应弃去不用。
FACSCanto II流程
FACSCanto II开机1．打开电脑，进入Windows系统2．打开主机，激光电源3．登陆FACSDiva软件，等待联机成功4．观察各溶液桶液流情况，作必要添加处理5．Cytometer菜单-Fluidics Startup启动液流实验1．选择合适的Configuration（Cytometer-View Configurations）2．新建实验（需要模板时，选Experiment菜单下的New ****）3．建立Specimen，tube4．在Experiment菜单下Experiment Layout下输入各管标记，设定存储数据量等5．在Global Sheet上画图6．上样I）阴性管调电压，调节FSC/SSC电压，调节阈值，找到细胞群体，设门，调节各荧光的电压至阴性位置，设定界限II）单阳性管调节补偿，注意散射光的变化III）上样本，调节各门的位置，右键点击图形，选择Show Population Hierarchy显示population上下级关系，可以更改显示名称、颜色，作交、并、补集；选择CreateStatistics View显示统计信息，右键点击统计选择Edit Statestics View更改统计内容设置7．导出结果，注意Sheet和Global Sheet差别8．实验条件可以复制粘贴，可以将导出使用各种模板9．注意更换样本管时一定要将支撑臂推到底关机1．使用稀释过的次氯酸钠溶液（有效氯约0.5-1%）1-2ml，放置在上样位置，高速上样运行5分钟；2．使用3ml去离子水，放置在上样位置，高速上样10分钟；3．Cytometer菜单-Fluidics Shutdown关闭液流4．放上约1ml去离子水在上样位置5．关闭Diva软件6．关闭仪器电源7．电脑关机特别维护1．每月可进行一次长清洗：Cytometry菜单-Cleaning Modes-Long Clean2．每三个月可进行一次流动室清洗：使用流动室清洗液，Cytometry菜单-Cleaning Modes-Clean Flow Cell3．上样针堵塞：Cytometry菜单-Cleaning Modes-SIT Flush，使用稀释的次氯酸钠溶液高速上样半小时，用去离子水冲洗4．排除气泡：Cytometry菜单-Cleaning Modes-Degas Flow Cell或是Purge Bubble Filter and Degas Flow Cell5．更换液体后：Cytometry菜单-Cleaning Modes-Prime after tank refill。
BDFACSCanto流式细胞仪之原理
流式細胞儀---FACSCanto之基本原理與應用產品專員劉益年美商必帝公司E-mail : kenny_liu@大綱•實驗設計原理•流式細胞儀運作原理•儀器設定調整•開、關機流程實驗設計原理•藉由螢光抗體標識細胞之抗原特性•藉由螢光化合物標識細胞特性•藉由螢光染劑標識細胞特性•Cytometry Beads Array單一細胞特性之偵測單一細胞特性之偵測cytokinesystructureenzymesAdhesionReceptorsMetabolic淋巴球免疫分型FITC PE使用原理CD45CD14儀器可自動依據CD45與CD14之免疫螢光染色，測量三群白血球的比例，淋巴球(CD45Bright/CD14-/Low FSC/Low SSC)，單核球(CD14+/CD45Intermediate/High FSC/Intermediate SSC)，顆粒性球(CD14dim/CD45dim/High FSC/High SSC)，細胞碎片與紅血球應是(CD14-/CD45-g g)細胞碎片與紅血球應是(/Low FSC/Low SSC)。
IgG1IgG1根據陰性對照組之染色程度來劃分陽性/陰性之界線，依此界線在陰性對照的樣品中，假陽性(Quardrant1+2+4)不得超過百分之二。
CD3CD19T 細胞必須表達有CD3+ 抗原，B 細胞表達有CD19+ 抗原。
此兩群細胞與NK 細胞之總和應約略等於淋巴球的總數，可作為品管的指標。
CD3CD4CD4+T細胞必須同時表達有CD3+與CD4+抗原。
CD3CD8CD8+T細胞必須同時表達有CD3+與CD8+抗原。
CD3CD16+or CD56+NK細胞必須不表達有CD3抗原，同時表達有CD16+或CD56+抗原。
NK細胞與T&B兩群細胞之總和應約略等於淋巴球的總數，可作為品管的指標。
