鼠类携带汉坦病毒的核酸检测及核酸序列分析

分 型试 验 （ Ｃ 。 应 组成 ： 应 总体 积５ ｗ ， Ｐ Ｒ） 反 反 ０ Ｌ
包 括 Ｄ Ａ Ｐ ｌｍ ｒ ｅ （ Ｕ ｗ ）２ Ｏ ， ０ＸＰ Ｒ Ｎ ｏ ｅａ ｙ ｓ １／ Ｌ ． ｐ Ｌ，１ Ｃ
图１ 汉坦病毒部分检测结果 （ 汉城型 Ｊ
（ ： Ｌ ０ ０ Ｍ ｒ ｒ１— 样 品 Ｐ Ｒ 产 物 ） Ｍ Ｄ ２ ０ ａｋ ； ６： ｅ Ｃ
１２ ４ 产物分 析 ．．
吸取Ｉ ｗ Ｏ Ｌ扩增 产 物 ， 入 到 １ 琼 脂 糖凝 胶 电 加 ％ 泳 加样 孔 中 ， 恒压 １０ ３ｍｉ ２ Ｖ，０ ｎ后将 胶置 于 凝胶 成像 系统 中观看 结果 并拍 照 。
具有高度的相似性 ， 相似度为９ ％ ～ ９ ， ７ ９ ％ 确认为汉
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金（ ０ ０Ｋ １ ） ２ １Ｉ２ ５
Ｃ Ｃ。Ｅ Ｃ Ｓ Ｏ型引 物 ：Ｅ Ｓ Ｏ—ＭＦＧ Ｇ Ａ Ｔ Ｔ Ｃ ． Ｔ Ｇ Ｃ Ｃ Ｔ Ｔ
Ｔ Ｔ Ａ 兀 １ ＇ Ｓ Ｏ — ＭＲ Ｔ ＧＣ Ｔ Ｔ Ｃ Ｃ ＡＴＩ Ｅ ． ＧＧ ＡＡ Ｃ ＧＧＧＧ ＧＧＴ 一
一
３ｌ一
口岸卫生控制
１ １３ 主要试 剂 ．．
和地区， 全球约１２ ／ 的人 口在其威胁之下 。 该病是 由
汉 坦病 毒 （ ａｔ ｉ ｓ Ｖ） Ｈ ｎ ｖ ｕ，Ｈ 引起 的， 黑线 姬 鼠 ａｒ 以 （ ｐｄｍ ｓａｒｒ ｓ 、 家 鼠 （ ａｕ ｏｖｇｅｓ 等 Ａ ｏｅ ｕ ｇａｕ ） 褐 ｉ Ｒ ｔ ｓｎｒｅｉ ） ｔ ｕ 鼠类宿主动物为主要传染源的 自然疫 源性疾病。 世 界流行性出血热疫情主要集 中在亚洲 ， 亚洲病例 主 要分布在中国及与中国东北三省毗邻的俄罗斯远东
岸地 区的暴发 流行 。
关键词 鼠 中 图分 类 号
汉坦病毒 核酸检测 核 酸序列分析 Ｒ ７ 文献 标识 码 Ｂ ｄ ｉ １ ．９ ９ ｊｉ ｎ １０ ５ ７ ． ０ ０ ． １ ３３ ｏ ０ ３ ６ ／．ｓ ． ０ ８— ７ ７ ２ １ ．６ ０ ０ ｓ １
１ 材料 与方 法
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本 研究 参考 相关 文献 ， 据 汉坦 病 毒 Ｍ基 因序 依
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Ｔｉ ｌ ｅｇｎ 购 自 Ｉｖｔｇｎ公 司 ；一 步法 Ｒ ｒｏ Ｒ ａｅｔ ｚ ｎｉｏｅ ｒ Ｔ Ｐ Ｒ试 剂 盒 、 Ｎ ｏ ｍ ｒｓ、 Ｃ Ｄ Ａ Ｐｌ ｅａｅ ４×ｄ Ｔ 、 Ｎ ｙ Ｎ Ｐ Ｄ Ａ分
