从业人员健康体检沙门氏菌、志贺氏菌检测操作程序(讨论稿)教学文案
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从业人员健康体检沙门氏菌、志贺氏菌检测操作程序(讨论稿)
从业人员健康体检沙门氏菌、志贺氏菌检测操作程序一、目的
本程序用于对从业人员健康体检进行沙门氏菌、志贺氏菌检测等致病菌检测的方法,以规范操作程序,保证检测数据的有效性。
二、适用范围:
本方法适用于从人体粪便中沙沙门氏菌、志贺氏菌的分离、鉴定及保存的梯相关操作。
三、生物安全要求
标本及相应的致病菌操作必须在BSL-2生物安全实验室的生物安全柜中进行。
四、试剂及仪器设备
4.1试剂
采便盒、Cary-Blair运送培养基、亚硒酸增菌液(SF)、改良亚硒酸盐磺绿增菌肉汤(SBG)、沙门志贺培养液、木糖-赖氨酸-脱氧胆酸琼脂(XLD)、麦康凯琼脂、沙门显色培养基、结晶紫沙门培养基(YS)、三糖铁(TSI)、动力-吲哚-尿素培养基(MIU)、沙门氏菌属诊断血清、志贺氏菌属诊断血清、API20E生化试剂条、磁珠菌种保存管
4.2 仪器设备
恒温培养箱、微生物鉴定仪
五、采样方法
5.1 标本应为新鲜的或转移至Cary-Blair运送培养基的粪便或肛拭子,最优标本是转移到Cary-Blair运送培养基的粪便拭子。肛拭子不是最佳标本,仅在病人无粪便标本时采用。
5.2 粪便标本:应采集自然排出的新鲜粪便,取稀水样、粘血样、脓血样,黏液样部分。盛于清洁、干燥、无吸水性的无菌容器,避免混入尿液、水和其他物质。
5.3肛拭标本:若无法获得粪便(如排便困难或婴幼儿),也可以采用肛拭子,即无菌棉拭子用生理盐水湿润后,插入肛门内4-5cm 处〈儿童约2-3cm),同一方向轻轻旋转2-3周。以目测能见到粪便为准。插入Cary-Blair运送培养基。
5.4 标本采集后立即送至实验室进行检测,若室温保存,不能超过
1h;如不能立即送检,应放入Cary-Blair运送培养基中冷藏条件下24小时内送检。
六、检验程序
七、操作步骤
7.1 分别标记一个XLD平板(或YS平板、麦康凯平板)和1管
9ml改良亚硒酸盐磺绿增菌肉汤(SBG)(或SF增菌液或沙门志贺培养液)。
7.2 用1个无菌拭子取少量标本(不要使拭子粘得太多,尽量从可见血或黏液的部位收集)接种在XLD平板的第一区,接着把拭子放入SBG增菌液。再灭菌接种环在XLD平板的其余区进行划线接种。如果是Cary-Blair运送培养基的粪便拭子,则轻搅混合标本后接种增菌液与平板。
7.3 所有培养基均放入36℃±1℃培养,SBG的最佳增菌时间是16~18h(建议每天下午4~5时接种标本,第二天早上8~10时用增菌液划平板)。
7.4 观察平板:取培养后的平板,观察有无可疑菌落。
7.4.1 XLD平板可疑菌落观察:志贺菌在XLD平板上为粉红或无色、透明、光滑、湿润、边缘整齐、圆形菌落,直径1-2mm,而大部分的大肠杆菌类的菌落为黄色、混浊、凸起、湿润、边缘整齐或不规则,直径2-3mm。大多数沙门菌在XLD平板上中心黑色的透明、光滑、湿润、边缘整齐、圆形的菌落。(图2)
7.4.2YS平板可疑菌落观察:
7.4.3麦康凯平板可疑菌落观察:志贺菌在麦康凯平板上为无色至浅粉色、半透明、光滑、湿润、边缘整齐或不规则、圆形菌落,直径2-3mm;大多数沙门菌为无色菌落,粉红色,带或不带黑心,伤寒沙门菌为无色菌落;而大部分的大肠杆菌类的菌落为粉红或红色、混浊、凸起、湿润、边缘整齐或不规则,直径3-4mm。
7.4.4 SBG肉汤增菌:SBG增菌16~18小时后,划线接种XLE 平板或沙门显色平板,放入36℃±1℃培养18~24h。沙门显色平板可疑菌落观察:典型的沙门菌在沙门显色平板上为紫色的菌落,直径2-3mm。
7.4.4 建议的初步筛查方案(初步生化特征见表1):
表1沙门菌、伤寒沙门菌、志贺菌及常见肠道菌的初步生化特征
A:粪便(或肛拭子)SBG或SF增菌 XLD分离
接种TSI和MIU
B:粪便(或肛拭子)SBG或SF增菌 YS分离
接种TSI和MIU
C:粪便(或肛拭子)SBG或SF增菌 XLD和麦康凯分离接种TSI和MIU
D:粪便(或肛拭子)SBG或SF增菌 YS和沙门显色分离接种TSI和MIU
E:粪便(或肛拭子)SBG或SF增菌 XLD和沙门显色分离接种TSI和MIU
7.5 生化初步鉴定
每个平板挑取3~5个分离较好的单个可疑菌落,分别接种到三糖铁(TSI)和动力-吲哚-尿素培养基(MIU),36℃±1℃培养18~24h。沙门菌和志贺菌的生化特征见表2。
7.6 系统生化试验
沙门菌和志贺菌初步鉴定阳性菌经转种营养琼脂单,取单个菌落进行系统生化鉴定(可以使用APE20E或全自动生化鉴定系统进行)。
7.7血清学试验
7.7.1 志贺菌血清学试验
7.7.1.1挑取生化反应实筛符合志贺菌的营养琼脂斜面,首先用四
种多价血清做玻片凝集反应(4种多价包括:A群1、2型;B群和D群)。凝集者则用B群多价、D群和A1、A2、血清分别凝集。
7.7.1.2若多价血清不凝集,可能为C群或A群的3~12型,应进行C群的四种多价和A群另三种多价血清做玻片凝集。
7.7.2 沙门菌血清学试验
7.7.2.1挑取生化反应实筛符合沙门菌的营养琼脂斜面,首先用A-F群O多价血清做玻片凝集反应。
7.7.2.2若凝集可按常见O因子检出频率,按照O4→O10→O9→O7→O8→O19→O2→O11顺序凝集。
7.7.2.3 H抗原凝集
7.7.3 所有凝集阳性的菌落,都要同时用生理盐水做凝集试验,只有不出现自凝时,才可以报告阳性结果。
8 结果报告
8.1 在初步生化鉴定符合后,可以先将可疑菌落进行革兰氏染色,最后综合生化及血清学结果,可以报告检出(或未检出)沙门菌(或志贺菌)。