渗透压冲击法提取大肠杆菌周质蛋白
利用渗透休克法提取大肠杆菌周质蛋白的机制
利用渗透休克法提取大肠杆菌周质蛋白的机制一、引言大肠杆菌是常见的肠道细菌,其周质蛋白在生物学研究中具有重要作用。
然而,提取大肠杆菌周质蛋白是一项困难而复杂的任务。
渗透休克法是一种有效的提取大肠杆菌周质蛋白的方法,本文将详细介绍该方法的机制。
二、渗透休克法概述1. 渗透休克法简介渗透休克法是一种用于提取细胞外蛋白质的方法。
该方法通过改变环境渗透压和离子浓度来破坏细胞壁和膜,使蛋白质从细胞内部释放出来。
2. 渗透休克法原理渗透休克法主要基于以下两个原理:(1)离子浓度变化原理:当外部离子浓度高于内部时,会导致水分子从内向外扩散,使细胞壁和膜破裂。
(2)渗透压变化原理:当外部溶液浓度高于内部时,会导致水分子从内向外扩散,使细胞壁和膜破裂。
3. 渗透休克法步骤渗透休克法主要分为以下几个步骤:(1)培养大肠杆菌至对数生长期。
(2)离心收集细胞,去除培养基。
(3)用低盐缓冲液洗涤细胞,去除表面上的杂质。
(4)将细胞悬浮于高盐缓冲液中,在室温下静置一段时间,使蛋白质从细胞内部释放出来。
(5)离心收集上清液,即为提取的周质蛋白。
三、利用渗透休克法提取大肠杆菌周质蛋白的机制1. 大肠杆菌周质蛋白结构大肠杆菌周质蛋白是一种位于外膜和细胞壁之间的结构蛋白。
其主要成分是β-折叠结构和α-螺旋结构。
由于其结构复杂,因此难以直接提取。
2. 渗透休克法提取机制渗透休克法可以通过以下几个方面来提取大肠杆菌周质蛋白:(1)高盐浓度:高盐缓冲液中的离子浓度高于细胞内部,会导致水分子从细胞内向外扩散,使细胞壁和膜破裂,从而释放出周质蛋白。
(2)渗透压变化:高盐缓冲液中的渗透压高于细胞内部,也会导致水分子从细胞内向外扩散,使细胞壁和膜破裂。
(3)蛋白质结构:大肠杆菌周质蛋白的β-折叠结构和α-螺旋结构在高盐缓冲液中容易发生变性,从而释放出来。
3. 渗透休克法提取大肠杆菌周质蛋白的优点渗透休克法具有以下几个优点:(1)简单易行:该方法操作简单、快速、易行。
蔗糖浓度对渗透休克法提取细胞周质重组蛋白的影响
蔗糖浓度对渗透休克法提取细胞周质重组蛋白的影响郭建华【摘要】[目的]研究不同蔗糖浓度的高渗液对渗透休克法(Osmotic Shock)提取细胞周质蛋白的影响.[方法]将已经构建好的含FbpA基因的表达质粒转化到EC感受态细胞中,分别在20%、30%、40%和50%的蔗糖高渗液条件下用Osmotic Shock纯化蛋白,SDS-PAGE电泳检测蛋白.[结果]30%和40%的蔗糖高渗液能得到浓度更高的重组蛋白,而用20%和50%的蔗糖高渗液提取蛋白产量较低.[结论]30%和40%的蔗糖高渗液能提高Osmotic Shock法提取细胞周质重组蛋白产量.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2017(045)004【总页数】2页(P147-148)【关键词】蔗糖;渗透休克;细胞周质;重组蛋白【作者】郭建华【作者单位】西南大学荣昌校区动物医学系,重庆402460【正文语种】中文【中图分类】S188+.2由于大肠杆菌遗传背景清楚,操作简单,便于进行大规模培养等,因此常用于表达基因工程的重组蛋白,其在医药、农业等行业的应用非常广泛,但目标重组蛋白的提取、纯化往往耗时费力,产量低且成本高昂,有时需要用到专业、昂贵的仪器和设备,如细胞破碎仪、亲和层析柱等,或者需要用到昂贵的试剂,如Nickel等,其操作繁琐,蛋白产量也受影响[1]。
