双波长分光光度计双波长分光光度计的优点
紫外可见分光光度法题库(填空题)
紫外可见分光光度法题库（填空题）1. 在分光光度计中，常因波长范围不同而选用不同的检测器，下面两种检测器，各适用的光区为：(1)光电倍增管用于 __紫外可见光区___ (2) 热电偶用于 ___红外光区___________2. 在分光光度计中，常因波长范围不同而选用不同材料的容器,现有下面三种材料的容器，各适用的光区为：(1)石英比色皿用于 _____紫外光区______ (2) 玻璃比色皿用于 ___可见光区________(3) 氯化钠窗片吸收池用于 ___红外光区________3. 在分光光度计中，常因波长范围不同而选用不同的光源，下面三种光源，各适用的光区为：(1) 钨灯用于 ___可见光区________(2) 氢灯用于 ___紫外光区________(3) 能斯特灯用于_红外光区__________4. 可见-紫外、原子吸收、红外的定量分析吸收光谱法都可应用一个相同的 ___朗柏比尔____定律。
其数学表达式为 ___ A = kcb或I t= I010-εbc_________ 。
5. 朗伯－比尔定律成立的主要前提条件是采用_平行单色光，均匀非散色介质_ 。
当入射辐射不符合条件时，可引起对比尔定律的___负_____ 偏离，此时工作曲线向 __浓度___ 轴弯曲。
6. 紫外-可见分光光度测定的合理吸光范围应为 __200～800nm _____________ 。
这是因为在该区间 __浓度测量的相对误差为最小_____ 。
7. 如图设 a、b 的浓度分别为c a和c b，在入射光波长为λ2时的摩尔吸收系数分别为ε2(a)和ε2(b)，则在使用 2.0 cm 的比色皿时，在λ2测得的总吸光度为 ___ 2ε2a⋅c a+ 2ε2b⋅c b________ 。
8. 紫外-可见光分光光度计所用的光源是 ___氢灯_______ 和 ____钨灯_______ 两种.9. 紫外-可见光谱法主要应用有:(1) ___一些无机、有机物的定性分析；___________________________________(2)____单组分及混合物的定量分析；___________________________________(3)______ 化合物结构的测定；_________________________________(4)______ 配合物化学计量比的确定；_________________________________(5)____ 化学平衡的研究___________________________________10. 双波长分光光度法的主要优点是:(1)___能克服光谱重叠干扰_______________________(2)____ 消除吸收池的误差______________________(3)____ 消除共存物吸收背景影响______________________(4)_____ 能直接进行混合物的测定_____________________11. 双光束分光光度计是将光源发出的光束分成___分成两路_______________, 分别进入____参比池__________________________和______试样池_____________________.12. 形成λ1和λ2两个单色光. 双波长方法的分析原理是基于_两个单色器；吸光度差值与待测浓度呈比例。
分光光度计的种类
分光光度计的种类分光光度计是一种用于测量各种液体、气体、固体等物质的光吸收度的科学仪器。
通过不同波长的光以及样品对光的不同吸收，分光光度计能够分析出样品中所含的化学物质浓度、反应动力学等信息。
在生化、医学、环境等领域，分光光度计是不可或缺的工具之一。
本文将介绍分光光度计的种类及其特点。
一、单波段分光光度计单波段分光光度计指的是在一定的波长范围内进行测量的光度计。
这种光度计的原理是：当样品中的化合物吸收入射光时，光强减弱，根据比例关系，可以推算出物质的浓度。
例如，在DNA分子的260nm波长处测量吸光度，可以用来测定DNA浓度。
单波段分光光度计测量精度高，而且便于使用，但对于多个化合物的混合物无能为力，对于样品的预处理和纯化也有严格的要求。
二、双波长分光光度计双波长分光光度计则是指在两个不同波长下进行测量的光度计，从而减小了背景干扰及样品浓度变化等因素的影响。
这种光度计通常是具有408nm和550nm两种波长的双信道光度计。
双波长分光光度计能够同时测量两种化合物的吸光度，适用于多成分混合物的测量，测量精度相对于单波段分光光度计有所提高。
三、分光比色计分光比色计是指在两个不同波长下，比较样品与标准溶液的吸光度差异，同时进行测量的光度计。
这种技术可以测量非色谱性物质，如蛋白质和其他生化大分子的浓度，其测量精度非常高。
分光比色计的优点是不受背景的影响，例如色素、脂肪和杂质等。
四、荧光分光光度计荧光分光光度计是一种测量荧光的强度和特征的分光光度计。
荧光分光光度计可以用来定量测量样品中含有的荧光物质，如荧光染料、 DNA、 RNA、蛋白质等。
荧光分光光度计的测量原理是样品吸收紫外线，激发荧光物质分子，当分子从高能态退回到激发态时，会辐射出一定波长的光谱，被荧光探测器记录下来。
荧光分光光度计具有高的灵敏度和选择性，广泛应用于医学、环境科学、材料科学等领域。
综上所述，不同应用领域中需要不同的光度计种类。
在进行测量前应根据需要选用适当的光度计。
双波长分光实验报告
一、实验目的1. 了解双波长分光光度法的基本原理和操作步骤。
2. 掌握双波长分光光度法测定溶液浓度的方法。
3. 熟悉实验仪器的使用和操作。
二、实验原理双波长分光光度法是一种基于物质对特定波长光吸收特性的分析方法。
其原理是在单位时间内，有两条不同波长的光束交替照射待测溶液，通过检测器测出两个波长下溶液的吸光度，并计算吸光度差值，从而确定待测物质的浓度。
该方法的优点是：1. 克服了单波长法易受溶液混浊和背景吸收等干扰的缺点。
2. 提高了测定结果的精密度和准确度。
三、实验仪器与试剂1. 实验仪器：双波长分光光度计、比色皿、移液管、吸管、烧杯、蒸馏水、待测溶液等。
2. 实验试剂：待测溶液（已知浓度）、标准溶液（已知浓度）、参比溶液、试剂等。
四、实验步骤1. 将待测溶液、标准溶液和参比溶液分别倒入比色皿中。
2. 将比色皿放入双波长分光光度计中，设定测量波长和参比波长。
3. 打开仪器，预热10分钟。
4. 分别测定待测溶液、标准溶液和参比溶液在测量波长和参比波长下的吸光度。
5. 计算吸光度差值（ΔA = A测 - A参）。
6. 以标准溶液的浓度为横坐标，吸光度差值为纵坐标，绘制标准曲线。
7. 根据待测溶液的吸光度差值，从标准曲线上查得待测溶液的浓度。
五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制：根据实验数据，绘制标准曲线，如图所示。
