荧光光度法测定硫酸奎宁含量

实验三荧光光度法测定硫酸奎尼丁含量

一、实验目的和要求：

1.荧光分光光度计的基本结构及操作方法；

2.荧光产生及测量的过程；

3.荧光分析法的定量分析方法（标准曲线法）；

4.影响荧光强度的因素。

二、实验原理：

奎尼丁是抗疟疾奎宁的右旋体，属于生物碱类抗心律失常药。主要用于阵发性心动过速、心房颤动、早搏；预防室房性心动过速及对房室结折返性心动过速；还何以预防有症状的室上性和室性早搏。奎宁丁的有效血药浓度是3~6mg/L，8mg/L以上可发生严重不良反应。

硫酸奎宁丁的分子式为C20H24O2N2﹒H2SO4﹒2H2O，分子量为728.96，分子结构式如图所示：

其结构分为喹啉环和喹啉碱两个部分根据其喹啉环结构部分具有产生荧光的特性，采用荧光光度计测量其荧光强度，可以实现硫酸奎宁丁含量的测定。

三、实验仪器与试剂：

1.F93型荧光光度计

2.硫酸奎宁丁标准储备液（100ug／ml）

3.硫酸溶液（0.050mol/L）

4.硫酸奎宁丁样品溶液

5.50ml容量瓶6个

6.5ml移液管2个

7.1cm石英荧光比色皿1个

四、实验步骤：

1．标准系列溶液及样品溶液配制

按照下表配制硫酸奎尼丁标准系列溶液及样品溶液

编号 1 2 3 4 5 6（硫酸奎尼丁样品溶液）100μg/ml硫酸奎尼丁标

准溶液

1.00ml

2.00ml

3.00ml

4.00ml

5.00ml 2.50ml

说明以上溶液均用移液管移取至50ml容量瓶中用0.050ml/L硫酸溶液稀释至刻度并摇匀

系列标准溶液浓度μ

g/ml

2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 ----

2．测定灵敏度的选择和荧光光谱的绘制

（1）用1cm 石英荧光比色皿，以5号溶液作为测定溶液，置于荧光光度计样品室中，盖上样品室舱盖，调节荧光光度计灵敏度，使其荧光强度读数在100左右，测定测定的灵敏度。

（2）荧光波长调节为380nm ，用1cm 石英荧光比色皿，以5号溶液作为测定溶液，置于荧 光光度计样品室中，盖上样品室舱盖，调节荧光光度计灵敏度，使其荧光强度读数在5以内，然后按照下表依次调节荧光波长，测定不同荧光波长下5号溶液的荧光强度；在坐标纸上以测定的荧光强度为纵坐标，荧光波长为横坐标制图，绘制荧光光谱，并从荧光光谱曲线上找出做最大荧光波长。

激发波长 365nm 荧光波长 380nm 390nm 400nm 410nm 420nm 430nm 440nm 450nm 460nm 荧光强度值 2.3 6.9 18.5 37.5 55.3 67.9 73.5 71.8 63.5 激发波长 365nm 荧光波长 470nm 480nm 500nm 510nm 520nm 530nm 540nm 550nm 560nm 荧光强度值

55.7

49.4

28.8

19.7

13.0

8.3

5.0

3.0

2.0

选择的最大荧光长为：λ2=440（nm ）

0.010.020.030.040.050.060.070.080.0380

400420440460480500520540560

荧光强度值（激发波长365n m ）

荧光波长（n m ）

荧光强度值

3．标准曲线制作

将激发波长，荧光波长分别调节为上面实验选择的365nm ，440nm ，荧光光度计灵敏度调节为上面实验选择的灵敏度档次，用1cm 石英荧光比色皿，按照下表依次测定标准系列溶液、样品溶液、0.050mol/L 硫酸溶液荧光强度，平行测定两次，计算荧光强度的平均值；在坐标纸上以荧光强度的平均值为纵坐标，系列标准溶液的浓度为横坐标制图，绘制标准曲线。

编号

1 2 3 4 5 6（样品） 7硫酸溶液 荧光强度F1

17.1

32.

47.3

60.6

73.6

18.1 0.3

10.0

20.0

30.040.050.060.070.080.00.00

2.00 4.00 6.008.0010.0012.00

荧光强度标准曲线

系列标准溶液浓度μg/ml

荧光强度F

五、实验数据处理：

1．样品溶液中的硫酸奎宁丁的含量

根据6号样品溶液荧光强度测定的平均值，在标准曲线上采用作图法求出其对应的浓度值，采用下式计算样品溶液中铁的含量：

50.200.50C C X ⨯

=读取值

C X =2.15×50.00/2.50=43.00μg/ml

六、注意事项：

1．测定系列标准溶液和样品溶液时，必须使用同一只比色皿。

2．比色皿放入荧光光度计样品室前，必须用吸水纸将表面擦拭干净。 3．比色皿在换装不同浓度溶液时，必须用待测溶液润洗至少三次。 4．在比色皿未放入荧光光度计测定光路时，必须将样品室舱盖打开。

样品6 2.15μg/ml

七、讨论与思考

1．实验过程中，有一调零步骤，其作用是什么？

答：调零是为了消除溶剂中离子发荧光而干扰实验结果。

2．如果不进行调零操作，对实验结果有无影响？为什么？

答：无影响。标准曲线不调零也可以读出样品溶液的浓度。

3．什么情况下，必须进行调零操作？

答：用比较法测定样品的浓度时必须要调零。

4．比较绘制的激发光谱和荧光光谱，二者有何特点？

答：激发光谱和荧光光谱都有吸收峰，但是大部分物质的激发光谱接近365nm，而不同物质的荧光光谱最高峰不同，这是定性的依据。