HPLC基础知识-讲师版
hplc（液相色谱）常识及疑难详解（附实际操作图解lc-20a）
1 液相色谱基础知识1.1 液相色谱名词术语Mobile phase：流动相，在色谱柱中存在着相对运动的两相，一相为固定相，一相为流动相。
流动相是指在色谱过程中载带样品（组分）向前移动的那一相。
Stationary phase：固定相，柱色谱或平板色谱中既起分离作用又不移动的那一相。
Gradient elution: 梯度洗脱,一个分析周期中，按一定程序不断改变流动相的浓度配比, 使一个复杂样品中的性质差异较大的组分能按各自适宜的容量因子k达到良好的分离目的。
Detection wavelength：检测波长，retention time：保留时间，被分离样品组分从进样开始到柱后出现该组分浓度极大值时的时间Peak:峰Peak Base：峰基线，经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。
一般应平行于时间轴Peak Height：峰高，色谱峰顶点至峰底的距离。
Peak Width：峰宽，色谱峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点间的距离Peak Width at Half Height：半峰高宽Peak Area：峰面积Tailing Peak: 后沿较前沿平缓的不对称峰Leading Peak:前沿较后沿平缓的不对称峰Ghost Peak: 假峰，并非由试样所产生的峰Baseline Drift:基线漂移Baseline Noise:基线噪音Band Broadening:组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象. 1.2 流动相1.2.1 流动相类型正相液相色谱流动相：一般正相色谱固定相极性大于流动相极性，采用极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流动相为相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。
常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等），极性小的组分先出柱。
反相液相色谱流动相：一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。
HPLC讲义
高效液相色谱(HPLC)法测定邻苯二甲酸酯一. 实验目的1、学习高效液相色谱仪的基本操作方法。
2、了解高效液相色谱仪原理和条件设定方法。
3、了解高效液相色谱法在日常分析中的应用。
二. 实验原理高效液相色谱法是以液体作为流动相，借助于高压输液泵获得相对较高流速的液流以提高分离速度、并采用颗粒极细的高效固定相制成的色谱柱进行分离和分析的一种色谱方法。
在高效液相色谱中，若采用非极性固定相，如十八烷基键合相，极性流动相，即构成反相色谱分离系统。
反之，则称为正相色谱分离系统。
反相色谱系统所使用的流动相成本较低，应用也更为广泛。
定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。
分离度（R）的计算公式为：R＝ 2[t(R2)-t(R1)] /1.7*(W1＋W2)式中 t(R2)为相邻两峰中后一峰的保留时间； t(R1)为相邻两峰中前一峰的保留时间； W1及W2为此相邻两峰的半峰宽。
除另外有规定外，分离度应大于1.5。
本实验对象为邻苯二甲酸酯，又称酞酸酯，缩写PAE，常被用作塑料增塑剂。
它被普遍应用于玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管、乙烯地板和壁纸、清洁剂、润滑油、个人护理用品，如指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液等数百种产品中。
但研究表明，邻苯二甲酸酯在人体和动物体内发挥着类似雌性激素的作用，是一类内分泌干扰物。
待测物性质见表1。
表1色谱柱测试条件液，在不同条件下进行HPLC分离检测。
三.仪器与试剂1、仪器Agilent 1100高效液相色谱仪，50ul微量注射器。
2、试剂甲醇（色谱专用），高纯水四. 实验步骤1、色谱条件色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶（C8）柱温：室温流动相：初始为高纯水：30％，甲醇：70％检测器：DAD检测器;检测波长：220nm；进样体积：100µl定量环，实际注射每次可控制在200µl。
2、待测溶液的配制首先用甲醇做溶剂配制储备液：邻苯二甲酸二甲酯（0.3880g/L），邻苯二甲酸二乙酯（0.2770g/L），邻苯二甲酸二丁酯（0.3776g/L）。
高效液相色谱的基础知识 PPT
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高效液相色谱法的特点 高效液相色谱法仪器工作原理 高效液相色谱仪的维护 高效液相色谱法仪的注意事项
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高效液相色谱法的特点
高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末70 年代初发展起来的一种新型分离分析技术。它是 在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论， 在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度 检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、 操作自动化的特点。为了更好地了解高效液相色 谱法优越性，现从两方面进行比较：