2. 待测溶液浓度测定：根据待测溶液的吸光度差值，从标准曲线上查得待测溶液的浓度为0.05 mg/L。
六、实验讨论1. 实验过程中，应注意保持仪器和比色皿的清洁，避免污染。
2. 实验数据应准确记录，减少误差。
3. 标准曲线绘制时应尽量使标准溶液的浓度范围与待测溶液的浓度相近，以提高测定结果的准确度。
4. 双波长分光光度法在实际应用中，应注意选择合适的测量波长和参比波长，以克服干扰因素的影响。
七、实验总结本实验通过双波长分光光度法测定了待测溶液的浓度，结果表明该方法具有操作简便、准确度高、抗干扰能力强等优点。
双波长分光光度计特点
发射光谱法 按作用结果不同分 原子光谱→线状光谱
分子光谱→带状光谱
9
(2) 非光谱法 • 利用物质与电磁辐射的相互作用,测定电磁
辐射的反射、折射、干涉、衍射和偏振等 基本性质变化的分析方法 分类：折射法、旋光法、比浊法、χ射线衍 射法
10
(3) 光谱法与非光谱法的区别 光谱法：内部能级发生变化 (波长改变) 原子吸收/发射光谱法:原子外层电子能级跃迁 分子吸收/发射光谱法:分子外层电子能级跃迁 非光谱法：内部能级不发生变化仅测定电磁辐射 性质改变(波长不变)
e 表示物质的浓度为1mol/L,液层厚度为1cm时溶液
的吸光度。单位： (L•mol-1 •cm-1)
23
1）εmax越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法 测定该物质的灵敏度越高。 ε>105：超高灵敏； ε=(6～10）×104 ：高灵敏； ε<2×104 ：不灵敏。
2）ε在数值上等于浓度为1mol/L、液层厚度为1cm 时该溶液在某一波长下的吸光度。
1m=10-6m, 1nm=10-9m, 1Å=10-10m ν－频率，单位：赫兹（周）Hz 次/秒 n－折射率，真空中为1
3
2. 微粒性 光量子，具有能量。
h－普朗克(Planck)常数 6.626×10-34J·s
－频率
E－光量子具有的能量 单位：J(焦耳)，eV(电子伏特)
4
3. 波粒二象性 E h c h n
11
10.2 吸光光度法的基本原理
吸光光度法是基于被测物质的分子对光具有 选择性吸收的特性而建立起来的分析方法。又 称分光光度法，属于分子吸收光谱分析方法,基 于外层电子跃迁
12
一、 特点 灵敏度高：测定下限可达10－5～10－6 mol/L, 准确度能够满足微量组分的测定要求： 相对误差2～5％ （1～2％） 操作简便快速 应用广泛
紫外可见分光光度法题库(填空题)
紫外可见分光光度法题库（填空题）1. 在分光光度计中，常因波长范围不同而选用不同的检测器，下面两种检测器，各适用的光区为：(1)光电倍增管用于 __紫外可见光区___ (2) 热电偶用于 ___红外光区___________2. 在分光光度计中，常因波长范围不同而选用不同材料的容器,现有下面三种材料的容器，各适用的光区为：(1)石英比色皿用于 _____紫外光区______ (2) 玻璃比色皿用于 ___可见光区________(3) 氯化钠窗片吸收池用于 ___红外光区________3. 在分光光度计中，常因波长范围不同而选用不同的光源，下面三种光源，各适用的光区为：(1) 钨灯用于 ___可见光区________(2) 氢灯用于 ___紫外光区________(3) 能斯特灯用于_红外光区__________4. 可见-紫外、原子吸收、红外的定量分析吸收光谱法都可应用一个相同的 ___朗柏比尔____定律。
其数学表达式为 ___ A = kcb或I t= I010-εbc_________ 。
5. 朗伯－比尔定律成立的主要前提条件是采用_平行单色光，均匀非散色介质_ 。
当入射辐射不符合条件时，可引起对比尔定律的___负_____ 偏离，此时工作曲线向 __浓度___ 轴弯曲。
6. 紫外-可见分光光度测定的合理吸光范围应为 __200～800nm _____________ 。
这是因为在该区间 __浓度测量的相对误差为最小_____ 。
7. 如图设 a、b 的浓度分别为c a和c b，在入射光波长为λ2时的摩尔吸收系数分别为ε2(a)和ε2(b)，则在使用 2.0 cm 的比色皿时，在λ2测得的总吸光度为 ___ 2ε2a⋅c a+ 2ε2b⋅c b________ 。
8. 紫外-可见光分光光度计所用的光源是 ___氢灯_______ 和 ____钨灯_______ 两种.9. 紫外-可见光谱法主要应用有:(1) ___一些无机、有机物的定性分析；___________________________________(2)____单组分及混合物的定量分析；___________________________________(3)______ 化合物结构的测定；_________________________________(4)______ 配合物化学计量比的确定；_________________________________(5)____ 化学平衡的研究___________________________________10. 双波长分光光度法的主要优点是:(1)___能克服光谱重叠干扰_______________________(2)____ 消除吸收池的误差______________________(3)____ 消除共存物吸收背景影响______________________(4)_____ 能直接进行混合物的测定_____________________11. 双光束分光光度计是将光源发出的光束分成___分成两路_______________, 分别进入____参比池__________________________和______试样池_____________________.12. 形成λ1和λ2两个单色光. 双波长方法的分析原理是基于_两个单色器；吸光度差值与待测浓度呈比例。
双波长
指 导 老 师 ：孙杰 研究生姓名：郑许光
2015年6月10日
提纲
一、双波长分光光度法的概述
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
二、双波长分光光度法的原理
三、双波长分光光度法的特点
四、双波长法的应用
一、双波长分光光度法的概述
紫外----可见分光光度法是当 前用途最广泛、应用最普遍的 仪器分析方法之一。自1829 年伯格提出，数年后由郎伯发 表“伯格---郎伯定律”，以及 1852年比耳提出“比耳定律” 后，为吸光度法奠定了理论基 础。分光光度法不仅用于溶液 中有色成分的定量分析而且可 在紫外光区对许多有机化合物 作定量和定性分析，此外还可 以作络合物（络合比）测定， 及有关物理化学常数的测定。
谢谢! 请老师批评指正!
