蛋白质变性后的方面

蛋白质变性后的方面（一）生物活性丧失蛋白质的生物活性是指蛋白质所具有的酶、激素、毒素、抗原与抗体、血红蛋白的载氧能力等生物学功能。

生物活性丧失是蛋白质变性的主要特征。

有时蛋白质的空间结构只有轻微变化即可引起生物活性的丧失。

（二）某些理化性质的改变蛋白质变性后理化性质发生改变，如溶解度降低而产生沉淀，因为有些原来在分子内部的疏水基团由于结构松散而暴露出来,分子的不对称性增加，因此粘度增加，扩散系数降低。

（三）生物化学性质的改变蛋白质变性后，分子结构松散，不能形成结晶，易被蛋白酶水解。

蛋白质的变性作用主要是由于蛋白质分子内部的结构被破坏。

天然蛋白质的空间结构是通过氢键等次级键维持的，而变性后次级键被破坏，蛋白质分子就从原来有序的卷曲的紧密结构变为无序的松散的伸展状结构（但一级结构并未改变）。

所以，原来处于分子内部的疏水基团大量暴露在分子表面，而亲水基团在表面的分布则相对减少，至使蛋白质颗粒不能与水相溶而失去水膜，很容易引起分子间相互碰撞而聚集沉淀。

DNA变性DNA变性指DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。

变性时维持双螺旋稳定性的氢键断裂，碱基间的堆积力遭到破坏，但不涉及到其一级结构的改变。

凡能破坏双螺旋稳定性的因素，如加热、极端的pH、有机试剂甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等，均可引起核酸分子变性。

变性DNA常发生一些理化及生物学性质的改变： 1）溶液粘度降低。

DNA双螺旋是紧密的刚性结构，变性后代之以柔软而松散的无规则单股线性结构，DNA粘度因此而明显下降。

2）溶液旋光性发生改变。

变性后整个DNA分子的对称性及分子局部的构性改变，使DNA溶液的旋光性发生变化。

3）增色效应(hyperchromic effect)。

指变性后DNA溶液的紫外吸收作用增强的效应。

DNA分子中碱基间电子的相互作用使DNA分子具有吸收260nm波长紫外光的特性。

在DNA双螺旋结构中碱基藏入内侧，变性时DNA双螺旋解开，于是碱基外露，碱基中电子的相互作用更有利于紫外吸收，故而产生增色效应。

各类连接键，结构稳定的键多肽链中氨基酸残基的构成以及排列顺序称为氨基酸的一级结构,连接一级结构的键是肽键。

氨基酸的二级结构是指氨基酸主链原子的局部空间结构,并不涉及氨基酸残基侧链构象,二级结构的种类有α-螺旋、β-折叠、β-转角儿以及无规卷曲。

氢键是维系二级结构最主要的键。

三级结构是指多肽链主链以及侧链原子的空间排布。

次级键维持其稳定, 最主要的键是疏水键。

四级结构是指两条以上具有三级结构的多肽链之间缔合在一路的结构。

其中每条具有三级结构的多肽链称为亚基,一般具有四级结构的氨基酸才有生物科学活性。

维持其稳定的是次级键,如氢键、盐键、疏水键、范德华力等。

离子交换层析利用蛋白质的两性游离性质，在某一特定ＰＨ时，各蛋白质的电荷量及性质不同，故可以通过离子交换层析得以分离。

如阴离子交换层析，含负电量小的蛋白质首先被洗脱下来。

凝胶层析凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术，又称之凝胶过滤，分子筛层析或排阻层析。

单个凝胶珠本身象个"筛子"。

不同类型凝胶的筛孔的大小不同。

如果将这样的凝胶装入一个足够长的柱子中，作成一个凝胶柱。

当含有大小不同的蛋白质样品加到凝胶柱上时，比凝胶珠平均孔径小的蛋白质就要连续不断地穿入珠子的内部，这样的小分子不但其运动路程长，而且受到来自凝胶珠内部的阻力也很大，所以越小的蛋白质，把它们从柱子上洗脱下来所花费的时间越长。