訊息傳導實驗設計原理•藉由螢光抗體標識細胞之抗原特性•藉由螢光化合物標識細胞特性•藉由螢光染劑標識細胞特性•Cytometry Beads ArrayAnnexin V AssayAnnexin V-FITCC a++C a++C a++ C a++conjugateExternalization ofphosphatidylserinePlasmaApoptosismembraneCytoplasm Cytoplasm實驗設計原理•藉由螢光抗體標識細胞之抗原特性•藉由螢光化合物標識細胞特性•藉由螢光染劑標識細胞特性•Cytometry Beads ArrayDNA 特異性染劑EthidiumPropidiumNH 2NH 2NH 2NH 2p N +C 2H 5N +C 2H 2)3N +C 2H 5CH 3C 2H 5細胞周期位相的決定G 2MG 0G 1sG 0G 1Co sG 2Mu n t2004006008001000DNA content2N4NSub G1Sub G1細胞增殖反應實驗設計原理•藉由螢光抗體標識細胞之抗原特性•藉由螢光化合物標識細胞特性•藉由螢光染劑標識細胞特性•Cytometry Beads ArrayCytometric Beads Array (CBA)Cytometric Beads Array (CBA)Single StepIncubationTwo-Step IncubationorBeads Provide a Flexible PlatformBeads provide an expandable assay platform for use with a flow cytometer platform for use with a flow cytometerMultiple Different Different colors Multiple sizes Different intensities*Different colors with different intensitiesProteins MeasuredProteins MeasuredA. Interleukin (IL)-2B. IL-4C. IL-5D. IL-10E. Tumor Necrosis Factor-αF. Interferon-γBD FACSCanto TMBD FACSCanto TM流式細胞儀流式細胞儀的工作原理的工作原理dynamic Focusing)---液流聚焦(Hydro (Hydro--dynamic Focusing)偵測區-螢光激發光源-散射光樣品流動區緩衝液緩衝液液流區液流區流式細胞儀能測量:•散射光–細胞大小(前方散射光, 2-16°)–細胞折射率(側方散射光, 90)90°•各色螢光綜合三個系統的功能:‧液流系統:將細胞依序送到測量區受檢。
碧迪FACS CantoⅡ流式细胞仪性能评价及实验室应用
碧迪FACS CantoⅡ流式细胞仪性能评价及实验室应用方佩琪;孙林;顾梅秀;吴蕙;潘柏申;郭玮;王蓓丽【摘要】目的评估碧迪FACS CantoⅡ(BD FACS CantoⅡ)流式细胞仪的性能及实验室应用.方法依据中华人民共和国医药行业新版标准《YY/T0588-2017流式细胞仪》[1]对BD FACS CantoⅡ流式细胞仪进行性能评价,评价内容包括:荧光检出限、荧光线性、前向角散射光(forward scatter resolution,FSC)检出限、仪器分辨率、FSC分辨率、侧向角散射光(side scattering resolution,SSC)分辨率、倍体分析线性、表面标志物检测的准确度、表面标志物检测的重复性、携带污染率和仪器稳定性.完成性能评价后,分别用BD FACS CantoⅡ流式细胞仪及其配套的BD 六色淋巴细胞亚群试剂盒和BD FACS Calibur流式细胞仪及其配套的BD四色淋巴细胞亚群试剂盒分别检测20份全血标本,比较两台仪器在标本前处理、上机检测、分析结果所用时间和结果比较的差异.结果该流式细胞仪对异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)通道荧光检出限为40.18等量可溶性荧光分子数(molecules equiva-lent soluble fluorochrome,MESF),对藻红蛋白(P-phycoerythrin,PE)通道荧光检出限为23.77MESF,两者的决定系数(R square,r)均为0.999 9;FSC最小可检测0.22 μm微球;仪器分辨率FSC,FITC和PE荧光通道的变异系数(coeffivirnt of cariation,CV)分别为2.3％,2.4％和2.4％;FSC/SSC散点图可明显区分外周血中红细胞和血小板,同时能区分白细胞中的淋巴细胞、中性粒细胞、单核细胞;倍体分析线性中G2/M期(四倍体细胞峰)与G0/G1期(二倍体细胞峰)的平均荧光强度比值为1.98;表面标志物检测值的平均值均在质控品说明书给定的靶值参考范围内;表面标志物检测重复性CV分别为CD3∶2.75％,CD4∶1.86％,CD8∶ 5.14％,CD16/CD56∶7.33％和CD19∶11.26％;携带污染率最大为0.05％;该仪器开机8h检测FSC及各荧光通道峰值荧光道数偏差值(B)分别为-0.40％,-0.55％,1.57％,1.88％,1.66％,7.44％,7.23％,6.63％和6.21％;BD FACS CantoⅡ流式细胞仪及其配套试剂盒较BD FACS Calibur流式细胞仪及其配套试剂盒在总体检测速度上有显著提高;两台仪器所得的检测结果差异无统计学意义(P＞0.05),且前者检测结果的离散程度小于后者.结论 BD FACS CantoⅡ流式细胞仪各项性能均符合行业标准,仪器各项技术指标达标,可有效保障实验室检测结果的准确性,能为临床诊疗提供可靠支持.【期刊名称】《现代检验医学杂志》【年(卷),期】2019(034)002【总页数】6页(P94-99)【关键词】BD FACS CantoⅡ;流式细胞仪;性能评价【作者】方佩琪;孙林;顾梅秀;吴蕙;潘柏申;郭玮;王蓓丽【作者单位】复旦大学附属中山医院检验科,上海200032;复旦大学附属中山医院检验科,上海200032;复旦大学附属中山医院检验科,上海200032;复旦大学附属中山医院检验科,上海200032;复旦大学附属中山医院检验科,上海200032;复旦大学附属中山医院检验科,上海200032;复旦大学附属中山医院检验科,上海200032【正文语种】中文【中图分类】R446流式细胞术(flow cytometry，FCM)是一种利用流式细胞仪对单细胞或生物颗粒进行多参数、快速分析的技术[2]。