可采用作图法选择符合上述两个条件的波长组合。
三、双波长分光光度法的特点
可进行浑浊试样的分析。 通过适当的波长组合，可进行双组合或三组合混合物的同 时测定。 当波长相差1~2nm时，使双波长同时扫描，可记录一阶导 数光谱。 采用一波长固定，另一波长扫描，记录吸收光谱。可消除 浑浊背景的影响。 采用双笔记录器，可记录溶液中发生的两种现象。 从原理上讲，单波长法和双波长法的不同之处是:双波长 用二个单色器，得到二个不同波长的单色光，测量的是两个 波长处的吸光度差，使用一个吸收池，取消了参比池。
二、双波长分光光度法的原理
1、双波长分光光度计光路示意图
2、双波长工作原理示意图
3、双波长分光光度法的分析 3.1 根据朗伯—比尔定律：A=εbc
3.2 测量波长λ2和参比波长λ1的选择与组合 以两组分x和y的双波长法测定为例： 设：x为待测组分，y为干扰组分，二者的 吸光度差分别为ΔAx和ΔAy，则该体系的总 吸光度差ΔAx+y为： ΔAx+y=ΔAx+ΔAy
现代分析测试技术复习题答案篇
现代分析测试技术复习题答案篇⼀、问答题：1、试述塔板理论的基本关系式及理论要点。
2、利⽤范⽒⽅程说明HPLC中如何选择实验条件？①采⽤粒径⼩⽽均匀的球形固定相,⾸选化学键合相,⽤匀浆法装柱.②采⽤低黏度流动相,低流量(1mL/min),⾸选甲醇.③采⽤柱温箱,避免室温波动,增加实验重复性,柱温以25～30℃为宜.3、⾼效液相⾊谱仪包括哪些主要部件？各部件的作⽤是什么？⾼效液相⾊谱仪由五⼤部分组成：⾼压输液系统，进样系统、分离系统、检测系统和⾊谱⼯作站。
由于⾼效液相⾊谱所⽤固定相颗粒极细，因此对流动相阻⼒很⼤，为使流动相较快流动，必须配备有⾼压输液系统。
⾼压输液系统由储液罐、过滤器、⾼压输液泵、梯度洗脱装置等组成。
流动相在进⼊⾼压泵之前，应先进⾏过滤和脱⽓处理。
⾼压输液泵是核⼼部件，其密封性好，输出流量恒定，压⼒平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等。
进样系统是将被分离的样品导⼊⾊谱柱的装置。
要求密封性、重复性好，死体积⼩，便于实现⾃动化。
进样系统包括取样、进样两个功能。
分离系统主要是指⾊谱柱，⾊谱柱是⾼效液相⾊谱仪的核⼼部件，要求分离度要⾼、柱容量⼤、分析速度快。
检测器是HPLC仪的三⼤关键部件之⼀。
⽤来连续监测经⾊谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置。
其作⽤是把洗脱液中组分的量转变为电信号。
并由⼯作站（或记录仪）绘出谱图来进⾏定性、定量分析。
⾊谱⼯作站是⾊谱仪的⾃动化控制包括⾃动进样系统的进样⽅式、输液泵系统中的溶剂流速、梯度洗脱程序、检测系统的各项参数、数据记录和处理等。
4、什么是锐线光源？为什么空⼼阴极灯发射线是锐线？答：锐线光源是能发射出谱线半宽度远⼩于吸收线半宽度的光源。
锐线光源发射线半宽度很⼩，并且发射线与吸收线中⼼频率⼀致。
锐线光源需要满⾜的条件：a.光源的发射线与吸收线的ν0⼀致。
b.发射线的Δν1/2⼩于吸收线的Δν1/2。
空⼼阴极灯是⼀个封闭的⽓体放电管。
⽤被测元素纯⾦属或合⾦制成圆柱形空⼼阴极，⽤钨或钛、锆做成阳极。
双波长分光光度计双波长分光光度计的优点
三、透光率和吸光度
I0
It
透射光的强度It与入射光的强度I0的比值称为透光率
T It I0
透光率愈大，溶液对光的吸收愈少
透光率的负对数称为吸光度A(absorbance)
A lgT lg I0 It
由于玻璃可吸收紫外光，所以玻璃棱镜只能用 于350 ~ 3200 nm的波长范围，即只能用于可见 光域内。
石英棱镜可使用的波长范围较宽，可从185 ~ 4000nm，即可用于紫外、可见和近红外三 个 光域。
白光
入射 狭缝
准直 透镜
λ1
棱镜
聚焦 透镜
λ
2 出射 狭缝
800 600 500
400
横坐标作图，所得曲线即为该溶液的吸收光谱 。
A
max
480
520
560nm
吸收光谱中与吸收峰相对应的波长称为最大 吸收波长， max
吸收光谱说明，一种物质对不同波长光的吸收 程度不同。
如图，是三（邻二氮菲） 合铁配合物的吸收光谱。表明 一种物质的不同浓度的溶液， 吸收光谱的形状基本相同，最 大吸收波长也一样。
光学分析法
——基于物质发射的电磁辐射或物质与辐 射相互作用后产生的辐射信号或发生信号变化 来测定物质的性质、含量和结构的一类仪器分 析方法。
主要过程
能源提供能量 能量与被测物质相互作用
产生被检测讯号
电磁辐射和电磁波谱
电磁辐射（电磁波/光）
——以巨大速度通过空间不需要任何物质 作为传播媒介的光（量）子流 电磁辐射的性质：波、粒二向性
原子发射光谱、原子吸收光谱、原子荧光光谱
双波长分光光度法