• 高压输液系统 • 进样系统 • 分离系统 • 检测系统
高效液相色谱仪工作原理
其工作过程如下：
高效液相色谱仪的维护 泵的使用和维护
1.防止任何固体微粒进入泵体，输液泵的滤器应经常清洗或更换。 2.流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应保留在泵内。泵工 作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或 密封环，最终产生漏液。 3.泵的工作压力决不要超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形，产生漏 液。 4.流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性，如果有大量气 泡，泵就无法正常工作
高效液相色谱法的特点
高效液相色谱法与经典液相色谱法
高效液相色谱法 速度 灵敏度 高速 高灵敏度 经典液相色谱法 极慢 低
自动化
进料方式 效率
高自动化
高压输液设备 高效
低
重力加料 低
如对氨基酸分离，用经典色谱法，需用20多小时才能分离出20种氨基酸； 而用高效液相色谱法，只需lh之内即可完成。
高效液相色谱仪工作原理
CAP2000+粘度计使用说明书（下）
• • 样品应完全覆盖锥转子底部表面，并且溢出其边沿 1.0mm。 8. 等待约 1至 3分钟，使锥转子、加热板及样品的温度到达设置温度。
关于HPLC的基础知识(中文)
(干货)液相色谱基础知识大全
一、基本原理高效液相色谱（HPLC）法是以高压下的液体为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术。
高效液相色谱对样品的适用性广，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，因而弥补了气相色谱法的不足。
在目前已知的有机化合物中，可用气相色谱分析的约占20%，而80%则需用高效液相色谱来分析。
高效液相色谱和气相色谱在基本理论方面没有显著不同，它们之间的重大差别在于作为流动相的液体与气体之间的性质的差别。
二、高效液相色谱分析原理（1）、高效液相色谱分析的流程：由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。
被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。
废液流入废液瓶。
遇到复杂的混合物分离（极性范围比较宽）还可用梯度控制器作梯度洗脱。
这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而HPLC改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。
（2）、高效液相色谱的分离过程：同其他色谱过程一样，HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。
它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。
开始样品加在柱头上，假设样品中含有3个组分，A、B和C，随流动相一起进入色谱柱，开始在固定相和流动相之间进行分配。
分配系数小的组分A不易被固定相阻留，较早地流出色谱柱。
分配系数大的组分C在固定相上滞留时间长，较晚流出色谱柱。
组分B的分配系数介于A，C之间，第二个流出色谱柱。
若一个含有多个组分的混合物进入系统，则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱，达到分离之目的。
不同组分在色谱过程中的分离情况，首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异，这是热力学平衡问题，也是分离的首要条件。
其次，当不同组分在色谱柱中运动时，谱带随柱长展宽，分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度的大小、柱的填充情况以及流动相的流速等有关。
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3）示差折光检测器
原理：利用两束相同角度的光照射溶剂相和样 品+溶剂相，利用二者对光的折射率不同，其中一束 （通常是通过样品+溶剂相）光因为发生偏转造成两 束光的强度差发生变化，将此差示信号放大并记录， 该信号代表样品的浓度。
为通用型检测器，灵敏度为10-7g/mL。但对温 度变化敏感，且不适于梯度淋洗。
当采用粘度较大的试剂，如CC4，CH3OH, 丙酮，二氧杂环已烷、THF 等。 填充方法：
填充时，按上述方法制作匀浆液，用流动相充满色谱柱及其延长管中， 然后将匀浆液倒入匀浆填充器，在较高压力下迅速将其注入色谱柱内。要 求填充速度快(防凝聚、沉降或结块)、且无空气进入(影响填充均匀性)。
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3. 色谱柱
1）对色谱柱的要求：内壁光滑的优质不锈钢柱，柱接头的死体积尽可能小。 柱长多为15~30cm，内径为4~5mm(尺寸排阻色谱柱常大于5mm，制备色谱 柱内径更大)； 2）柱的填充：主要采用匀浆法。根据使用匀浆试剂的性质不同可分为： 平衡密度法：
即使溶剂密度和填充颗粒密度相近，此时颗粒沉降速度趋于0。常用的 匀浆试剂有四氯乙烯、四溴乙烷和二碘甲烷等； 非平衡密度法：