美国BD公司流式细胞仪 FACSCanto II介绍
• 分布：北京，上海
• 主要工作：对内对外各种培训，客户参观，Seminar、Workshop、 DEMO实验等
• 现有设备 仪器
配置
LSRFortessa
4 lasers 18 colors (6B/4R/6V/2UV)
FACSCalibur
2 lasers 4 colors
FACSVerse
3 lasers 8 colors with loader(4B/2R/2V)
定制服务 (Customs)
广泛适用于CHO、 NS0和杂交瘤细胞 等；根据不同工艺 要求可自主选择无 血清、无动物源和 化学限定培养基
适用于各种微生物 包括：大肠杆菌、 酵母发酵。品种齐 全(>50种)，分动物 源性产品和非动物
源性产品
对培养基进行全方 位设计，包括：基 础培养基优化、蛋 白水解物优化和流
Sheath Flow sheath tank
sheath filter sheath
interior reservoir
bubble fit tube or plate
sample injection tube (SIT)
flow cell
百年BD 全球足迹
BD是由Becton 和 Dickinson 于1897年在纽约创立的，总部设在新泽西州。 经过一百多年的发展，BD已成为世界上最大的开发、生产和销售医疗设备、 医疗系统和试剂的医疗技术公司之一， 目前经营超过产品10000余种。BD 致力于提高全世界人类的健康水平，并以其领先的技术、卓越的产品质量 和诚实可信的服务赢得了全球用户及合作伙伴的广泛赞誉。
细胞功能 = 细胞表面/胞浆/核的特
异性抗原 = 细胞活性 = 细胞内细胞因子 = 酶活性 = 激素结合位点 = 细胞受体 = 细胞凋亡
FACSCantoII中文培训手册
BD FACSCanto II TM 中文培训手册目 录录FACSCa FACSCanto nto (II)培训所需设备培训所需设备//试剂试剂 (3)FACSCanto(II)开机程序开机程序 (4)FACSCanto(II)关机程序关机程序 (6)BD FACSCanto 临床软件进行仪器日常质控临床软件进行仪器日常质控（（QC QC））........................ 7 HLA HLA--B27校准校准 (99)FACSCanto Clinical 六色免洗淋巴细胞亚群检测六色免洗淋巴细胞亚群检测 (10)FACSCanto Clinical 软件的获取分析的具体操作软件的获取分析的具体操作 (11)FACSCanto Clinical 软件进行HLA-B27分析分析 (14)Diva 软件进行HLA-B27手动获取和分析手动获取和分析 (18)Calibrite 四色小球模拟细胞演示四色实验演示四色实验样本获取和分析样本获取和分析样本获取和分析 (20)Diva 软件进行单色&双色获取和分析双色获取和分析 (23)Cytometer Setup and Tracking （CS&T ）操作流程操作流程 (24)FACSCanto (II)流式细胞仪HTS 操作规程 (31)FACSCanto(II)日常保养和维护日常保养和维护 (33)FACSCa FACSCanto nto (II)培训所需设备培训所需设备//试剂1. 普通低速离心机（实验要求为300g,相当于1000～1500rpm，可调转速调时间，能离心12x75mm 的5ml 试管)；2. 固定或可调节的加样器及相应加样头若干： 20ul,50ul, 100ul, 200ul, 250ul，450ul，1ml；3. 旋涡混匀器；4. 烧杯，量筒或移液管，三个清洁的玻璃或塑料带盖试剂瓶(50-100ml)，一个棕色瓶，漏斗，滤纸；5. 300目过滤尼龙网；6. 可放置12x75mm 的5ml 试管的试管架2－3个；7. PBS 溶液和蒸馏水：0.22µm 滤膜过滤；8. NaClO：分析纯，有效氯浓度10%；9. 每天需要一管2ml 的抗凝的人血样本 (最好是EDTA-K 3抗凝)；10.多聚甲醛。
FACSCantoII 日常维护
• 旋转把手拉出
3 门内，旋转上边界固定钮，取出旧滤网 4 安装上新的滤网，边框上的箭头方向向着仪器内部（指示气流方向） 5 固定钮固定好 6 关上侧门 • 关门时边旋转把手 • 向里推门直至卡住 • 按下黑色按钮
4 点 OK. 如果90min后仍未完成，到Status状态栏里查看是否有报错。如果不能顺利执行，参考液流车