细胞周质(Periplasm)是位于革兰氏阴性细菌内膜和外膜之间的结构,其氧化环境有利于蛋白的折叠,所以其蛋白纯化也比较简单。
研究表明,用渗透休克法(Osmotic Shock)可以比较简单地提取位于细胞周质中的蛋白。
Osmotic Shock纯化蛋白的原理是首先利用高浓度蔗糖溶液造成高渗透压让细胞收缩,然后用低浓度的硫酸镁处理细胞,可以诱导在细胞周质的蛋白释放,其成本低廉,操作简单快速,为基因工程中蛋白纯化提供了一条新思路。
文献多报道所使用的蔗糖浓度是20%,但不是所有的蛋白在20%的蔗糖浓度下都可以得到高质量的重组蛋白。
大肠杆菌周质蛋白提取工艺的研究
1 7 . r s e t ey t i dc td t a h s me o s t e g o n o e i ls c p oen e t c in f m c l % 8 e p c i l.I n iae t t i v h t d i h o d o e fr p rpa mi r ti xr t r h a o o E oi . Ke wo d :P rpa mi r ti s E t ci n E c e ih a c l y rs e i ls c p o en ; xr t ; s h r i oi a o c
重组蛋白在大肠杆菌分泌表达的研究进展
天津药学TianjinPharmacy2009年第21卷第4期综述重组蛋白在大肠杆菌分泌表达的研究进展’郑海洲,刘晓志,宋欣(华北制药集团新药研究开发有限责任公司,石家庄050015)摘要长期以来,大肠杆菌是表达外源蛋白的首选表达系统,重组蛋白分泌表达与胞内表达相比有很大优越性,在细胞周质腔不仅能促进重组蛋白二硫键的形成及正确折叠,还能促进分泌蛋白的N一端加工。
本文综述了近年来在大肠杆菌中表达可溶性外源蛋白的进展,目的是为了提高外源蛋白的生物活性。
关键词大肠杆菌,分泌表达,重组蛋白中图分类号:Q591.2文献标识码:A文章编号:1006-5687(2009)04-0040-03AdvanceinthesecretoryexpressionofrecombinantproteininescherichiacoilZhengHaizhou,“uXiaozhi,S0ngXin(NCPCNewDrugResearchandDevelopmentCo.,Ltd,Shijiazhuang050015)ABSTRACTEscherichiacoliisoneofthemostwidelyusedhostsfortheproductionofrecombinantproteins.Productionof8ecre—toryproteinsinescherichiacoliprovidesseveraladvantagesoverexpressioninthecytoplasm.Periplasmprovidestheoxidativeen—vironmenttofacilitatecorrectdisulfidebondingandproteinfolding.ItalsoallowscorrectprocessingofN—terminalaminoacidduringsecretion.ThisreviewdiscussesrecentadvancesinsecretoryandextracellularproductionofrecombinantproteinsSOastoimprovethebiologicalactivityofthehetemlogousproteins.KEYWORDSescherichiacoli,secretoryexpression,recombinantprotein大肠杆菌具有遗传背景清楚、繁殖快、成本低、表达量高、表达产物容易纯化等优点,是基因表达技术中发展最早和目前应用最广泛的是经典表达系统…。