双波长分光光度法建立在Lambert—beer定律基础上的单波长分光光度分析技术，应用极为广泛，但由于单波长法存在混浊试样对光的散射和比色杯背景吸收等难以克服的缺点，它在高精度测量中的应用受到一定的限制。
为了解决浑浊试样对分光光度测定的干扰问题，美国的B.Chance于1951年制成了用振动镜使两束不同波长的单色光交替通过待测溶液的双波长分光光度计（Double Wavelength Spectrophotometer）,从而奠定了双波长分光光度法的基础。
随着科学技术的发展，双波长分光光度分析技术已日臻完善，与先进的后分光技术相结合，在生化自动化分析中得到了广泛的应用并显示出了光明的发展前景。
1 双波长分光光度法的原理双波长分光光度法是在传统分光光度法的基础上发展起来的，它的理论基础是差吸光度和等吸收波长。
它与传统分光光度法的不同之处，在于它采用了两个不同的波长即测量波长（又叫主波长λp,Primary Wavelength）和参比波长（又叫次波长λs, SecondWavelength）同时测定一个样品溶液[1,2]，以克服单波长测定的缺点，提高了测定结果的精密度和准确度。
早期的双波长分光光度计在测定时，两束不同波长的单色光经斩光器（Chopper，一种用于双波长分光光度计中使光束按一定周期反射，遮断或通过的装置）处理后，以一定的时间间隔交替照射[1]比色杯，经待测溶液吸收后，再照到光电管上，产生两个不同的吸光度，再将这两个吸光度相减，就得到了差吸光度ΔA。
根据Lamber—Beer定律, 得：Aλp=ελpLC+Ap (1)A λs=ελsLC+As (2)式中Aλp 、 A λs—分别为待测溶液在主波长和次波长处的吸光度，ελp 、ελs—分别为待测溶液在主波长和次波长处的摩尔吸光系数L—光径C—待测溶液的浓度Ap 、As—分别为待测溶液在主波长和次波长处的散射或背景吸收当λp 、λs相差不太大时，由同一待测溶液产生的光散射吸光度和背景吸光度大致相等，即Ap＝A s，将（1）式－（2）式得：Aλp－A λs＝ΔA＝（ελp－ελs）LC （3）对于同一待测溶液来说，ελp－ελs是一常数K，在光径L不变的情况下，（3）式可简化为：ΔA＝KC （4）（4）式说明，待测溶液在λp与λs两个波长处测定的差吸光度ΔA与试样中待测物质的浓度C成正比。
双光束分光光度计波长
双光束分光光度计波长
【原创实用版】
目录
1.双光束分光光度计概述
2.双光束分光光度计的工作原理
3.双光束分光光度计的应用
4.双光束分光光度计的优缺点
正文
一、概述
双光束分光光度计是一种利用分光光度法进行测量的仪器。
它通过将待测物质分解成不同波长的光线，并测量其吸光值，从而实现对物质的定量或定性分析。
双光束分光光度计在化学、生物、医学等领域有着广泛的应用。
二、工作原理
双光束分光光度计主要由光源、单色器、检测器、信号处理器和控制单元组成。
其中，单色器由棱镜或反射镜组成，可以将光源发出的光线分解成不同波长的光线；检测器用于测量每个波长的吸光值；信号处理器将测量得到的吸光值进行处理，最终得到待测物质的浓度或纯度。
三、应用
1.化学分析：双光束分光光度计可以用于各种化学物质的定量或定性分析，如金属离子、有机化合物等。
2.生物医学：双光束分光光度计可以用于生物大分子如蛋白质、DNA 和RNA的定量分析。
3.临床诊断：双光束分光光度计可以用于各种疾病的诊断，如癌症、
肝炎等。
4.环境监测：双光束分光光度计可以用于水体和空气的污染物检测，如重金属、有机物等。
四、优缺点
1.优点：双光束分光光度计具有高精度、高灵敏度和高选择性等优点，可以实现对微量或痕量物质的测量。
2.缺点：双光束分光光度计价格较高，维护成本也较高。
双波长和三波长分光光度法
一. 基本原理
A lc
dA cl d d d
d n A cl d n
dn
dn
从上式可以看出各阶导数始终和试液浓度C呈直线关系，这是 导数分光光度定量分析的基础。
a: 吸收光谱; b-d: 一至四阶导数光谱
描述导数曲线的方程式可由朗伯-比尔耳定律推出。
式（1）中I0，I分别为入射光强度和透射光强度，为摩尔吸光系 数，为吸收池厚度，C为待测组分浓度。假定入射光强度在整个 波段范围内保持定值，对式（1）作一次微分处理得到一阶导数 方程，
光器使两单色光以一定的时间间隔交替通过同一吸收池，并被
光电倍增管交替接收，测得吸光度差A。当光强度为Io的两
单色光λ1和 λ2交替通过同一吸收池时，根据比耳定律，对λ1
波长：
A 1
lg
IO I 11
1bc As1
双波长分光光度计光路示意图
1. 光源，2、3 . 两个单色器，4 . 斩光器，5 . 样品池，6 . 光电倍增管。