Troubleshooting。 5 关机或继续执行液流启动程序 • 关机，退出软件，关闭主机开关。 • 继续实验，则执行 Cytometer (Instrument) > Fluidics Startup. BD FACS shutdown solution 会裂解细胞，液流启动程序会用 BD FACSFlow solution 替换掉管道内的 BD FACS shutdown solution。
每天
每周 每个月 每个月及叫工程师到现场 维修前 每 6 个月 每 6 个月或当 FSC vs SSC 图上碎片增多时
每 6 个月
每日液流开启程序后执行 两次
二，不定期的维护
维护过程 更换溶液桶 灌冲液流管路 排液路中气塞 外部擦干 清洗流动室 防气过滤器排气
描述பைடு நூலகம்
何时执行
更换用完的或坏掉的鞘液，清洗液，关 机液桶
根据需要
排气
当液流车上各溶液桶上的液流管路断掉重新 连接上时
排管路或滤器里的气体，充满液体
流式细胞仪BDFACSCantoII专题培训课件
阈值
可以以任意参数及多个参数的组合作为阈值 大多数样本都可以设定FSC/SSC 阈值以下的信号不存储 根据阴性对照管来调节 目的是将不需要的杂质信号，噪音信号，无用的细胞
信号等扣除，使收集到的都是有用信号
补偿
补偿方式：任意两个通道之间，可以采用手动或自动 补偿。
补偿的调节:根据单染对照管来调节
waste tank
液流系统
光学系统
激发光学系统包括: - 激光器 - 透镜和反射镜，将激光引导到检测区域
收集光学系统包括: - 滤光片，将产生的光信号引导到对应的光学接收器
光学系统
光学系统-滤光片
Longpass
460 500 540
Shortpass
460 500 540
Bandpass
前向散射光的强度是和细胞或其他检测颗粒的大小、形状密切相 关的
数据采集-侧向散射光
当激光光源被使用时，侧向也有一定量的散射光产生， 可以用90o 角的侧向散射光检测通道来采集
侧向散射光的强度和细胞或其他检测颗粒的颗粒密度、内部复杂程度密 切相关
外周全血细胞散射光双参数点
图
颗粒杂质、气泡
1.) Compensation - Too Little; Too Much
2.) Basic Principles of Compensation % Compensation is independent of fluorescence intensity
Fraction
ABC DE
数据分析
直方图
直方图(Distribution Histogram) – 横坐标代表荧光信号或散射光信号相对强度，单位是 对数，可以是线性或对数坐标。 – 纵坐标一般是细胞数。
BD FACSCantoⅡ流式细胞仪方法学性能验证
BD FACSCantoⅡ流式细胞仪方法学性能验证陈淑英;陈健;林勇;时朝辉【摘要】Objective To verify the main performance of BD FACSCantoⅡflow cytometry analyzer. Methods According to the Clinical and Laboratory Standards Institute(CLSI)documents and projects provided from other literatures,the analytical performance of BD FACSCantoⅡflow cytometry analyzer was evaluated by precision,accuracy,linearity and reference range of common test items(peripheral blood lymphocyte subtypes:CD3+Tcell,CD3+CD4+T cell,CD3+CD8+T cell,B cell and NK cell). The results were compared with the claims of manufacturers.Results Theprecision,accuracy,linearity and reference range of BD FACSCantoⅡflow cytometry analyzer in the determination of peripheral blood lymphocyte subtypes were in line with the performance parameters of manufacturers.Conclusions BD FACSCantoⅡflow cytometry analyzer has a good performance,accurate measurement and a high repeatability in the determination of peripheral blood lymphocyte subtypes,which can satisfy the need in clinics.%目的：对BD FACSCantoⅡ流式细胞仪的主要分析性能进行方法学验证。