Deuterium lamp
Lens
Lens system Holmium filter Detector cell
Optical slit
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Diode Array
Grating 33
Time msec
LIGH T
PHOTODIOD E
Wavelength nm
HPLC基础知识
HPLC基礎知識三、色譜法分類按兩相的物理狀態可分為：氣相色譜法(GC)和液相色譜法(LC)。
氣相色譜法適用於分離揮發性化合物。
GC根據固定相不同又可分為氣固色譜法(GSC)和氣液色譜法(GLC)，其中以GLC應用最廣。
液相色譜法適用於分離低揮發性或非揮發性、熱穩定性差的物質。
LC同樣可分為液固色譜法(LSC)和液液色譜法(LLC)。
此外還有超臨界流體色譜法(SFC)，它以超臨界流體（界於氣體和液體之間的一種物相）為流動相（常用CO2），因其擴散係數大，能很快達到平衡，故分析時間短，特別適用於手性化合物的拆分。
按原理分為吸附色譜法(AC)、分配色譜法(DC)、離子交換色譜法(IEC)、排阻色譜法(EC，又稱分子篩、凝膠過濾(GFC)、凝膠滲透色譜法(GPC）和親和色譜法。
（此外還有電泳。
）按操作形式可分為紙色譜法(PC)、薄層色譜法(TLC)、柱色譜法。
四、色譜分離原理高效液相色譜法按分離機制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法（正相與反相）、離子交換色譜法、離子對色譜法及分子排阻色譜法。
1〃液固色譜法使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上分離原理是根據固定相對組分吸附力大小不同而分離。
分離過程是一個吸附－解吸附的平衡過程。
常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度5~10μm。
適用於分離分子量200~1000的組分，大多數用於非離子型化合物，離子型化合物易產生拖尾。
常用於分離同分異構體。
2〃液液色譜法使用將特定的液態物質塗於擔體表面，或化學鍵合於擔體表面而形成的固定相，分離原理是根據被分離的組分在流動相和固定相中溶解度不同而分離。
分離過程是一個分配平衡過程。
塗布式固定相應具有良好的惰性；流動相必頇預先用固定相飽和，以減少固定相從擔體表面流失；溫度的變化和不同批號流動相的區別常引起柱子的變化；另外在流動相中存在的固定相也使樣品的分離和收集複雜化。
由於塗布式固定相很難避免固定液流失，現在已很少採用。
現在多採用的是化學鍵合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。
HPLC色谱柱的基础知识及使用技巧
HPLC色谱柱的基础知识及使用技巧一、引言高效液相色谱法（HPLC）是一种广泛应用于化学、生物、医药等领域的分析技术。
色谱柱是HPLC系统的核心组成部分，其性能直接影响分析结果的准确性和可靠性。
本文将详细介绍HPLC色谱柱的基本原理、分类、使用及维护等方面的专业知识。
二、色谱柱的基本原理色谱法是一种基于不同物质在固定相和移动相之间的分配平衡进行分离的物理化学方法。
HPLC色谱柱的核心是固定相，它是由硅胶、氧化铝、活性炭等颗粒状物质组成。
当样品溶液通过色谱柱时，不同物质根据其与固定相的相互作用力大小，依次从固定相中解吸下来，从而实现各成分的分离。
三、色谱柱的分类1.正相色谱柱：适合分离极性化合物，如糖类、醇类等。
2.反相色谱柱：适合分离非极性化合物，如脂肪酸、烃类等。
3.离子交换色谱柱：适合分离带电离子或极性化合物，如氨基酸、核酸等。
4.体积排阻色谱柱：适合分离大分子物质，如蛋白质、多糖等。
四、色谱柱的选择与使用1.根据分析物的性质选择合适的色谱柱。
2.确保色谱柱不受污染，使用前需进行清洗和活化。
3.避免过度使用压力，以延长色谱柱的使用寿命。
4.定期更换色谱柱，以保证分析结果的稳定性。
五、色谱柱的维护与保养1.使用后及时清洗色谱柱，防止残留物对柱子的污染。
2.色谱柱应储存于干燥、避光的环境中，避免受潮或暴晒。
3.对于长期不用的色谱柱，应定期检查其性能并进行活化处理。
4.避免将色谱柱置于高温或低温环境中，以防止硅胶固定相产生裂纹或变形。
5.定期更换流动相，以保证流动相的质量和稳定性。
同时，流动相的pH值应控制在固定相所能承受的范围内。
6.在使用过程中，应时刻关注色谱柱的压力变化。
若发现异常压力或突然变化，应及时检查柱子是否堵塞或受损。
若确有问题，应立即停止使用并进行修复或更换。
7.在使用过程中，还应注意观察色谱峰的形状和大小。
若发现异常峰或分离效果变差，应考虑更换流动相或清洗柱子。
若问题仍未解决，应考虑更换色谱柱。
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➢ 液体为流动相的色谱称液相色谱（LC） 同理液相色谱亦可分为液固色谱（LSC）和 液液色谱（LLC）
随着色谱工作的发展，通过化学反应将固 定液键合到载体表面，这种化学键合固定相 的色谱又称化学键合相色谱（CBPC）
➢ 超临界流体为流动相的色谱为超临界流体色
谱（SFC）
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各组分按吸附或溶解能力的强弱顺序，依
次顶替出固定相
很明显，吸附或溶解能力最弱的组分最先
流出，最强的最后流出。顶替法的流出曲
线如下图
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AB