凝胶中只有很少的孔径可接受大的蛋白。

因此，大的蛋白质直接通过凝胶珠之间的缝隙首先被洗脱下来。

凝胶过滤所用的凝胶孔径大小的选择主要取决于要纯化的蛋白质分子量。

凡是能降低酶促反应速度，但不引起酶分子变性失活的物质统称为酶的抑制剂。

按照抑制剂的抑制作用，可将其分为不可逆抑制作用和可逆抑制作用两大类。

⑴不可逆抑制作用：抑制剂与酶分子的必需基团共价结合引起酶活性的抑制，且不能采用透析等简单方法使酶活性恢复的抑制作用就是不可逆抑制作用。

如果以ν～[E]作图，就可得到一组斜率相同的平行线，随抑制剂浓度的增加而平行向右移动。

酶的不可逆抑制作用包括专一性抑制（如有机磷农药对胆碱酯酶的抑制）和非专一性抑制（如路易斯气对巯基酶的抑制）两种。

⑵可逆抑制作用：抑制剂以非共价键与酶分子可逆性结合造成酶活性的抑制，且可采用透析等简单方法去除抑制剂而使酶活性完全恢复的抑制作用就是可逆抑制作用。

如果以ν～[E]作图，可得到一组随抑制剂浓度增加而斜率降低的直线。

可逆抑制作用包括竞争性、反竞争性和非竞争性抑制几种类型。

① 竞争性抑制：抑制剂与底物竞争与酶的同一活性中心结合，从而干扰了酶与底物的结合，使酶的催化活性降低，这种作用就称为竞争性抑制作用。

其特点为：a.竞争性抑制剂往往是酶的底物类似物或反应产物；b.抑制剂与酶的结合部位与底物与酶的结合部位相同；c.抑制剂浓度越大，则抑制作用越大；但增加底物浓度可使抑制程度减小；d.动力学参数：Km值增大，Vm值不变。

典型的例子是丙二酸对琥珀酸脱氢酶（底物为琥珀酸）的竞争性抑制和磺胺类药物（对氨基苯磺酰胺）对二氢叶酸合成酶（底物为对氨基苯甲酸）的竞争性抑制。

② 反竞争性抑制：抑制剂不能与游离酶结合，但可与ES复合物结合并阻止产物生成，使酶的催化活性降低，称酶的反竞争性抑制。

其特点为：a.抑制剂与底物可同时与酶的不同部位结合；b.必须有底物存在，抑制剂才能对酶产生抑制作用；c.动力学参数：Km减小，Vm降低。

③ 非竞争性抑制：抑制剂既可以与游离酶结合，也可以与ES复合物结合，使酶的催化活性降低，称为非竞争性抑制。

其特点为：a.底物和抑制剂分别独立地与酶的不同部位相结合；b.抑制剂对酶与底物的结合无影响，故底物浓度的改变对抑制程度无影响；c.动力学参数：Km值不变，Vm值降低。

激活剂对反应速度的影响能够促使酶促反应速度加快的物质称为酶的激活剂。

酶的激活剂大多数是金属离子，如K+、Mg2+、Mn2+等，唾液淀粉酶的激活剂为Cl-。

呼吸链包含15种以上组分，主要由4种酶复合体和2种可移动电子载体构成。

其中复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、辅酶Q和细胞色素C的数量比为1：2：3：7：63：9。