Bd biosciences BD FACSVerse flow cytometer BD Accuri LSRFortessa FACSCanto LSRFortessa 流式细胞仪
Bd biosciences BD FACSVerse flow cytometer BD Accuri C6BD LSRFortessa X-20BD FACSCanto II BD LSRFortessa流式细胞仪The BD FACSVerse™ flow cytometer is designed to support cell analysis for research applications using up to 10 parameters. Hardware innovations ensure the reliability of results and signal resolution. BD FACSuite™ software delivers a seamless workflow from system setup, through data acquisition, analysis, and shutdown.To support a wide range of applications, predefined research assays are available. They can be run as-is and can serve as the starting point for creating user-defined experiments.Reliable Performance for All UsersThe compact optical system uses free-space lasers to concentrate intensity at the flow cell. It is designed to minimize light loss and maximize resolution for multicolor applications. A number of innovations built into the optical system—including patented automated laser alignment, smart filter-mirror units for the detector arrays, and a stainless steel flow cell—are designed to maximize reliability and improve system performance.Smart Heptagon Detector Arrays Ensure ReliabilityCompact heptagon detector arrays specially designed for the BD FACSVerse™ system use preassembled filter-mirror units, each with built-in memory chips that precisely identify the spectral information of both the mirror and filter. When the filter-mirror unit is inserted into the heptagon assembly, spectral information is passed from the microprocessor to the cytometer to verify that the unit matches the expected optical configuration. This is another way that the new BD FACSVerse system helps to ensure improved data integrity and ultimately, the reliability of results.Optimal sensitivity, compact designAutomated Alignment Adds ConsistencyPatented automated alignment and fine alignment features in the BD FACSVerse system also contribute to more consistent performance. Each laser can be independently aligned using a patented 30:1 optical reduction feature to make very small adjustments for achieving optimal alignment.Stainless Steel Flow Cell Adds StabilityThe flow cell in the BD FACSVerse analyzer is made of stainless steel and boosts