单克隆抗体人源化的进展及应用

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中国生物制品学杂志２００８年１月第２ｌ卷第１期Ｃｈｉｎ Ｊ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ Ｊａｎｕａｒｙ ２００８，Ｖ０１．２ｌ Ｎｏ．１
中国图书分类号Ｒ３９２．３３
文献标识码Ａ 文章编号１００４－５５０３｛２００８）０１－０７０－０４
单克隆抗体人源化的进展及应用
【综述】
孙红１岳玉环２朱平２
【摘要】 鼠源性单克隆抗体由于可引起免疫反应而逐渐被人源化抗体所代替，本文介绍了几种人源化抗体构建的策略 和表达系统以及人源化抗体在临床方面的应用。
万方数据
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表达。目前应用这些细胞已成功表达了多种人源化 单抗。通过实验还发现，利用转基因小鼠的乳腺细 胞也能表达完整抗体，并将抗体分泌到乳汁中［２０］。 ２．５植物细胞表达系统：近年来，人们发现植物细 胞中也能表达多种形式的抗体，其中包括表达重组 人．鼠嵌合抗体。植物细胞中有着与动物细胞相似 的蛋白质合成、分泌、折叠及翻译后修饰途径，只是 在蛋白质糖基化上与动物细胞略有差异。抗体能在 植物的叶子和果实中表达，而不丢失其结合的特异 性与亲和力【２１｜。１９９９年，Ｖａｑｕｅｒｏ等［２２］报道了采用 两个独立的植物表达载体在烟叶中瞬时表达人一鼠 嵌合抗体。 ２．６转基因动物表达系统：用于抗体规模化生产 时，细胞培养的高成本制约了其应用。利用转基因 动物作为生物反应器来生产重组抗体，可以解决这 一问题。利用转基因动物制药具有生产成本低、投 资周期短、表达量高、与天然产物完全一致、分离纯 化容易的优势，尤其适合于一些使用量大、结构复杂 的血液因子，如人血红蛋白、人血清白蛋白、蛋白Ｃ、 纤维蛋白原和抗体等。
微胞杂交干细胞技术是日本学者Ｉｓｈｉｄａ等首先 提出的。其技术要点是：首先将抗Ｇ４１８的人成纤维 细胞与小鼠的Ａ９细胞融合，通过筛选，得到抗Ｇ４１８ 的小鼠Ａ９细胞，再运用ＰＣＲ或原位荧光杂交 （ＦＩＳＨ）方法筛选，将筛选出的细胞用秋水仙素处理 ４８ ｈ，然后用细胞松弛素Ｂ（Ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ Ｂ）处理并高
还有一些人源化单抗是通过携带抗癌药物如毒 素、细胞毒药物、放射性核素、酶、化疗药物等分子而 发挥作用。这样偶联而成“生物导弹”，从而达到特 异性杀伤癌细胞的作用。 ３．２在器官移植中的应用：如何避免和尽可能减轻 移植后发生的排斥反应，以保护移植器官的功能，是
器官移植成败的关键。近年来，利用抗体药物作为 实体器官移植的诱导治疗逐渐增加。如最早批准 （１９８６年）进入美国市场的治疗性抗体类药物抗ＣＤ３ 单抗即被用于肾、心脏、肝脏移植排斥的逆转。 ３．３在自身免疫性疾病方面的应用：在对自身免疫 疾病的治疗中，单抗药物通过清除激活的细胞，阻滞 其功能，或将升高的促炎细胞因子水平降至正常水 平而抑制过度的免疫病理学反应。
达产物中有痕量蛋白，是以二聚体Ｆ（ａｂ’）２的形式 出现的［３｜。 １．２ ＣＤＲ移植抗体（ＣＤＲ ｇｒａｆｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）