1.复合体Ⅰ即NADH：辅酶Q氧化还原酶复合体，由NADH 脱氢酶（一种以FMN为辅基的黄素蛋白）和一系列铁硫蛋白（铁—硫中心）组成。

它从NADH得到两个电子，经铁硫蛋白传递给辅酶Q。

铁硫蛋白含有非血红素铁和酸不稳定硫，其铁与肽类半胱氨酸的硫原子配位结合。

铁的价态变化使电子从FMNH2转移到辅酶Q。

2.复合体Ⅱ由琥珀酸脱氢酶（一种以FAD为辅基的黄素蛋白）和一种铁硫蛋白组成，将从琥珀酸得到的电子传递给辅酶Q。

3.辅酶Q 是呼吸链中唯一的非蛋白氧化还原载体，可在膜中迅速移动。

它在电子传递链中处于中心地位，可接受各种黄素酶类脱下的氢。

复合体Ⅲ辅酶Q：细胞色素C氧化还原酶复合体，是细胞色素和铁硫蛋白的复合体，把来自辅酶Q的电子，依次传递给结合在线粒体内膜外表面的细胞色素C。

细胞色素类都以血红素为辅基，红色或褐色。

将电子从辅酶Q传递到氧。

根据吸收光谱，可分为三类：a,b,c。

呼吸链中至少有5种：b、c1、c、a、a3(按电子传递顺序)。

细胞色素aa3以复合物形式存在，又称细胞色素氧化酶，是最后一个载体，将电子直接传递给氧。

从a传递到a3的是两个铜原子，有价态变化。

复合体IV：细胞色素C氧化酶复合体。

将电子传递给氧。

固定化酶的概念制备方法及优点固定化酶：水溶性酶经物理或化学方法处理后，成为不溶于水的但仍具有酶活性的一种酶的衍生物。

在催化反应中以固相状态作用于底物。

优点：固定化酶（immobilized enzyme）不溶于水的酶。

是用物理的或化学的方法使酶与水不溶性大分子载体结合或把酶包埋在水不溶性凝胶或半透膜的微囊体中制成的。

酶固定化后一般稳定性增加，易从反应系统中分离，且易于控制，能反复多次使用。

便于运输和贮存，有利于自动化生产。

制备方法：固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类。

物理方法包括物理吸附法、包埋法等。

物生物技术在医药方面的应用目前，医药卫生领域是现代生物技术应用得最广泛、成绩最显著、发展最迅速、潜力也最大的一个领域。

疾病预防利用疫苗对人体进行主动免疫是预防传染性疾病的最有效手段之一。

注射或口服疫苗可以激活体内的免疫系统，产生专门针对病原体的特异性抗体。

疾病诊断生物技术的开发应用，提供了新的诊断技术，特别是单克隆抗体诊断试剂和DNA诊断技术的应用，使许多疾病特别是肿瘤、传染病在早期就能得到准确诊断。

疾病治疗生物技术在疾病治疗方面主要包括提供药物、基因治疗和器官移植等方面。

利用基因工程能大量生产一些来源稀少价格昂贵的药物，减轻患者的负担。

这些珍贵药物包括生长抑素、胰岛素、干扰素等等。

酶催化高效性的基本原理首先，酶的催化作用是因为它能够降低反应活化能。

因为它能够稳定反应的过渡态中间物。

具体来说，①定向效应和邻近效应（定向效应是把反应底物按一定方向排列，邻近效应是把底物拉到一起，这样反应更加方便）②酸碱反应和共价效应（一个是提供质子，另一个是接受质子来稳定过渡态中间物，③提供了反应微环境（因为活化中心一般都在酶的裂隙内，在那里是疏水的，有利于反应）。

酮体的生成利用及意义酮体的生成和氧化利用脂肪酸在肝外组织生成的乙酰CoA能彻底氧化成水和CO2，而肝细胞因具有活性较强的合成酮体（ketone body）的酶系，β-氧化生成的乙酰CoA大都转变为乙酰乙酸、β-羟丁酸和丙酮等中间产物，这三种物质统称为酮体。

（一）酮体的生成酮体在肝细胞线粒体内合成，原料为乙酰CoA，反应分三步进行。

1．在肝线粒体乙酰乙酰CoA硫解酶的催化下，2分子乙酰CoA缩合生成乙酰乙酰CoA，并释放出1分子CoASH。

2．在羟甲基戊二酸单酰CoA合成酶的催化下，乙酰乙酰CoA再与1分子乙酰CoA缩合生成β-羟基-β-甲基戊二酸单酰CoA(3-hydroxy-3-methyl glutarylCoA，HMG-CoA)，并释放出1分子CoASH。

3．在HMG-CoA裂解酶的催化下， HMG-CoA裂解生成乙酰乙酸，同时释放出1分子CoASH。

乙酰乙酸在β-羟丁酸脱氢酶催化下，由NADH+H+供氢，被还原生成β-羟丁酸，或脱羧生成丙酮。

（图6-4）肝线粒体含有酮体合成酶系，但氧化酮体的酶活性低，因此肝脏不能利用酮体。

酮体在肝内生成后，经血液运输至肝外组织氧化分解。

（二）酮体的氧化利用肝外组织中含有活性很强的氧化利用酮体的酶，能将酮体转变为乙酰CoA，经三羧酸循环彻底氧化成水和CO2，并释放大量能量（图7—6）。

1．琥珀酰CoA转硫酶：在心、肾、脑和骨骼肌线粒体中，乙酰乙酸和琥珀酰CoA在此酶的催化下，生成乙酰乙酰CoA和琥珀酸。