stability in two ways. First, since stainless steel is hydrophilic, its affinity for water helps reduce bubbles for better overall fluidics performance. Second, the lower coefficient of thermal expansion of the stainless steelmakes the flow cell less sensitive to temperature fluctuations for more predictable, stabl e performance.Better Thermal StabilityAdvances in the design of the system’s excitation optics include superior thermal regulation of the lasers. Thermal stability ensures more consistent beam pointing, and as a result, more predictable optical performance.Smart Components Track PerformanceFinally, the optical system in the BD FACSVerse flow cytometer is continuously monitored to help keep it operating at top performance by alerting users to potential maintenance issues before failures occur. The laser and operational status are tracked to help manage configuration with minimal user interaction.Filter-Mirror UnitsCompact Optical Deck with Three LasersEight-Peak Bead DataBd biosciences BD FACSVerse™ 流式细胞仪专为10参数的科研应用而设计。
FACSCanto流式细胞仪原理(慕)
信号放大模式
光信号
光电倍增管（PMT）
放大器
电信号
放大器两种放大方 式：
➢ 线性放大（lin） ➢ 对数放大（log）
Байду номын сангаас
线性放大（lin）
按光强度的线性关系输出信号
线性放大（lin）
FSC、SSC、细胞周期检测等
对数放大（log）
按光强度的对数关系输出信号，用于大多 数荧光染色实验
FACSCantoII的PMT
FACSCanto II流式细胞仪原理
慕静静 15013019289 Jingjing_mu@
BD公司介绍
BD公司是由Maxwell W. Becton和Fairleigh S. Dickinson 于1897年在纽约创立的,总部位于美 国新泽西州
BD公司介绍
位居财富周刊500强的大型跨国公司 产品涵盖诸多医疗领域 生物科学部:流式细胞仪及应用于生物科学的试
门（Gate）
分析/分选感兴趣的细胞群
仪器运作需要的质控品
仪器校准需要微球 FACS 7 color setup beads
仪器清洁 BD FACSRinse BD Clean BD sheath
BD网站
更多的产品信息请登陆
有三类电脉冲信号 高度信号H 面积信号A 宽度信号W
脉冲信号类型
脉冲信号类型
阈值
信号放大过程会产生不需要的脉冲信号，通常 来自于碎片。通过设定某一信号的最低强度值， 可将不需要的脉冲信号去除，这一设定值称为 阈值。
阈值（threshhold）
屏蔽噪音信号和碎片信号
颜色补偿
采用合适的方法校正荧光染料之间叠加所造成的误差
补偿公式
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阈值
可以以任意参数及多个参数的组合作为阈值 大多数样本都可以设定FSC/SSC 阈值以下的信号不存储 根据阴性对照管来调节 目的是将不需要的杂质信号，噪音信号，无用的细胞
信号等扣除，使收集到的都是有用信号
补偿
补偿方式：任意两个通道之间，可以采用手动或自动 补偿。
补偿的调节:根据单染对照管来调节
信号被采集 转换成数字信号 存储于电脑上
回顾
流式细胞仪的三大组成部分？
滤光片LP600代表什么意思？BP400/40呢？
数据采集
三种数据： - 前向散射光FSC - 侧向散射光SSC - 各种荧光散射光FL1，FL2，FL3，FL4
数据采集-前向散射光
当使用激光光源时，在前向方向（和激光行进的方向相同）上可 用前向散射光接收通道接收到一定量的散射光
Small errors in compensation of a dim control (A) can result in large compensation errors with bright reagents (B & C).