为了减少鼠源成分，出现了ＣＤＲ移植抗体或改 型抗体（Ｒｅｓｈａｐｅｄ Ａｂ）。这是更为完全的人源化抗 体，即真正意义上的抗体人源化。抗体中除了３个 互补决定区（ｃＤＲ）是鼠源的外，其余全部是人源结 构。如国家Ｉ类癌症治疗新药“泰欣生”，即“泰欣生 重组人源化抗人表皮生长因子受体单克隆抗体”，采 用了先进的“ＣＤＲ移植”技术，人源化程度达到９５％ 以上，具有更高的安全性和更低的毒性Ｍｊ。 １．３ ＳＤＲ移植抗体（ＳＤＲ ｇｒａｆｔｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）
在转基因动物方面，有几种不同的途径生产人 抗体，其中一种方法是将已产生一定免疫反应的供 者或癌症患者的淋巴细胞导入严重联合免疫缺陷小 鼠（ＳＣｍ）或Ｔｒｉｍｅｍ小鼠，取鼠脾细胞与人骨髓瘤细 胞杂交就可能获得分泌人抗体的杂交瘤。另一条生 产人抗体的途径是通过基因敲除技术，使小鼠自身 的基因失活，并导入新基因，创造出携带人抗体重轻 链基因簇的转基因小鼠旧Ｊ。这种转人抗体基因小鼠 所携带的人ＤＮＡ片段具有完备的功能，可以有效地 进行同种型转换和亲和力成熟。任何靶抗原均可被 用来免疫该小鼠，使其产生高亲和力的人抗 体［１０～１ ２｜。
２０世纪８０年代中期开始研制的第一代人源化 抗体，即简单的嵌合抗体，是用人源基因代替鼠源单 抗的恒定区。这样构建的嵌合抗体不仅保留了抗原 抗体结合的特异性，又大大降低了鼠源单抗的免疫 原性。美罗华（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ）作为第一个用于肿瘤治疗 的基因工程抗体，就是由鼠可变区和人恒定区组成 的嵌合抗体。但由于嵌合抗体可变区（Ｖ）约占整个 抗体的３０％，鼠源性抗体Ｖ区中的框架区（ＦＲ）仍残 留一定的免疫原性，可诱发ＨＡＭＡ反应…。灵长目 源抗体也是一类嵌合抗体，通过免疫短尾猿猴产生。 由于短尾猿猴抗体的可变区几乎与人可变区无差 异，这类嵌合抗体不需要作任何改变，而不致发生抗
ＣＤＲ移植抗体同嵌合抗体比较，虽然大大减少 了鼠源成分，但有时异基因的ＣＤＲ人源化抗体可能 引起抗个体基因型反应。特定决定区（ＳＤＲ）转移抗 体是将异源抗体中与抗原结合密切相关的ＳＤＲ等 少数残基移植到人抗体相应位置上，进一步降低了 抗体的异源性［５，６］。通过这种方法，使人源化的抗 体潜在的免疫原性降至最低。 １．４全人单克隆抗体（Ｆｕｌｌｙ ｈｕｍａｎｅａｎｔｉｂｏｄｙ） １．４．１抗体库筛选技术 １．４．１．１噬菌体表面展示技术（Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｔｅｃｈ． ｎｏｌｏｇｙ） 随着抗体工程的发展，噬菌体展示技术应 运而生，即用ＰＣＲ技术从生物体内扩增出整套编码 人抗体的基因序列，克隆到噬菌体载体上，并以融合
３．人源化抗体的临床应用 近年来，人源化抗体和人抗体的出现为临床应