在实际工作中，三波长法中的波长选择和计算比单波长法麻烦而费时，但 测定的准确度、精密度比解联立方程组分析混合组分的方法高。随着计算机 技术的普及，用电子计算机控制的分光光度计的广泛应用，已设计出三波长 法的专用计算程序，岛津UV-240、UV-260型双光束紫外-可见分光光度计就 是具有这种功能的仪器。可对样品溶液中待测组分的三波长自动 测定并进行结果计算，操作简便快速。
S K2 A2 K1 A1
式中，K2和K1分别为在λ2和 λ1处的放大系数；组分A和B 在λ2和 λ1处的吸光度分别为
AA 2
、AB2
和AA1、AB1，则
S＝K
2
AA2＋K
2
AB2－K1
双波长分光光度法在医学检验上的应用
双波长分光光度法在医学检验上的应用1 双波长分光光度法基本原理双波长分光光度法是一种常用的分析方法，它主要利用分光光度计测量不同波长下样品吸收光的强度，并通过计算得出样品中目标物质的浓度。
在该方法中，通常会选取两个不同的波长进行测量，其中一个波长被称为参比波长，另一个波长被称为分析波长。
当样品中存在目标物质时，它会吸收分析波长下的光线，导致分析波长下的光强降低；而参比波长下的光线则不会被目标物质吸收或吸收非常少。
因此，在双波长分光光度法中，将分析波长下的光强值与参比波长下的光强值进行比较，即可得到目标物质的吸光度。
通过校准和标准曲线拟合，可以得到样品中目标物质的浓度。
2 双波长分光光度法在医学检验中的应用双波长分光光度法在医学检验中具有广泛的应用。
下面介绍几个常见的医学检验项目及其应用：2.1 血红蛋白测定血红蛋白是红细胞中的重要成分之一，它与氧气结合形成氧合血红蛋白，将氧气输送至组织中。
血红蛋白测定是诊断贫血、肝脾肿大等疾病的重要检验项目之一。
双波长分光光度法可以利用血红蛋白的吸收特性进行测定。
在该方法中，常选取541nm和578nm两个波长进行测量，从而得到血红蛋白的浓度。
2.2 尿酸测定尿酸是嘌呤代谢产物的重要成分，其浓度与痛风等疾病密切相关。
双波长分光光度法可以测定尿液中尿酸的含量。
在该方法中，常选取293nm和320nm两个波长进行测量，从而得到尿酸的浓度。
2.3 肌酸激酶测定肌酸激酶（CK）是肌肉组织中重要的酶类物质，它在肌肉损伤后释放至血液中。
肌酸激酶测定可用于判断心肌梗死、肌萎缩等疾病。
双波长分光光度法可以利用CK的吸收特性进行测定。
在该方法中，常选取340nm和390nm两个波长进行测量，从而得到CK的浓度。
3 双波长分光光度法的优点与传统单波长分光光度法相比，双波长分光光度法具有以下优点：1. 双波长分光光度法可以有效避免样品的浓度、pH值等参数的影响，提高测定的准确性和精度。
双波长法测定混合物
双波长法测定混合物
双波长法是一种常用的光谱分析方法，用于测定混合物中不同成分的含量。
该方法利用物质在不同波长下的吸光特性来进行定量分析。
在测定混合物时，可以利用双波长法来区分和测定混合物中不同成分的浓度。
首先，双波长法利用混合物中各成分在不同波长下的吸光特性来进行测定。
通过选择适当的波长，可以使得混合物中的各成分在不同波长下具有不同的吸光度，从而可以利用这种差异来进行定量分析。
其次，双波长法通常需要使用双波长分光光度计或者双波长分光光度计来进行测定。
这些仪器可以同时测量样品在两个不同波长下的吸光度，并利用吸光度的差异来计算混合物中各成分的含量。
双波长法的优点之一是可以减小测量误差。
通过在两个不同波长下进行测量，可以减小由于样品浓度、溶剂影响等因素引起的误差，提高测定的准确性。
另外，双波长法还可以用于测定混合物中多个成分的含量，因
为可以通过选择不同的波长来测定不同成分的吸光度，从而实现对多个成分的同时测定。
总的来说，双波长法是一种常用的光谱分析方法，可以用于测定混合物中不同成分的含量。
通过选择适当的波长和使用合适的仪器，可以实现对混合物中各成分含量的准确测定。
紫外可见分光光度计测定双组分样品的含量实验思考题及答案
紫外可见分光光度计测定双组分样品的含量实验思考
题及答案
1、紫外可见分光光度计从光路分类有哪几类？各有何特点？
答：（1）单光束分光光度计：构造简单，操作方便，维修容易，合用于惯例剖析。
（2）双光束分光光度计：能自动记录吸收光谱曲线，自动除去光源强度变化所惹起的误差。
（3）双波长分光光度计：能提高方法的敏捷度和选择性，能获得导数光谱。
可用于多组分混淆物、浑浊试样剖析，以及存在背景扰乱或共存组分吸收扰乱的情况下的剖析。
（4）二极管阵列分光光度计：可全部波长同时检测，可获得时间、光强度和波长三维谱。
2、简述紫外可见分光光度计的主要零件、种类及基本性能。
答：（1）紫外可见分光光度计的基本构造是由五个部分组成：即光源、单色器、吸收池、检测器和信号指示系统。
光源：常用的光源有热辐射光源随和体放电光源两类。
热辐射光源用于可见光区，如钨丝灯和卤钨灯；气体放电光源用于紫外光区，如氢灯和氘灯。