此法适于制备纯物质或浓缩分离某
一组分；其缺点是经一次使用后，柱子
就被样品或顶替剂饱和，必须更换柱子
或除去被柱子吸附的物质后，才能再使
用
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离子对色谱
❖ 原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的 离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶 质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够 在两相之间进行分配
❖ 阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基 铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子
❖ 阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠 作为对离子
这种方法能使样品的各组分获得良好 的分离，色谱峰清晰。此外，除去冲洗剂 后，可获得纯度较高的物质。目前，这种 方法是色谱法中最常用的一种方法
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▪ 顶替法是将样品加到色谱柱头后，在惰性
流动相中加入对固定相的吸附或溶解能力
比所有试样组分强的物质为顶替剂（或直
接用顶替剂作流动相），通过色谱柱，将
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按流动相分
气相色谱（GC） 液相色谱（LC） 超临界流体色谱（SFC）
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此为基本操作过程，详见标准操作规程。
系统适应性实验
系统适应性试验即用各品种项下规定的对照品和条件对色谱系统进行试 验，应符合要求。否则可对色谱分离条件作适当的调整。
理论板数n 主要考察柱效，药典通常要求不低于3000或4000。
系统适应性实验
理论板数（n）考察柱效
在选定的条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的对照物质 溶液，记录色谱图，量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间 tR（以分钟或长度计，下同,但应取相同单位）和半高峰宽(Wh/2),按 下式计算色谱柱的理论板数。如果测得理论板数低于各品种项下 规定的最小理论板数，应改变色谱柱的某些条件（如柱长、载体 性能、色谱柱充填的优劣等），使理论板数达到要求。
什么是高效液相色谱
High Performance Liquid Chromatography 高效液相色谱法，简称：HPLC
是利用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充 剂的色谱柱，按照固液相之间的分配机理对混合 物进行分离测定的色谱方法。 广泛应用于各个领域：
医药 / 环保 / 石化 / 生命科学 / 食品及农业…… 在技术，理论及应用上仍处于发展阶段
色谱柱/固定相： 填料类型C18（Kromasil，Diamonsil，Hypersil）； 粒径：5μm；内径：4.6mm； 长短：250mm、200mm、150mm。
流速：通常为1mL/min。 测定波长：检测波长通常选择其最大吸收波长，200～380nm（紫外区）。 柱温：常设值：25℃、 30℃、 40℃。 进样量：通常为10或20μL
分离度R 主要考察相邻色谱峰的分离效果， R应大于1.5 。
HPLC基本知识介绍
液相色谱基础HPLC基本知识介绍常见的分离方式❀蒸馏❀离心❀电泳❀过滤❀超滤✎色谱色谱法简介❀色谱法(Chromatography)溯源-Tswett应用吸附原理分离植物色素的新方法❀1906年正式命名(见诸文献)❀30年代开始广泛研究和应用❀高效液相色谱法的广泛应用始于70年代色谱分离的机理分离是一个物理的过程。
固定相(Stationary Phase)流动相(Mobile Phase)样品 (溶解于流动相中的溶质)什么是液相色谱？色谱液相色谱气相色谱柱色谱纸色谱薄层色谱高效液相色谱HPLC什么是高效液相色谱(HPLC)？❀HPLC (High Performance LiquidChromatography )—高效液相色谱法❀是一种区别于经典液相色谱,基于仪器方法的高效能分离手段:高性能色谱柱,高精度输液泵,高灵敏度检测器…❀广泛应用于各个领域:医药,环保,石化,生命科学,食品工业,农业…❀无论在技术上,理论上,还是在应用上仍处于发展阶段HPLC的仪器配置及流程色谱泵及控制器数据处理及控制进样器色谱柱检测器W a te rs486HPLC 的图形图形结果结果--色谱图(Chromatogram)色谱图:色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间 的曲线图,其纵坐标为信号强度,横坐标为保留时间.