子量标准 Ｄ２ ０ 、 Ｎ Ｉ００ Ｄ Ａ纯化试 剂盒、 Ｔ 、 ｇｌ Ｉ Ｇ Ｘ— ａ Ｐ 等试 剂购 自宝 生物 工程 （ 大连 ） 限公 司。 有
Ａ ＡＡＡＧＴ ＧＧＴ ＴＡ Ｔ ＹＴ ＡＣ Ｔ Ｇ ．ＨＴ — Ａ ＧＩ ＹＡ Ｃ Ｉ ＡＡ ＧＴ Ｇ Ｖ ＭＲＯ ＧＴ ＡＩ Ｃ Ｇ ＲＣ ＡＣ ＡＣ Ｃ Ｔ Ｔ ＣＩ
提供技术支持。
基金项 目： 质检行业公益项 目（ ０ ７ Ｙ ０ ３ 和 国家质 监总局科研基 ２ ０ Ｇ Ｊ２ ）
城型 汉坦病 毒 。
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１２５ 目的片断纯化、 ．． 克隆和核酸序列测定
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１００ 离心 １ ｍｎ弃 上 清 ， 入７％ 乙醇 ｌ Ｌ洗 涤 ， ２ ０ｇ ０ ｉ； 加 ５ ｍ ４Ｃ７０ｇ Ｌ ｉ； ￣ ５０ 离 ５ ｎ弃上清 ， ，ｍ 将沉淀 自然干燥 ， 加入适 量的 Ｄ Ｐ Ｅ Ｃ水溶解沉淀 ， 直接用于反转 录。 １２ ３ 反应 组成 及反应 条件 ．．
Ｍｘ２Ｏ Ｌ ２×Ｂ ｆｒ ５ ０ ， ｉ ．ｗ ， ｕｅ ． Ｌ ４×ｄ Ｔ ．ｗ ， ｆ ２ Ｎ Ｐ５Ｏ Ｌ 模 板 Ｒ Ａ２０ｘ 弓 物 Ｈ Ｖ—ＭＦ （０ Ｍ）２０ ， Ｎ ． １ Ｌ， ｌ Ｔ Ｏ ２ｗ ． Ｌ
弓 物 Ｈ Ｖ—Ｍ Ｏ （ ０ Ｍ） ． ｗ ，卒 充 Ｒ ａｅＦｅ ｆ Ｔ Ｒ ２ ２Ｏ Ｌ 卜 Ｎ ｓ ｒｅ
Ｂ ｆ ｒ ． Ｌ ４×ｄ Ｔ ． ｐ ，模 板２ ０ｘ ，弓 物 ｕ ｅ ５０ ， ｆ Ｎ Ｐ５ Ｏ ． Ｌ ．１ Ｌ Ｉ Ｓ Ｏ—Ｍ （ ０ Ｍ） ． ｗ ，弓 物 Ｓ Ｏ—ＭＲ （ ０ Ｍ） Ｅ Ｆ ２ ｗ ２Ｏ Ｌ Ｉ Ｅ ２ｗ
２ ２ 核酸 序列分 析结 果 ． 对 扩增 的特 异 性 核酸 片 段纯 化 、 隆并 进 行 核 克 酸序 列测定 （ ） 图２ 。 通过 Ｂ Ａ Ｔ与在 Ｇ ｎ ａｋ数 据 库 中 已 注册 的 ＬＳ ｅＢ ｎ 汉城 型汉 坦病 毒核酸 序列进 行 比较 。 析结 果表 明 ， 分 本次 采集 的褐家 鼠所 携 带 的汉坦 病 毒 ， 测 定 的 核 其 酸序 列与 Ｇ ｎ ａｋ数 据 库 中 已注 册 的对 应 核 酸 序 ｅＢ ｎ 列 （ Ｑ ３５ ５ Ｇ ５２２ 、 Ｆ０３７ Ａ １０ 等 ） Ｄ １３ ０ 、 Ｕ ９９９ Ｅ ２５７ 、 Ｆ９ １９ １
１ ２ 实验 方法 ．
列设计并合成特异性引物 ， 建立特异性核酸检测方
法 。 辽宁 口岸 地 区 鼠类 携 带 汉 坦 病 毒 的情 况 进 行 对 初 步调 查 ， 口岸地 区 肾综 合 征 出血 热 的 预 防控 制 为