（2）单色器：单色器一般由入射狭缝、准光器（透镜或凹面反射镜使入射光成平行光）、色散元件、聚焦元件和出射狭缝等几部分组成。
其核心部分是色散元件，起分光的作用，主要有棱镜和光栅。
（3）吸收池：一般有石英和玻璃材料两种。
石英池合用于可见光区及紫外光区，玻璃吸收池只能用于可见光区。
（4）检测器：常用的检测器有光电池、光电管和光电倍增管等。
（5）信号指示系统：常用的信号指示装置有直读检流计、电位调节指零装置以及数字显示或自动记录装置等。
分光光度计的种类
分光光度计的种类
1.双波长分光光度计：双波长分光光度计是最常见的分光光度计类型
之一，其主要特点是可以同时测量两个不同波长的光的吸光度。
这种光度
计常用于测量两种有关联的物质的含量，例如测量其中一种物质在一些固
定波长下的浓度，同时检测其它物质在不同波长下的吸收情况。
2.单波长分光光度计：单波长分光光度计是一种较为简单的光度计类型，它只能在一个固定波长下测量吸光度。
这种类型的光度计适用于需要
快速测量一些特定化合物浓度的情况。
3.可见光分光光度计：可见光分光光度计适用于在可见光范围内进行
吸光度测量。
它通常由可见光照射源、光栅、光谱器和检测器等部分组成，可以被用于分析可见光吸收、反射和透过样品的情况。
4.紫外-可见分光光度计：紫外-可见分光光度计是一种可以同时测量
紫外光和可见光的光度计。
它在分析化学、生物化学、环境科学等领域中
被广泛应用，可以用于测量有机和无机化合物的质量、浓度等性质。
5.荧光分光光度计：荧光分光光度计是一种可以测量荧光强度和荧光
光谱的仪器。
它在荧光检测、药物研究、生物学研究等领域中得到广泛应用。
6.傅里叶变换红外光谱仪（FTIR）：FTIR是一种可以测量物质吸收
红外光谱的光度计。
它在有机化学、高分子材料、制药等行业中被广泛使用。
除了以上常见的分光光度计类型，还有一些特殊用途的光度计，如石
英荧光分光光度计、旋光光度计等。
这些分光光度计类型在各自的应用领
域中有特殊的功能和优点。
双波长分光光度法的基本原理及应用(精)
双波长分光光度法的基本原理及应用应用分光光度法对共存组分进行不分离定量测定时,通常采用的方法有双波长法,三波长法,导数光谱法、差谱分析法及多组分分析法等方法,其快速,简便的优点使这些方法在实用分析中得到越来越广泛的应用。
其中以双波长法的应用为最多,该法的准确度和精密度要高于其它方法,是对共存组分不分离定量测定的有效方法之一。
实用中的双波长法主要采用等吸收波长法和系数倍增法两种分析方法,下面就其基本原理和应用作以介绍:一、等吸收波长法1、基本原理图 1是同一组分三个不同浓度供试液的吸收光谱图,经典分光光度法的定量测定通常是在被测组分的最大吸收波长处进行测定,根据兰伯一比耳定律,其吸光度值与被测组分的浓度 C 成正比,即:依(3式测定被测组分 a ,则可完全消除 b 组分的干扰,达到共存组分不分离进行定量测定的目的。
2、影响因素(1测定波长和组合波长的选择应使被测组分的△A 值尽可能大,以增加测定的灵敏度和精确度。
(2测定波长和组合波长应尽可能选择在光谱曲线斜率变化较小的波长处,以减小波长变化对测定结果的影响。
(3干扰组分等吸收波长(组合波长的选择必须精确,只有其△A 值等于零时才能完全消除干扰,否则会引入测定误差。
为此,在实用分析中,都是先配制一个干扰组分b 的供试液,在仪器上准确找出等吸收波长 ,然后再对样品进行测定。
3 应用实例等吸收波长法的一个典型应用实例为收载于《中华人民共和国药典》中的抗菌消炎药复方磺胺甲噁唑片的含量测定。
复方磺胺甲噁唑片中含有磺胺甲噁唑(SMZ 和甲氧苄(TMP 两个成分,其吸收光谱见图 3。
当测定 SMZ 时,选择其最大吸收波长 257nm 为测定波长,可以在干扰组分 TMP 的光谱曲线上 304nm 附近找到等吸收波长为组合波长消除其干扰;当测定 TMP 时,选择 239nm 为测定波长,可以在干扰组分 SMZ 的光谱曲线上 295nm 附近找到等吸收波长为组合波长消除其干扰,分别对 SMZ 和 TMP 进行含量测定。
分光光度计的使用原理、
2 单色器 单色器的主要组成:入射狭缝,出射狭 缝,色散元件和准直镜等部分. 单色器质量的优劣,主要决定于 色散元件的质量.色散元件常用棱镜 棱镜 和光栅. 和光栅
3 吸收池 吸收池又称比色皿或比色杯,按材 料可分为玻璃吸收池和石英吸收池,前 者不能用于紫外区. 吸收池的种类很多,其光径可在 0.1~10cm之间,其中以1cm光径吸收池 最为常用.
3.试剂参比 如果显色剂或其它试剂在 试剂参比 测定波长有吸收,按显色反应相同的条件, 不加入试样,同样加入试剂和溶剂作为参 比溶液. 4. 平行操作参比 用不含被测组分的试 样,在相同的条件下与被测试样同时进 行处理,由此得到平行操作参比溶液.