←色谱峰时间(分)基线↓峰高峰宽响应值液相色谱图相关术语(1)❀色谱图相关术语:组分通过检测器时产生✎色谱峰(Peak):色谱柱流出组分组分的响应信号的微分曲线✎峰底(Peak Base):峰的起点与终点之间连接的直线✎峰高(Peak Height):峰最大值到峰底的距离✎峰宽(Peak Width):在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离✎半(高)峰宽(Peak Width at Half Height):通过峰高的中点作平行于峰底的直线,其与峰两侧相交两点之间的距离液相色谱图相关术语(2)❀色谱图相关术语:✎峰面积(Peak Area):峰与峰底之间的面积,又称响应值✎标准偏差(σ)(Standard Error):0.607倍峰高处所对应峰宽的一半✎拖尾峰(Tailing Peak):后沿较前沿平缓的不对称峰✎前伸峰(Leading Peak):前沿较后沿平缓的不对称峰✎鬼峰(Ghost Peak):并非由试样所产生的峰,亦称假峰液相色谱图相关术语(3)❀色谱图相关术语:✎基线(Baseline):在正常操作条件下,仅由流动相所产生的响应信号的曲线✎基线飘移(Baseline Drift):基线随时间定向的缓慢变化✎基线噪声(N)(Baseline Noise):由各种因素所引起的基线波动✎谱带扩展(Band Broadening):由于纵向扩散,传质阻力等因素的影响,使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象液相色谱图相关术语(4)❀色谱图相关术语:)(Dead time):不被固定相滞留的组分,✎死时间(t从进样到出现峰最大值所需的时间)(Retention time):组分从进样到出✎保留时间(tR现峰最大值所需的时间)(Dead volume):不被固定相滞留的组分,✎死体积(V从进样到出现峰最大值所需的流动相体积)(Retention volume):组分从进样到✎保留体积(VR出现峰最大值所需的流动相体积液相色谱的应用（一）❀“分析型液相色谱”❀定性及定量分析✎灵敏度的要求✎样品的复杂性✎样品量的要求✎精度及准确度的要求✎容易使用液相色谱的应用（二）❀“制备型液相色谱”❀分离及纯化✎化合物的稳定性✎样品的复杂性✎制备量的要求✎纯度的要求，及纯度的鉴定✎方法的安全性开发液相色谱方法❀液相色谱实验所需的基本参数:✔流动相:种类及配比(等度或梯度)✔固定相:色谱柱类型及内径,长短✔流动相输送系统参数:流速✔检测器参数:检测波长,灵敏度等✔温度控制✔进样量以上参数即构成一个具体的HPLC方法,亦称色谱条件评价液相色谱方法的标准问题∶什么样的分离结果是好的?分辨率?什么是色谱的分辨率？分辨率的公式：)(211212W W V V R +−=影响分辨率的因素：K ’,α,N ❀分辨率的方程∶✎ k‘ 是容量因子，表达了被分离组分与柱填料 的作用强弱。
HPLC培训(峰与色谱条件) ppt课件
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除另有规定外，待测组分与相邻共存物之间的分离度 应大于1.5。
计算公式
或
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重复性
用于评价连续进样中，色谱系统响应值的重复性能。
采用外标法时，通常取各品种项下的对照品溶液，连 续进样5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标 准偏差应不大于2.0%。
相对标准偏差 RSD
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含量测定-内标法
按各品种项下的规定，精密称（量）取对照品和内标物质，分别配成 溶液，精密量取各适量，混合配成规定用的对照溶液。取一定量注入 仪器，记录色谱图。测量对照品和内标物质的峰面积或峰高，按下式 计算校正因子：
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二、基本概念和理论
1、高效液相色谱法的概念
高效液相色谱法（HPLC)是一种现代液相色谱法， 高效液相色谱法（HPLC)是一种现代液相色谱法，其基本 是一种现代液相色谱法 方法是用高压输液泵将流动相泵入到装有填充剂的色谱柱， 方法是用高压输液泵将流动相泵入到装有填充剂的色谱柱， 注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后， 注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入 检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图并进行数据处理， 检测器，用记录仪或数据处理装置记录色谱图并进行数据处理， 得到测定结果。 得到测定结果。 本法具有分离性能高、分析速度快的特点。 本法具有分离性能高、分析速度快的特点。
一、高效液相色谱的基本原理
3、高效液相色谱分离原理
（3）离子交换色谱法 常用缓冲液作为流动相。 固定相是离子交换树脂 ，常用缓冲液作为流动相。 分离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离 子及被测组分的离子进行可逆交换，根据各离子与离子交换 子及被测组分的离子进行可逆交换， 基团具有不同的电荷吸引力而分离。 基团具有不同的电荷吸引力而分离。 主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。 主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。
一、高效液相色谱的基本原理
3、高效液相色谱分离原理
