活性氧检测试剂盒 Reactive oxygen species assay kit使用说明

活性氧检测试剂盒Reactive oxygen species assay kit使用说明

货号：CA1410

规格：100-500T

产品内容：

10mM DCFH-DA in DMSO0.1ml−20ºC保存

活性氧供体1ml−20ºC保存

说明书1份

产品简介：

活性氧(Reactive oxygen species,ROS)包括超氧自由基、过氧化氢、及其下游产物过氧化物和羟化物(O2•−,H2O2,•OH,ONOO−,•NO)等，参与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程。采用2,7-dichlorofluorescin diacetate(DCFH-DA)是迄今最常用、最灵敏的细胞内活性氧检探针。DCFH-DA没有荧光，进入细胞后被酯酶水解为dichlorofluorescin(DCFH)。在活性氧存在时DCFH被氧化为不能透过细胞膜的强绿色荧光物质dichlorofluorescein(DCF)，其荧光在激发波长502 nm，发射波长530nm附近有最大波峰，强度与细胞内活性氧水平成正比。此活性氧检测系统本底低，灵敏度高，重复性好，操作简便。

本试剂盒适于荧光显微镜、激光共聚焦显微镜等图像检测，荧光分光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪定量ROS检测。

工作波长：

最佳激发波长500、485(500±15nm)，最佳发射波长525(530±

20nm)。也可按照FITC荧光检测条件检测。

操作步骤：

一、试剂准备：

1.DCFH-DA可稀释于培养基或缓冲液中。血清或培养基颜色并不影响DCFH-DA及细胞内荧光产生，但可能会影响荧光显微镜观察，干扰荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪荧光测定。可将DCFH-DA稀释于无酚红培养基或适宜的缓冲液如PBS中。这依赖于使用何种荧光设备进行测定。

2.加入DCFH-DA的时机或孵育时间，以最终能顺利检测细胞内活性氧为目的。药物处理时间较短(<2小时)或预计ROS效应较弱，可先加或同时加入DCFH-DA。反之，treat刺激时间较长(>6小时)或预计产生ROS效应较强，可后加DCFH-DA。

3.活性氧供体含高纯度12mM H2O2。加入细胞后其本身即是一种活性氧，而且在代谢过程中可产生其它类型的活性氧，均可使DCFH-DA氧化为DCF呈现强绿色荧光。因而，用户可使用该试剂作为测试实验系统或仪器的阳性试剂，以初步观察细胞活性氧所产生的荧光的一般特征，并且也可以将该实际作为实验的一个阳性对照。推荐该试剂的细胞工作浓度为20~100µM 或更低浓度，但超过200µM将产生细胞毒。如果用户熟悉ROS荧光或实验没有必要采用阳性对照，可以不加该试剂。

二、加入荧光探针：

1.加入DCFH-DA于培养基，推荐初始工作浓度为10µM。对不同的细胞和处理，DCFH-DA工作浓度可为100nM~20µM，需进行预实验确定合适的浓度。总体稀释倍数应在1:500~1000以上以避免DMSO对细胞的影响。以DMSO作为溶剂对照。

2.37ºC孵育细胞30min~至几个小时，通常30-60min即可。孵育时间长短与细胞类型、刺激条件、DCFH-DA浓度有关。

3.PBS洗涤细胞2次。

三、荧光检测

采用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜图像检测照相，绿色荧光强度代表活性氧水平。也可进行微板荧光分析仪(multiwell fluorescence plate reader)实时或每10分钟分时逐点检测荧光强弱。对于流式细胞仪可将细胞用胰酶消化PBS洗涤后重悬检测。