紫外紫外-可见分光光度法的特点: 1 与其它光谱分析方法相比,其仪器设备和 仪器设备和 操作都比较简单,费用少,分析速度快; 操作都比较简单,费用少,分析速度快 2 灵敏度高 灵敏度高; 3 选择性好 选择性好; 4 精密度和准确度较高 精密度和准确度较高; 5 用途广泛 用途广泛.
§1. 紫外-可见吸收光谱 紫外1. 物质对光的选择性吸收 选择性的,利用 物质对光的吸收是选择性 光 选择性 被测物质对某波长的光的吸收来了解物 质的特性,这就是光谱法的基础 光谱法的基础. 光谱法的基础
饱合有机化合物的电子跃迁类型为σ→σ*, 饱合有机化合物 n→σ* 跃迁,吸收峰一般出现在真空紫外区, 吸收峰低于200nm,实际应用价值不大. 不饱合机化合物的电子跃迁类型为n→π*, 不饱合机化合物 π→π* 跃迁,吸收峰一般大于200nm.
生色团:是指分子中可以吸收光子而产生电 子跃迁的原子基团.人们通常将能吸收紫外, 可见光的原子团或结构系统定义为生色团. 见表3-1和3-2. 助色团:是指带有非键电子对的基团,如OH,-OR,-NHR,-SH,-Cl,-Br,-I等, 它们本身不能吸收大于200nm的光,但是当 它们与生色团相连时,会使生色团的吸收峰 向长波方向移动,并且增加其吸收强度.见 表3-4.
双波长分光光度计特点
双波长分光光度计特点
哇塞，咱今天来聊聊双波长分光光度计的那些超厉害的特点哈！你知道吗，这玩意儿就像是一个超级敏锐的侦探！比如说，它能同时测量两个波长。
就好比你在找东西的时候，一只眼睛看这边，一只眼睛看那边，效率那叫一个高呀！
它的测量精度那也是杠杠的！打个比方，就像是射箭，每次都能精准地射中靶心。
你想想，如果要检测一些复杂的混合物，它就能精确地告诉你每种成分的含量，多牛啊！
而且呀，双波长分光光度计的稳定性可好啦！就如同一个可靠的老朋友，不管啥时候找它，都能稳稳地给你提供准确的数据。
不会今天好明天坏的，让人心里没底。
操作起来也不难哟！不是那种让人摸不着头脑的复杂玩意儿。
就好像骑自行车，一旦你学会了，就会觉得特别简单顺畅。
“嘿，那它是不是特别贵呀？”有人可能会这么问。
哎呀，你想想它能给你带来的价值呀，这点投入算啥呢！而且现在科技这么发达，价格也越来越亲民啦！所以说呀，双波长分光光度计真是个不可多得的好宝贝！它能帮
我们在各种领域，比如化学、生物、医学等，发挥巨大的作用呢！不拥有它，那不就亏大了嘛！
我的观点就是，双波长分光光度计凭借它的这些特点，真的是在科学检测领域有着不可或缺的重要地位呀！绝对值得我们好好去了解和利用。
双波长分光光度计特点
3. 系数倍率法
调节信号放大器，使干扰组分 b 在波长 2 和 1 处 的信号相等，由此得系数倍率K，
K1 A K K2 A K 2A
b λ2 a λ2
b λ2 b λ1 b λ1 a λ1
K 1A
S K 2 A K 1A
可求出cb。
因此，差示信号S 只与 ca 有关，从而求出 ca。同样
3 3
四阶 图 各阶导数光谱图
d 2 A / d2 —
d A / d —
4 4
三、平衡常数测定
弱酸离解常数的测定
设有一元弱酸HB，其离解反应如下：
a 2 b 2 a 1 b 1 a b
然后相减
由于b组份在两波长 处的吸光度相等，
A ＝A
b 2
b 1 a 2 a 1 a 2 a 1
A A A ( )bc
3. 系数倍率法
情况同等吸收双波长测量法。但其中一 干扰组份 b 在测量波长范围内无吸收峰 时，或者说没有等吸收点时可采用该法。
光源 单色器 参比池 检测器
样品池
二、紫外可见光度计仪器
2.单波长双光束分光光度计
调制马达
光源 单色器
参比吸收池
检测器
样品吸收池
单波长双光束分光光度计光路示意图
二、紫外可见光度计仪器
2.单波长双光束分光光度计
经单色器分光后经反射镜分解为强度相等的 两束光，一束通过参比池，一束通过样品池。 光度计能自动比较两束光的强度，此比值即 为试样的透射比，经对数变换将它转换成吸 光度并作为波长的函数记录下来。 I0 I0 AR lg AS lg IR IS
在2和1处分别测量吸光度 A
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完全吸收
光谱示意 复合光 表观现象示意
完全透过 吸收黄色光
溶液的颜色：是由于它选择性地吸收了一 部分光，而呈现它的互补色。
例如：三(邻二氮菲)合铁配合物溶液吸收了 508 nm处的光，而呈现紫红色。
二、吸收光谱
将某物质的溶液，用不同波长的单色光作入射光，
测定这一溶液吸光度A。每种波长的单色光都有其相 对应的吸光度。然后以A为纵坐标，波长为
电磁波 波长范围 跃迁类型
紫外-可见光 200-760nm 电子能级跃迁
光谱类型
紫外-可见吸收光谱
红外光
2.5~50 μm 分子振动能级跃迁 红外吸收光谱
远红外
50~500μm 分子转动能级跃迁 远红外吸收光谱
按能量转换方向分
吸收光谱法 发射光谱法
原子光谱→线状光谱
按被作用物质不同分
分子光谱→带状光谱
紫外-可见光谱的产生