化学-渗透压法温和破碎处理下大肠杆菌细胞胞内蛋白质的释放率
本试验拟研究将化学法与渗透压法联用( 本研究均简称为化 学- 渗透压法) , 从而实现既高效彻底破坏 E .c o l i 细胞壁, 又 完全释放胞内蛋白质, 同时能保留蛋白质生物活性的可能性。 本研究为该 法 处 理 E .c o l i B L 2 1 ( D E 3 ) 、 重组原动蛋白 2 β ( P K 2 ) 工程菌的试验结果。 β 1 ㊀材料与方法 1 . 1 ㊀材料 E .c o l i B L 2 1 ( D E 3 ) 为笔 者 所在 研究室 保存, 重组质粒 p E T- 2 8- P K 2 按常规方法转化获 β为笔者所在研究室构建, 9 ] 。 得相应重组工程菌 [
一种大肠杆菌细胞周质蛋白的提取方法
一种大肠杆菌细胞周质蛋白的提取方法大肠杆菌是一种常见的细菌,它在生物学和生物工程领域中被广泛应用。
大肠杆菌细胞周质蛋白是一类重要的蛋白质,它在细菌的细胞结构和代谢过程中扮演着重要角色。
提取大肠杆菌细胞周质蛋白对于研究细菌生长、代谢和相关疾病具有重要意义。
本文将介绍一种用于提取大肠杆菌细胞周质蛋白的方法,并探讨其在研究和应用中的意义。
1. 方法介绍我们需要了解大肠杆菌细胞周质蛋白的特性和结构。
细胞周质蛋白通常位于细菌细胞壁周围,起到维护细胞形状和保护细胞内部免受外界环境的影响。
提取细胞周质蛋白需要一定的技术和方法支持。
在实际操作中,一种常用的提取方法是利用生物化学技术和分离纯化技术相结合。
细胞周质蛋白需要从大肠杆菌的细胞壁中分离出来,这需要利用酶解和化学方法来破坏细胞壁,释放出蛋白质。
随后,通过差速离心、过滤和层析等技术,可以将细胞周质蛋白从其他细胞组分中分离出来,得到纯净的蛋白质样品。
2. 意义和应用提取大肠杆菌细胞周质蛋白的方法在生物工程和医学研究中具有重要应用价值。
利用这些提取的蛋白质样品,可以对细菌的结构和功能进行深入研究,有助于揭示细菌生长和代谢的机制。
另细菌细胞周质蛋白还可以作为药物靶点或疫苗候选物,用于研究和开发抗菌药物或疫苗。
3. 个人观点和理解作为一种重要的蛋白质组分,大肠杆菌细胞周质蛋白的研究和应用具有重要意义。
通过掌握提取方法,可以更好地理解细菌的生物学特性和生理功能。
在未来的研究和应用中,提取方法的改进和创新将为深入探索细菌的奥秘和开发新型药物提供重要支持。
总结和回顾通过本文对一种提取大肠杆菌细胞周质蛋白的方法的介绍,我们对这一重要的生物学研究课题有了基本的了解。
提取方法的掌握对于研究和应用都具有重要的意义,希望未来能够有更多科研人员投入到这一领域,为生物学和医学研究做出更大的贡献。
在本文中,我们深入探讨了提取大肠杆菌细胞周质蛋白的方法及其意义,希望能够为读者提供有益的知识和启发。
利用渗透休克法提取大肠杆菌周质蛋白的机制
利用渗透休克法提取大肠杆菌周质蛋白的机制1. 引言大肠杆菌(Escherichia coli)是一种常见的革兰氏阴性杆菌,存在于许多生物体的肠道中。
大肠杆菌周质蛋白是一类与菌体外环境密切相关的蛋白质,研究其机制对于深入了解大肠杆菌的生物学特性和与宿主的相互作用具有重要意义。
