第二章-离心机的原理与应用复习进程

转速与RFC的换算：便于进行转速和相对离心力之 间的换算，人们在式③的基础上制作了三者关系的 列线计算图
半径
相对离心力
转速
方法：三点一线，左对左，右对右
2、转子离心管及选择 ⑴ 离心管
❖ 玻璃离心管质虽硬、但脆，不能承受超离心的压力。 ❖ 超离心机离心管：塑料管及不锈钢管。 ❖ 注意离心管的平衡 ❖ 离心时样品一般应装满离心管，否则将可能因有气泡而
• 常用的有蔗糖、甘油等。使用最多的是蔗糖密度梯度 系统，其梯度范围是：蔗糖浓度5％～60％，密度 1.02～1.30g/cm3。
• 密度梯度的制备可采用梯度混合器，也可将不同浓度 的蔗糖溶液，小心地一层层加入离心管中，越靠管底， 浓度越高，形成阶梯梯度。
• 离心前，把样品小心地铺放在预先制备好的密度梯度溶液的表面。
第二章-离心机的原理与应用
1．常速离心机
• 常速离心机又称为低速离心机。 • 其最大转速在6000 r／min以内，相对离心力(RCF)在
1×104g以下
– 主要用于分离细胞、细胞碎片以及培养基残渣等固形物，和粗结 晶等较大颗粒。
• 低速离心机的分离形式、操作方式和结构特点多种多样， 可根据需要选择使用。
上清液
100 000g,3h
沉淀(细胞膜 碎片、线粒体、 溶酶体)
沉淀 (核糖核蛋白体)
上清液 (可溶性组分)
• 2．密度梯度离心
• 密度梯度离心是样品在密度梯度介质中进行离心，使密度不同的 组分得以分离的一种区带分离方法。
• 密度梯度系统是在溶剂中加入一定的梯度介质制成的。
• 梯度介质应有足够大的溶解度，以形成所需的密度，不与分离组 分反应，而且不会引起分离组分的凝聚、变性或失活。
• 3．等密度离心
• 将CsCl2、CsSO4等介质溶液与样品溶液混合，然后在 选定的离心力作用下，经足够时间的离心，铯盐在离心 场中沉降形成密度梯度
• 样品中不同浮力密度的颗粒在各自的等密度点位置上形 成区带。
• 常用来分离提取核酸、亚细胞器和质粒。
• 前述密度梯度离心法中，欲分离的颗粒未达到其 等密度位置，故分离效果不如等密度离心法好。
• 相对离心力是指颗粒所受的
离心力与地心引力(重力)之比。 即:RCF=Fc/Fg==4π2n2r / （3600×980.6）×g 将有关数字代入上式，化简为： RCF=1.12×10-5·n2·r×g • 式中 RCF：相对离心力(g)；n： 转子每分钟转数(r／min)；r： 旋转半径(cm)；g：重力加速 度，980．6 cm／s2
2．高速离心机
• 高速离心机的转速为1×104～2．5×104 r／min。相 对离心力达1×104～1×105g，
– 主要用于分离各种沉淀物、细胞碎片和较大的细胞器等。
• 为了防止高速离心过程中温度升高而使酶等生物分子 变性失活，有些高速离心机装设了冷冻装置，称高速 冷冻离心机。
3．超速离心机
• 应当注意的是，铯盐浓度过高和离心力过大时， 铯盐会沉淀管底，严重时会造成事故，故等密度 梯度离心需由专业人员经严格计算确定铯盐浓度 和离心机转速及离心时间。
• 此外，铯盐对铝合金转子有很强的腐蚀性，故最 好使用钛合金转子，转子使用后要仔细清洗并干 燥。
三、离心条件的确定
• 离心分离的效果好坏与诸多因素有关。除了上 述的离心机种类、离心方法、离心介质及密度 梯度等以外
• 确定离心机的转速和离心时间 • 还要注意离心介质溶液的pH值和温度等条件。 •
• 1．离心力
• 物质颗粒在离心场中所受到的离心力(Fc)的大小，决定于 颗粒的质量(m)和离心加速度(αc)：Fc=mαc
• 离心加速度的大小取决于转子的转速和颗粒的旋转半径： αc=ω2r 式中ω：转子的角速度(rad／s)；r：旋转半径， 即颗粒到旋转轴中心的距离(cm)。
• 如此多次离心，使不同大小的颗粒分批分离。
• 差速离心所得到的沉降物含有 较多杂质，需经过重新悬浮和 再离心若干次，才能获得较纯 的分离产物。
• 差速离心主要用于分离大小和 密度差异较大的颗粒。操作简 单方便，但分离效果较差。
已破碎的细胞 500g,10’
• 举例：
沉淀 (细胞核)
上清液 10 000g,10’
使管的外部受压不均，造成离心管破裂，使转子不平衡 产生事故
⑵ 离心管帽
❖ 超离心机所用离心管一般都附有管帽，ห้องสมุดไป่ตู้心时离心管需 戴上管帽。
3、转子及选择
角转子（Type）、水平转子（sw）、垂直转子（v）、 区带转子（c）等 ⑴ 角转子 指离心管腔与转轴成一定倾角的转子
• 超速离心机的转速达2.5×104～8×104 r／min，最大相 对离心力达5×105g甚至更高一些。超速离心机的精密度 相当高。
– 分离细胞器、病毒、蛋白质、核酸、多糖等
• 为了防止样品液溅出，一般附有离心管帽； • 为防止温度升高，均有冷冻装置和温度控制系统； • 为了减少空气阻力和摩擦，设置有真空系统。 • 此外还有一系列安全保护系统、制动系统及各种指示仪表
等。
二、离心分离方法的选择
• 离心分离的方法可分为三类
• 1．差速离心
• 采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的 方法，称为差速离心。
• 操作时，采用均匀的悬浮液进行离心，选择好离心力和离心时间，使 大颗粒先沉降，取出上清液，在加大离心力的条件下再进行离心，分 离较小的颗粒。
• 离心后，不同大小、不同形状、有一定的沉降系数差异的颗粒在密 度梯度溶液中形成若干条界面清楚的不连续区带。
• 各区带内的颗粒较均一，分离效果较好。
• 在密度梯度离心过程中，区带的位置和宽度随离心时间的不同而改 变。
• 随离心时间的加长，区带会因颗粒扩散而越来越宽。为此，适当增 大离心力而缩短离心时间，可以减少区带扩宽。
• 若转速以惯用的每分钟转数(r／min)来表示，则 ω=2πn/60
• 代入上式，得到：αc =ω2r =4π2n2r /3600
• 式中 n：转子每分钟转数(r／min)。
• 在说明离心条件时，低速离心通常以转子每分钟的转数 表示，如4000 r／min。
• 而在高速离心时，特别是在超速离心时，往往用相对离 心力来表示。如：65 000g。