从业人员健康体检沙门氏菌、志贺氏菌检测操作程序(讨论稿)教学文案

从业人员健康体检沙门氏菌、志贺氏菌检测操作程序(讨论稿)

从业人员健康体检沙门氏菌、志贺氏菌检测操作程序一、目的

本程序用于对从业人员健康体检进行沙门氏菌、志贺氏菌检测等致病菌检测的方法，以规范操作程序，保证检测数据的有效性。

二、适用范围：

本方法适用于从人体粪便中沙沙门氏菌、志贺氏菌的分离、鉴定及保存的梯相关操作。

三、生物安全要求

标本及相应的致病菌操作必须在BSL-2生物安全实验室的生物安全柜中进行。

四、试剂及仪器设备

4.1试剂

采便盒、Cary-Blair运送培养基、亚硒酸增菌液（SF）、改良亚硒酸盐磺绿增菌肉汤（SBG）、沙门志贺培养液、木糖-赖氨酸-脱氧胆酸琼脂（XLD）、麦康凯琼脂、沙门显色培养基、结晶紫沙门培养基（YS）、三糖铁（TSI）、动力-吲哚-尿素培养基（MIU）、沙门氏菌属诊断血清、志贺氏菌属诊断血清、API20E生化试剂条、磁珠菌种保存管

4.2 仪器设备

恒温培养箱、微生物鉴定仪

五、采样方法

5.1 标本应为新鲜的或转移至Cary-Blair运送培养基的粪便或肛拭子，最优标本是转移到Cary-Blair运送培养基的粪便拭子。肛拭子不是最佳标本，仅在病人无粪便标本时采用。

5.2 粪便标本：应采集自然排出的新鲜粪便，取稀水样、粘血样、脓血样，黏液样部分。盛于清洁、干燥、无吸水性的无菌容器，避免混入尿液、水和其他物质。

5.3肛拭标本：若无法获得粪便（如排便困难或婴幼儿），也可以采用肛拭子，即无菌棉拭子用生理盐水湿润后，插入肛门内4-5cm 处〈儿童约2-3cm），同一方向轻轻旋转2-3周。以目测能见到粪便为准。插入Cary-Blair运送培养基。

5.4 标本采集后立即送至实验室进行检测，若室温保存，不能超过

1h；如不能立即送检，应放入Cary-Blair运送培养基中冷藏条件下24小时内送检。

六、检验程序

七、操作步骤

7.1 分别标记一个XLD平板（或YS平板、麦康凯平板）和1管

9ml改良亚硒酸盐磺绿增菌肉汤（SBG）（或SF增菌液或沙门志贺培养液）。

7.2 用1个无菌拭子取少量标本（不要使拭子粘得太多，尽量从可见血或黏液的部位收集）接种在XLD平板的第一区，接着把拭子放入SBG增菌液。再灭菌接种环在XLD平板的其余区进行划线接种。如果是Cary-Blair运送培养基的粪便拭子，则轻搅混合标本后接种增菌液与平板。

7.3 所有培养基均放入36℃±1℃培养，SBG的最佳增菌时间是16～18h（建议每天下午4~5时接种标本，第二天早上8~10时用增菌液划平板）。

7.4 观察平板：取培养后的平板，观察有无可疑菌落。

7.4.1 XLD平板可疑菌落观察：志贺菌在XLD平板上为粉红或无色、透明、光滑、湿润、边缘整齐、圆形菌落，直径1-2mm，而大部分的大肠杆菌类的菌落为黄色、混浊、凸起、湿润、边缘整齐或不规则，直径2-3mm。大多数沙门菌在XLD平板上中心黑色的透明、光滑、湿润、边缘整齐、圆形的菌落。（图2）

7.4.２YS平板可疑菌落观察：

7.4.３麦康凯平板可疑菌落观察：志贺菌在麦康凯平板上为无色至浅粉色、半透明、光滑、湿润、边缘整齐或不规则、圆形菌落，直径2-3mm；大多数沙门菌为无色菌落，粉红色，带或不带黑心，伤寒沙门菌为无色菌落；而大部分的大肠杆菌类的菌落为粉红或红色、混浊、凸起、湿润、边缘整齐或不规则，直径3-4mm。

7.4.４ SBG肉汤增菌：SBG增菌16~18小时后，划线接种XLE 平板或沙门显色平板，放入36℃±1℃培养18～24h。沙门显色平板可疑菌落观察：典型的沙门菌在沙门显色平板上为紫色的菌落，直径2-3mm。

7.4.4 建议的初步筛查方案（初步生化特征见表1）：

表１沙门菌、伤寒沙门菌、志贺菌及常见肠道菌的初步生化特征

A：粪便（或肛拭子）SBG或SF增菌 XLD分离

接种TSI和MIU

B：粪便（或肛拭子）SBG或SF增菌 YS分离

接种TSI和MIU

C：粪便（或肛拭子）SBG或SF增菌 XLD和麦康凯分离接种TSI和MIU

D：粪便（或肛拭子）SBG或SF增菌 YS和沙门显色分离接种TSI和MIU

E：粪便（或肛拭子）SBG或SF增菌 XLD和沙门显色分离接种TSI和MIU

7.5 生化初步鉴定

每个平板挑取3~5个分离较好的单个可疑菌落，分别接种到三糖铁（TSI）和动力-吲哚-尿素培养基（MIU），36℃±1℃培养18～24h。沙门菌和志贺菌的生化特征见表2。

7.6 系统生化试验

沙门菌和志贺菌初步鉴定阳性菌经转种营养琼脂单，取单个菌落进行系统生化鉴定（可以使用APE20E或全自动生化鉴定系统进行）。

7.7血清学试验

7.7.1 志贺菌血清学试验

7.7.1.1挑取生化反应实筛符合志贺菌的营养琼脂斜面，首先用四

种多价血清做玻片凝集反应(4种多价包括：A群1、2型；B群和D群)。凝集者则用B群多价、D群和A1、A2、血清分别凝集。

7.7.1.2若多价血清不凝集，可能为C群或A群的3～12型，应进行C群的四种多价和A群另三种多价血清做玻片凝集。

7.7.2 沙门菌血清学试验

7.7.2.1挑取生化反应实筛符合沙门菌的营养琼脂斜面，首先用A-F群O多价血清做玻片凝集反应。

7.7.2.2若凝集可按常见O因子检出频率，按照O4→O10→O9→O7→O8→O19→O2→O11顺序凝集。

7.7.2.3 H抗原凝集

7.7.3 所有凝集阳性的菌落，都要同时用生理盐水做凝集试验，只有不出现自凝时，才可以报告阳性结果。

8 结果报告

8.1 在初步生化鉴定符合后，可以先将可疑菌落进行革兰氏染色，最后综合生化及血清学结果，可以报告检出（或未检出）沙门菌（或志贺菌）。