用带来了新的希望，当前正处于临床研究的多种抗 体中，嵌合抗体和人源化抗体所占比例大于 ７０％［２３ Ｊ。目前的人源化抗体，主要用于肿瘤、自身 免疫性疾病和心血管疾病的治疗以及抗移植排斥反 应和抗病毒感染等方面。 ３．１在肿瘤治疗方面的应用：单抗药物抗肿瘤能有 效地降低传统肿瘤药物治疗的不良反应。这些人源 化单克隆抗体的研制主要是针对那些与肿瘤发生、 发展相关的靶分子，如治疗非霍奇金淋巴瘤的抗 ＣＤ２０的嵌合抗体Ｒｉｔｕ）【ｉⅡｌａｂ［２４］和抗ＣＤ２２的人源化 抗体Ｅｐｒａｔｕｚｕｍａｂ［蚓，以及针对肿瘤靶位ＶＥＧＦ［矧、 ＥＧＦＲＬ２７“驯、ＣＤ３３［３０］等开发研制的人源化抗体。这 些靶分子在正常组织或细胞中就存在一定的表达， 但在许多肿瘤细胞中过度表达，因此可作为肿瘤特 异的标志物。
【关键词】单克隆抗体；人源化抗体；表达系统；临床应用
１９７５年，Ｋｏｈｌｅｒ与Ｍｉｌｓｔｅｉｎ发明了用来制备单克 隆抗体（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｍＡｂ）的杂交瘤技术，之 后单抗药物迅速发展并应用于临床。但是，鼠源性 单抗应用于人类有较强的免疫原性，主要缺陷是诱 发人抗鼠抗体（Ｈｕｍａｎ ａｎｔｉ—ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＨＡＭＡ）反 应，其次是鼠单抗不能有效地激活人体的生物效应 功能，因此限制了其临床应用。减少或避免ＨＡＭＡ 反应并提高疗效的主要途径是鼠源性单抗人源化， 或研制完全的人源性抗体。
１．人源化抗体的构建策略 鼠抗体人源化就是通过基因改造，使其和人体
内的抗体分子具有极其相似的轮廓，从而逃避人免 疫系统的识别，避免诱导ＨＡＭＡ反应。对鼠源抗体 进行人源化改造时要遵守两个原则，首先要保持抗 体的亲和力和特异性，其次要降低或消除抗体的免 疫原性。 １．１嵌合抗体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）
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蛋白的形式表达到噬菌体表面，从而可以方便地利 用抗原一抗体特异性结合进行筛选、扩增［７｜。此项技 术不仅可以获得具有人体性质的单抗，而且利用抗 原直接从库中筛选出所需基因，不需要细胞融合，甚 至不经过免疫动物，实验周期短，过程较简单，这是 人源抗体制备技术的重大突破。 １．４．１．２核糖体展示技术（Ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｄｉｓｐｌａｙ ｔｅｃｌｍｏｌ。 ｏｇｙ）该技术将基因型和表型联系在一起，编码蛋 白的ＤＮＡ在体外进行转录与翻译，由于对ＤＮＡ进 行了特殊的加工与修饰，如去掉３７末端终止密码子。 核糖体翻译到ｍＲＮＡ末端时，由于缺乏终止密码子， 停留在ｍＲＮＡ的３ ７末端不脱离，从而形成蛋白质．核 糖．２ｍＲＮＡ三聚体，将目标蛋白特异性的配基固相 化，然后进行筛选，对筛选分离得到的复合物进行分 解，释放出的ｍＲＮＡ进行ＲＴ－ＰＣＲ，ＰＣＲ产物进入下 一轮循环，多次循环后可使目标蛋白及其编码的基 因序列得到富集和分离…８。利用此技术可以获得特 异性的、高亲和力的抗体。 １．４．２转基因小鼠（Ｔｒａｎｓｇｅｎｅｔｉｃ ｍｏｕｓｅ）
２．人源化抗体的表达 目前常用的人源化抗体表达系统主要有大肠杆