紫外-可见吸收光谱：分子中价电子能级跃迁。 波长范围：200-760nm (1)紫外光区: 200-400nm (2)可见光区:400-760nm
可用于结构鉴定和定量分析。 电子跃迁的同时，伴随着振动转动能级的跃迁; 带状光谱。
一、物质对光具有选择吸收性
单色光: 单一波长的光束 复合光: 含有多种波长的光束
1852年，Beer从实验中找到了A与溶液浓度的关
横坐标作图，所得曲线即为该溶液的吸收光谱 。
A
max
480
520
560nm
吸收光谱中与吸收峰相对应的波长称为最大 吸收波长， max
吸收光谱说明，一种物质对不同波长光的吸收 程度不同。
如图，是三（邻二氮菲） 合铁配合物的吸收光谱。表明 一种物质的不同浓度的溶液， 吸收光谱的形状基本相同，最 大吸收波长也一样。
不同的物质，其内部结构不同，基态和激发 态的能量差ΔE不同，选择吸收光子的能量也不同， 即吸收的波长（频率）亦不同。亦即不同物质只 能选择性地吸收某一波长的光。
2.光的发射
能
第三激发态E3
量
E
第二激发态E2
第一激发态E1
吸收 发射 基态E0 光谱 光谱
三、原子光谱与分子光谱 1．原子光谱
, , E
电磁波谱: 以波长大小顺序排列的电磁波谱图
波长 10pm 300pm 200nm 400nm 800nm 500mm 1cm 1m
光谱 射线 X射线 紫外光 可见光 红外光 微波 无线电波
方法 光谱法
分光光度法 光谱法
核磁共振
380nm
可见光
780nm
电磁波谱：电磁辐射按波长顺序排列
中的这些粒子就会发生能级跃迁，从较低能量状态（基态） 跃迁到较高能量状态（激发态）：这一过程称为物质对光 的吸收。
能
第三激发态E3
量
E
第二激发态E2
第一激发态E1
吸收 发射 基态E0 光谱 光谱
物质对光的吸收：
E = hυ
由于分子、原子或离子的能级是量子化的， 不连续的，只有光子的能量(hυ)与被照射物质粒 子的基态和激发态能量之差(ΔE)相等时，才能被 吸收。
小结
要求掌握的内容
1.物质对光的吸收条件（2个） 2.光的波粒二象性、波参数的含义及能量与波长的 关系 3.分子光谱的种类
第四章 紫外-可见分光光度法
第一节 基本原理
分光光度法的定义
基于被测物质的分子对光具有选择吸收的特性 而建立的分析方法。
根据测定时所选用的光源
可见分光光度法 紫外分光光度法 红外分光光度法
γ射线→ X 射线→紫外光→可见光→红外光→微波→无线电波
：小
大
：大
小
γ射线→无线电波都是电磁辐射，光是电磁辐射的一 部分，性质完全相同 区别仅在于波长或频率不同，即光子具有的能量不同
二、光与物质的相互作用
1．光的吸收 被物质所吸收的光辐射能必须满足的条件：
当一束光照射到某物质或某溶液时，该物质的分子、 原子或离子与光子作用，光子的能量发生转移，物质
光学分析法
——基于物质发射的电磁辐射或物质与辐 射相互作用后产生的辐射信号或发生信号变化 来测定物质的性质、含量和结构的一类仪器分 析方法。
主要过程
能源提供能量 能量与被测物质相互作用
产生被检测讯号
电磁辐射和电磁波谱
电磁辐射（电磁波/光）
——以巨大速度通过空间不需要任何物质 作为传播媒介的光（量）子流 电磁辐射的性质：波、粒二向性
紫 400
蓝 420
绿蓝 450
红 660
蓝绿 500
橙 600
黄 560
绿 530
光的互补：若两种不同颜色的单色光按一定的 强度比例混合得到白光，那么就称这两种单色光为 互补色的光。
颜色 紫 蓝 绿蓝 蓝绿 绿 黄绿 黄 橙 红
互补光 黄绿 黄 橙 红 红紫 紫 蓝 绿蓝 蓝绿
物质的颜色与光的关系
吸光度愈大，溶液对光的吸收愈多
四、光吸收的基本定律 Lambert - Beer 定律
（一）定律
溶液对光的吸收除与溶液本性有关外，还与 入射光波长、溶液浓度、液层厚度及温度等因素 有关。
1760年，Lambert从实验中找到了A与液层厚度
的关系式：
A = k1l
当入射光波长、溶剂和吸光物质种类、浓度和溶液的 温度都一定时，该溶液的吸光度只与液层厚度成正比
吸收光谱体现了物质的特性： 吸收曲线的形状和max 是定性分析的基础 溶液的浓度愈大吸光度愈大 是定量分析的基础
三、透光率和吸光度
I0
It
透射光的强度It与入射光的强度I0的比值称为透光率
T It I0
透光率愈大，溶液对光的吸收愈少
透光率的负对数称为吸光度A(absorbance)
A lgT lg I0 It
原子发射光谱、原子吸收光谱、原子荧光光谱
2．分子光谱
分子吸收光谱、分子发射光谱
在分子中存在着电子的运动，以及组成分子的各原子 间的振动和分子作为整体的转动。分子的总能量可以认为 等于这三种运动能量之和。即：
E分子= E电子+ E振动+ E转动
若用△E电子，△E振动以及△E转动表示各能级差，则： △E电子＞△E振动＞△E转动
一、光的基本性质 1.波动性
波参数：周期T;频率υ;波长λ;波数σ;波速v
c ， 1
2.光的粒子性
光是以电磁波形式传播的光子流。电磁波能量大 小与波长和频率有关。
辐射是量子化的，即不连续地、一份一份地发射 或吸收，每一份称一个光子。
光子的能量与辐射频率成正比、与波长成反比：
E h h c