流式数据 – 直方图 – 散点图 – 等高线图 – 密度图 – 三维图 – 统计数据
1000
100
FL2 10
1
0.1
0.1
1
10
100
1000
FL1 (FITC)
% Compensation is independe of fluorescence intensity
Fraction
A B C D E
FL2 - %FL1
21.3 22.0 20.2 20.5 21.4
3.) CompensationToo Dim, Too Bright Compensation Controls
前向散射光的强度是和细胞或其他检测颗粒的大小、形状密切相 关的
数据采集-侧向散射光
当激光光源被使用时，侧向也有一定量的散射光产生， 可以用90o 角的侧向散射光检测通道来采集
侧向散射光的强度和细胞或其他检测颗粒的颗粒密度、内部复杂程度密 切相关
外周全血细胞散射光双参数点
图
颗粒杂质、气泡
对检测的影响
数据分析
直方图
直方图(Distribution Histogram) – 横坐标代表荧光信号或散射光信号相对强度，单位是 对数，可以是线性或对数坐标。 – 纵坐标一般是细胞数。
散点图
散点图(Dot Plot) – X坐标为该细胞一参数相对含量，Y坐标为该细胞另一 参数的含量，可以将细胞亚群分开。
流式细胞仪背景知识
总览
流式细胞术基本知识 流式细胞仪的组成 数据采集与分析
流式细胞技术是什么？
Flow Cytometry Flow:Fluid Cyto:Cell Metry:Measurement
流式细胞术 – 在流动的状态中检测细胞或颗粒的各项特性 – 特异性强，灵敏度高，速度快，并能实现多参数分析 – 可检测的样本种类多样：外周血，骨髓，细胞穿刺液，洗脱 液，实体组织，培养细胞，微生物
sheath filter
sheath interior reservoir
bubble filter
Sample Flow test tube or plate
sample injection tube (SIT)
flow cell
interrogation point
waste interior reservoir
等高线图和密度图
三维图
统计数据
Events 百分比 平均荧光强度 荧光中位值 CV SD ……
数据获取与分析
电压 阈值 补偿
获得数据
画图 设门 统计
Thanks!
异性抗原 细胞活性 细胞内细胞因子 酶活性 激素结合位点 细胞受体 细胞凋亡
在上述信号基础上的细胞分选
流式细胞仪组成
液流系统：形成层流系统，聚焦细胞 光学系统：产生和收集光学信号 电子系统：光信号转化为电信号，进行信号处理
Fluidics Diagram
Sheath Flow sheath tank
流式细胞术检测样本
0.4um
40um
流式细胞术检测指标
流式细胞术提供的信息： - 相对细胞大小 - 相对细胞颗粒密度和内部复杂度 - 染色过细胞的相对荧光强度
流式细胞术的应用
细胞结构 细胞大小 细胞粒度 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量 染色体分析
细胞功能 细胞表面/胞浆/核的特
数据采集-荧光信号
细胞标记上荧光物质后，这种荧光物质要求特定波长 的激发光来激发，同时发出特定波长的光
荧光物质被激发以后产生的发射光将由特定的荧光通 道来接收
特定检测是通过光学滤片和透镜来控制的
荧光强度是和细胞上标记上的荧光染料的量正相关
数据采集
电压
信号放大方式：log、lin 信号类型：A,W,H 电压的调节:根据阴性对照管来调节
460 500 540
LP 500
SP 500
BP500/50
电子系统
Voltage
Laser Laser Laser
Voltage
Voltage
Time Time Time
电子系统
电子系统
Review
液流系统
悬浮状态的细胞 单个流过流动室
光学系统
细胞被激发
产生散射光和荧光 信号
电子系统
1.) Compensation - Too Little; Too Much
2.) Basic Principles of Compensation % Compensation is independent of fluorescence intensity
Fraction
ABC DE
waste tank
液流系统
光学系统
激发光学系统包括: - 激光器 - 透镜和反射镜，将激光引导到检测区域
收集光学系统包括: - 滤光片，将产生的光信号引导到对应的光学接收器
光学系统
光学系统-滤光片
Longpass
460 500 540
Shorass