（2）液液色谱法： 液液色谱法： 使用将特定的液态物质涂于担体表面， 使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担 体表面而形成的固定相， 体表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流 动相和固定相中溶解度不同而分离。 动相和固定相中溶解度不同而分离。分离过程是一个分配平 衡过程。 衡过程。 由于涂布式固定相很难避免固定液流失， 由于涂布式固定相很难避免固定液流失，现在已很少采 用。现在多采用的是化学键合固定相，如C18、C8、氨基柱、 现在多采用的是化学键合固定相， C18、C8、氨基柱、 氰基柱和苯基柱。 氰基柱和苯基柱。
二、基本概念和理论 1、高效液相色谱法的概念
最常用的检测器为紫外检测器 UV） 紫外检测器（ 检测器 最常用的检测器为紫外检测器（UV）。 其它的检测器有二极管阵列检测器（DAD）、荧光检测器、 ）、荧光检测器 其它的检测器有二极管阵列检测器（DAD）、荧光检测器、 电化学检测器、示差折光检测器、蒸发光散射检测器、质谱 电化学检测器、示差折光检测器、蒸发光散射检测器、 检测器等。 检测器等。 紫外检测器是一种选择性检测器， 紫外检测器是一种选择性检测器，其响应值不仅与待测 溶液的浓度有关（在一定范围内呈线性关系），还与化合物的 溶液的浓度有关（在一定范围内呈线性关系），还与化合物的 ）， 结构有关。 结构有关。 工作原理：Lambert－Beer定律，用于含量测定和杂质检查。 工作原理：Lambert－Beer定律，用于含量测定和杂质检查。 定律
一、高效液相色谱的基本原理
2、色谱法分类
高效液相色谱法按分离机制的不同分为： 高效液相色谱法按分离机制的不同分为： （1）液固吸附色谱法 ） （2）液液分配色谱法（正相与反相） ）液液分配色谱法（正相与反相） （3）离子交换色谱法 ） （4）离子对色谱法 ） （5）分子排阻色谱法。 ）分子排阻色谱法。
一、高效液相色谱的基本原理
3、高效液相色谱分离原理
（2）液液色谱法： 液液色谱法： 液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为： 液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为： 正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC) 正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC) (NPC)和反相色谱法
一、高效液相色谱的基本原理
1、液相色谱理论发展简况
色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett） 1906年研 色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研 究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因 究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因 (Chromatography) 之得名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、 之得名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色 谱法、液相色谱法。 谱法、液相色谱法。 分离原理是 溶于流动相(mobile phase)中的各组 色谱法的分离原理 色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组 分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用 分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用 （吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在 吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同， 固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。 固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。
1、高效液相色谱法的概念 2、相关术语 3、系统适用性试验 4、测定方法
三、高效液相图谱的基本解析
下半年工作计划
本课程目标
一、了解高效液相色谱的基本原理
主要工作完成情况 二、掌握相关的基本概念和理论
三、熟悉高效液相图谱的基本解析
一、高效液相色谱的基本原理
3、高效液相色谱分离原理
（1）液固色谱法： 液固色谱法： 使用固体吸附剂， 使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根 据固定相对组分吸附力大小不同而分离。 据固定相对组分吸附力大小不同而分离。分离过程是一个吸 附－解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒 解吸附的平衡过程。常用的吸附剂为硅胶或氧化铝， 度5～10μm。适用于分离分子量200～1000的组分，大多数用 10μm。适用于分离分子量200～1000的组分， 200 的组分 于非离子型化合物。常用于分离同分异构体。 于非离子型化合物。常用于分离同分异构体。
二、基本概念和理论
高效液相色谱仪： 高效液相色谱仪：
仪器应定期检定并符合有关规定
二、基本概念和理论 1、高效液相色谱法的概念