菌体系、酵母体系、昆虫体系和哺乳动物细胞表达系 统［１６］。 ２．１大肠杆菌表达体系：由于完整的抗体分子是由 重链和轻链通过二硫键组装成的有生物功能的免疫 球蛋白，而大肠杆菌体系缺少转录及翻译后加工机 制，表达的蛋白质不能形成适当的折叠、进行糖基化 修饰或正确形成二硫键等，所以不适于完整抗体分 子的表达。因而更多的是用来高效表达Ｆｖ、Ｆａｂ及 ＳｃＦｖ等功能片段。 ２．２酵母表达体系：主要包括酿酒酵母、裂殖酵 母、克鲁维酸酵母、甲醇酵母等表达系统。甲醇酵母 表达系统是一种最近迅速发展的外源基因表达系 统，也是目前应用最广泛的酵母表达系统。巴斯德 毕赤酵母系统作为甲醇酵母系统之一，使用得最多、 最广泛［１７］，该表达系统具有强有力的基因启动子， 可严格调控外源蛋白的表达；同时可对表达的蛋白 进行翻译后的加工与修饰，从而使表达的蛋白具有 生物活性，此外该系统具有快速、简单、成本低、表达 效率高等优点【１８ｊ。 ２．３昆虫杆状病毒表达系统：昆虫杆状病毒表达系 统是一种优良的真核基因细胞表达系统。由于昆虫 细胞来源广，比较经济，而且具有正确完成蛋白质翻 译后加工和糖基化修饰等诸多优越性，已被广泛应 田于外源基因的表达。但该系统也存在不足之处， 即病毒感染会引起细胞的死亡，因此大批量生产有 一定的困难１１９ｊ。 ２．４哺乳动物细胞系统：该表达系统可以正确地 进行翻译后修饰，遗传稳定，成为嵌合抗体最合适的 宿主。其中常用的宿主细胞有３种：瞬时表达大多 采用非洲绿猴肾（ＣＯＳ）细胞；稳定表达中，骨髓瘤细 胞如Ｓｐ２／Ｏ主要用于单抗的高水平表达；中国仓鼠 卵巢（ＣＨＯ）细胞广泛用于以临床治疗为目的的抗体
基金项目：吉林省科技发展计划重点项目（２００６０９２９）． 作者单位：１吉林大学农学部畜牧兽医学院（长春１３００６２）；２军
事医学科学院军事兽医研究所（长春１３００６２）． 通讯作者：朱平，Ｅ－ｍａｉｌ：ｐｉｎｇｚｈｕ５＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｎ
万方数据
体反应［２］２。 Ｆａｂ和Ｆ（ａｂ’），嵌合抗体的制备原理是将功能
性抗体轻、重链可变区基因分别与人抗体的Ｋ链和 重链ＣＨｌ恒定区基因进行重组，克隆到表达载体 中，构建成鼠一人嵌合的Ｆａｂ基因表达载体，再转入 宿主细胞表达。天然抗体分子重链ＣＨｌ和ＣＨ２之 间的一段铰链区结构，其中的２个Ｃｙｓ残基可以生 成二硫键，将２条重链紧密地共价结合在一起。在
胁的ｃ．端额外连接一个Ｃｙｓ残基组成Ｆａｂ’，其表
Ｔｏｍｉｚｕｋａ等１１３ｊ首先以染色体为载体，成功培育 了转染色体小鼠，并制备了高亲和力的人抗体。日 本麒麟公司用基因工程技术，使小鼠携带完整的人 １４号染色体，该染色体包含全部人抗体产生基因。 但迄今尚无该技术生产的制品问世。
１．４．３微胞杂交干细胞技术［Ｍｉｃｒｏｃຫໍສະໝຸດ Baiduｌｌ．ｈｙｂｒｉｄｅ ＥＳ， ＭＨ（ＥＳ）］
速离心，分离出含２号、１４号或２２号染色体（片段） 的微胞，将微胞注人小鼠的胚胎干细胞，移人假孕母 鼠，即可得到含有人源２号、１４号或２２号染色体的 小鼠。人源抗体在这种转基因小鼠的产量还比较 低［１４］。 １．４．４其他方法
ＸＴＬ生物制药公司使用一种类似于人骨髓移植 的方法，用放射线破坏动物骨髓，然后注入人抗体生 成细胞。该公司已用此法生产出一种全人单抗【１５ Ｊ。