１２ １ 引 物设计 ．．
参考文献报道 ， 根据汉坦病毒 Ｍ基因序列设计 并合 成 特异 性 引 物。 片段 外 引物 ： Ｔ Ｍ Ｈ ｖ—Ｍ Ｏ Ｆ
示 ，４ 待检样 品中 ， 有 ７ ｌ份 共 份样 品在 特 定 位置 出现 扩增条 带 ， 阴性对 照在 特 定 位 置 没有 出现 扩增 条 带 （ ） 推 断７ 样 品 中含 汉城 型汉坦病 毒 。 图１ 。 份
Ｒ Ｐ Ｒ 反应组成 ： Ｔ— Ｃ 。 总体积５ ， Ｏ Ｌ 包括 Ｅ ｚｍ ｎｙ ｅ
（ 。 ， 、州 １ｃ， ／／ ＾ ＼＾ ＾＼＾／＾ 吣／ ＼ ） ｗ＼ Ｉ ｖ＼ ｎｗ ｆ ／ ／Ｍ＾ ＾ ｎ ｖ） ｆ ／√√ ｖ ， 一 ｖ ０ ＼＼ ＾ ／＾＼ｆ ＾ ＾＾ ／／ 『 ＼ ＼ ＼ Ｍ ＾ ｖｋ ＼ Ｍ ， ＼ ＼ ／ ／ ＼『 ｆ ／ ＾＼
： … … ： … … 一： … … … … 一篇… … 一 ： … … 一 ： … … … … 品… … 三 ： ： 一： … … … … … … ： ；
ｄ ２Ｏ Ｌ使 总体积达 ＮＳ ｗ 。 应条 件 ：０Ｃ， Ｈ ０１．ｗ ， ０ Ｌ反 ５￣
３ ｍｉ ０ ｎ；９ Ｃ ，３ ｎ ， ４ Ｃ ， ０ ｓ ４ｏ ，３ ｓ ２ ， ４ｏ ｍｉ ９ ｏ ２ ，５ Ｃ ０ ，７ ℃
３ ｓ ， ０ ｃ ｃｅ ； ２ ，５ ｎ。 ０ ４ ｙ ｌｓ ７ ℃ ｍｉ
第 １卷 第６ ６ 期
口岸卫生控制
鼠 类 携 带 汉 坦病 毒 的核 酸 检 测 及核 酸序 列分 析
程 晓兰 孙 时 高玉峰 王 有 姜 陆 辽 宁 出入境检验检疫局（ 宁， 辽 大连 ，１０１ １６０）
周士博
大连 市第２ 中学（ ３ 辽宁， 大连 ， １０ １ １６０ ）
研 究 国境 口岸 地 区 鼠类 自然 携 带 汉 坦病 毒 （ ａｔ ｉ ｓ Ｖ） 况 ， 国境 口岸 地 区 Ｈ ｎ ｖ ｕ，Ｈ 状 ａｒ 为
在辽宁口岸捕获的１ 只 ４
褐 家鼠（ ａｕ ｏ ｅｉ ｓ 中， 中 只检测到汉城型汉坦病毒 。 列分析结果表 明， Ｇ ｎ ａｋ数 Ｒｔｓ ｒ ｇ ｕ） 其 ７ ｔ ｎｖ ｃ 序 与 ｅＢ ｎ 据库 中已注册的汉坦病毒核酸序列具有高度的相似性 （７ 一 ９ ） 结论 辽宁口岸褐家鼠中汉 ９％ ９％ 。 城型汉坦病毒的感染率较高。 应加强对口岸地 区鼠类的监测和控制， 防治肾综合征 出血热疫情在 口
摘 要 目的
鼠类防治及 肾综合征 出血热疫情控制提供基础数据。 方法 利用分子生物学技术 ， 通过对采集于 口岸 地 区的 鼠类样 品 的核 酸 （ Ｎ 提取 、 Ｒ Ａ） 逆转 录聚合 酶 链 反 应 （ Ｔ— Ｃ 、 Ｒ Ｐ Ｒ） 凝胶 电 泳分 析 以及 核