高效液相色谱仪由输液泵、进样器、色谱柱、检测器和 高效液相色谱仪由输液泵、进样器、色谱柱、检测器和 色谱数据处理系统组成。 色谱数据处理系统组成。 色谱柱 最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。 最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶 化学键合硅胶。 反相色谱系统使用非极性填充剂， 反相色谱系统使用非极性填充剂，以十八烷基硅烷键合硅胶 最为常见， 最为常见，辛基硅烷键合硅胶和其它类型的硅烷键合硅胶 （如苯基键合硅胶等）也有使用。 如苯基键合硅胶等）也有使用。 正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。 正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。
一、高效液相色谱的基本原理
2、色谱法分类
按两相的物理状态分： 两相的物理状态分 色谱法中，流动相可以是气体，也可以是液体， 色谱法中，流动相可以是气体，也可以是液体，由此可分为气 相色谱法（GC）和液相色谱法（LC）。固定相既可以是固体， 相色谱法（GC）和液相色谱法（LC）。固定相既可以是固体， ）。固定相既可以是固体 也可以是涂在固体上的液体，由此又可将气相色谱法和液相色 也可以是涂在固体上的液体， 谱法分为气-液色谱、 谱法分为气-液色谱、气-固色谱、液-固色谱、液-液色谱。 固色谱、 固色谱、 液色谱。 按分离原理分： 分离原理分 吸附色谱法(AC)、分配色谱法(DC)、离子交换色谱法(IEC)、 吸附色谱法(AC)、分配色谱法(DC)、离子交换色谱法(IEC)、 (AC) (DC) (IEC) 排阻色谱法(EC，又称分子筛) 、凝胶过滤(GFC)、凝胶渗透色 排阻色谱法(EC，又称分子筛 凝胶过滤(GFC)、 (EC (GFC) 谱法(GPC） 谱法(GPC）和亲和色谱法 。 (GPC
一、高效液相色谱的基本原理
3、高效液相色谱分离原理
正相色谱法与反相色谱法比较表： 正相色谱法与反相色谱法比较表： 正相色谱法 固定相极性 流动相极性 组分洗脱次序 高～中 低～中 极性小先洗出 反相色谱法 中～低 中～高 极性大先洗出
化验室检验知识培训
高效液相色谱基础知识
刘婷 扬子江药业股份公司化验室主管 E-mail:liut@ 2008年8月1日 年 月 日
高效液相色谱基础知识
一、高效液相色谱分类 3、高效液相色谱分离原理 主要工作完成情况
二、基本概念和理论
一、高效液相色谱的基本原理
3、高效液相色谱分离原理
（3）离子交换色谱法 常用缓冲液作为流动相。 固定相是离子交换树脂 ，常用缓冲液作为流动相。 分离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离 子及被测组分的离子进行可逆交换，根据各离子与离子交换 子及被测组分的离子进行可逆交换， 基团具有不同的电荷吸引力而分离。 基团具有不同的电荷吸引力而分离。 主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。 主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。
流动相极性＞固定相极性流动相极性＞固定相极性- 反相色谱 流动相极性＜固定相极性流动相极性＜固定相极性- 正相色谱
一、高效液相色谱的基本原理
3、高效液相色谱分离原理
（2）液液色谱法： 液液色谱法： 正相HPLC（ HPLC）： 正相HPLC（normal phase HPLC）： HPLC 是由极性固定相和非极性（或弱极性）流动相所组成的HPLC 是由极性固定相和非极性（或弱极性）流动相所组成的HPLC 体系。 体系。 其代表性的固定相是改性硅胶、氰基柱等。 其代表性的固定相是改性硅胶、氰基柱等。 代表性的流动相是正己烷。 代表性的流动相是正己烷。 极性小先洗出 ，常用于分离中等极性和极性较强的化合物 (如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。 如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。
一、高效液相色谱的基本原理
1、液相色谱理论发展简况
液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下 用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法. 用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法.高效液相色谱法 Chromatography，HPLC)是其的基础 (High performance Liquid Chromatography，HPLC)是其的基础 上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。 60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。 年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的 它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀， 它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具 有高柱效，分析速度快， 需用高压输送流动相， 有高柱效，分析速度快，因需用高压输送流动相，故又称高压液 相色谱法(High Chromatography，HPLC)。 相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。