酸序列分析等过程 ， １岸地区鼠类携带汉坦病毒的状况进行确认 。 对： ２ 结果
Ｔ ＡＴ ＧＣ Ｇ。
第ｌ 卷 第６ ６ 期
将 目的 片断 切 下并 纯 化 ， 纯化 产 物 克隆 后进 行 核 酸序 列测定 。
２ 实 验结果
１ ２ ２ 核酸 （ Ｎ 提 取 ．． Ｒ Ａ） 以鼠肺 为检测 材料 ， 进行 核酸 提取 。
在生物安全柜 内 ， 取适量 鼠肺 ， 放入１５ Ｌ离心管 ．ｍ
２ １ 核 酸检 测结果 ．
内， 加入ｌ ＬＴ ｚ 试剂后研磨成匀浆， ｍ ｒｏ ｉｌ 室温放置５ｌ ； Ｉｎ ｌ ｉ 加脚 氯仿， 剧烈振荡１ｓ ， ５ｅ 室温放置３ ｉ， ℃ ｅ ｍｎ于４ １００ 离 １ ｉ； 心吸 出上 清 ， ２ ０ｇ ０ ５ ｎ小 ｍ 置于 另一１５ Ｌ离 ．ｍ 心管 中 ， 入 异 丙 醇 ５０ Ｌ 室 温 放 置 １ ｍｎ ４ 加 ０ｗ ， ０ ｉ ， ℃
地 区 、 鲜 半 岛和 日本等 地 。 朝 近年 来 ， 口岸 地 区 的大 规 模 开发 建 设 影 响 了 鼠
类 的栖息地 。 同时 ， 伴随着 国际贸易的快速发展 ， 鼠 类可随飞机 、 轮船等交通工具在国际 口岸之间扩散。 上述因素导致了国境 口岸地区肾综合征 出血热疫情 出现 了一些 新 的变化 ， 加强 监测 。 需
２Ｏ Ｌ 补充 ｄ Ｈ ０３ ． Ｌ 使 总体积达 到５ 。 ．ｗ ， ｄ ２ ２０ ， ０ Ｌ 反 应 条 件 ：４Ｃ， ｍｉ ； ４ ， ５ｓ ５ ｏ ２ ｓ ７ ｏ ９ ｏ ３ ｎ ９ ℃ １ ， ３Ｃ， ５ ， ０Ｃ，
２ ，３ ｙ ｌｓ；７ Ｃ ，５ｍｉ ５ｓ ８ ｃ ｃ ｅ ０￣ ｎ。
肾综 合 征 出 血 热 （ｈｍ ｒ ａｉ ｆｖｒｗｔ ｅａ ｅ ｏｒ ｇｃ ｅｅ ｉ ｒｎｌ ｈ ｈ ｓｎｒｍｅ，Ｈ Ｒ ） 源地遍 布五大 洲 的８ 多 个 国家 ｙｄｏ Ｆ Ｓ疫 ０
１ １ 实验 材料 ． １１ １ 样 品采集 ．． 于２ １￣４ 一５ ， ００ 月 月 采用 夹夜 法 、 鼠笼法从 辽宁 口岸 地 区采集 的褐 家 鼠。 取肺 脏样 品进行 核酸检 测 。 １ １２ 质 粒和 菌株 ．． ｐ １ ＴＶ ｃｏ 购 自宝生 物工 程 （ ＭＤ ８一 ｅｔ ｒ 大连 ） 限 有 公 司 ； 主菌 大肠杆 菌 Ｅ ｃｌＸ １一ｂｕ ， 宿 ．ｏｉ Ｌ ｌｅ 本实 验 室 保存。
本 次 野外 采 集 ， 采用 鼠笼法 和 夹 夜法 从 辽 宁 口 岸 地 区共采集 鼠类 １只 ， ４ 经鉴定 均为褐 家 鼠 ， 全部 解
剖后取 鼠肺放置于 一 ０ ８ ℃超低温冰柜保存 ， 分批次 进 行核 酸检测 。 核 酸扩 增 产 物经 琼脂 糖 凝 胶 电泳 检测 。 果 显 结