渗透休克法是一种常用的蛋白提取方法,通过利用渗透压的变化来破坏细胞膜,释放出细胞内蛋白质。
本文将探讨利用渗透休克法提取大肠杆菌周质蛋白的机制。
2. 渗透休克法的基本原理渗透休克法是一种通过改变细胞周围环境的渗透压来破坏细胞膜而释放细胞内物质的方法。
其基本原理如下:1.建立高渗透环境:通过向培养基中添加高浓度的溶质(如聚乙二醇),增加培养基的渗透压,使得培养基的渗透压高于细胞内的渗透压。
2.细胞膜破裂:高渗透环境下,细胞外溶质浓度高于细胞内溶质浓度,导致水分子从细胞内向细胞外流动,细胞内的渗透压降低。
由于渗透压差,细胞膜受到张力的作用,最终破裂,使得细胞内的物质释放出来。
3.蛋白提取:细胞膜破裂后,细胞内的蛋白质会释放到培养基中,可以通过离心等方式将其分离出来,从而实现蛋白质的提取。
3. 渗透休克法提取大肠杆菌周质蛋白的步骤利用渗透休克法提取大肠杆菌周质蛋白可以按照以下步骤进行:3.1 培养大肠杆菌在培养基中培养大肠杆菌,可以选择适合大肠杆菌生长的培养基(如Luria-Bertani(LB)培养基)。
确保菌体生长到适当的密度,一般为光密度值(OD600)在0.6左右。
3.2 采集菌体用无菌工具(如无菌吸管)或离心机采集大肠杆菌的菌体。
将菌体转移到无菌离心管中。
3.3 制备高渗透培养基准备含有高浓度溶质(如聚乙二醇)的培养基,增加培养基的渗透压。
确保高渗透培养基的渗透压高于大肠杆菌的细胞内渗透压。
3.4 渗透休克处理将采集到的大肠杆菌菌体转移到高渗透培养基中,使细胞受到高渗透环境的刺激。
可以通过搅拌、振荡等方式加强渗透作用。
处理时间一般为几分钟至数十分钟。
大肠杆菌周质蛋白提取
大肠杆菌周质蛋白(periplasmic protein)的提取通常需要进行细胞破裂、膜蛋白去除等步骤。
以下是一种常用的大肠杆菌周质蛋白提取方法的基本步骤:
1. 培养大肠杆菌:
-选择含有目标周质蛋白基因的大肠杆菌菌株进行培养,培养基中可以添加相应的抗生素以保证目标基因的表达。
2. 细胞培养:
-将含有目标基因的大肠杆菌菌株接种到含有适当抗生素的培养基中,进行静态或搅拌培养,直至菌液培养达到一定的浓度。
3. 细胞收获:
-在培养达到一定浓度后,通过离心等方法将大肠杆菌细胞沉淀下来。
4. 细胞破裂:
-使用适当的方法对大肠杆菌细胞进行破裂,如超声波破碎、高压破碎等,使细胞内部的周质区与细胞壁分离。
5. 周质蛋白提取:
-通过离心等方法将周质蛋白与细胞壁、细胞内的其他成分分离。
可以使用不同的离心速度和时间来分离不同密度的细胞组分。
6. 蛋白纯化:
-对提取的周质蛋白进行纯化,可以利用离子交换层析、亲和层析等方法进行蛋白纯化。
7. 蛋白质鉴定:
-对提取和纯化的蛋白进行质谱分析或其他鉴定方法,确认目标蛋白的纯度和结构。
需要注意的是,提取大肠杆菌周质蛋白的方法可能会根据具体实验的要求和周质蛋白的性质有所不同,上述步骤仅为一般参考,具体操作时需根据实验要求进行调整。
同时,在操作过程中要注意细菌培养条件、蛋白提取的温度、pH值等因素,以确保蛋白的活性和稳定性。
渗透压冲击法提取大肠杆菌周质蛋白
渗透压冲击法提取大肠杆菌周质蛋白许多生物产物特别是蛋白质、基因重组产品、胞内产品如:青霉素酰化酶,碱性磷酸酶等胞内酶,干扰素、胰岛素、生长激素等基因工程产物以及部分植物细胞产物等都是胞内物质,这类生物产物需要分离纯化的第一步是收集细胞及细胞破碎,使目标产物释放出来,然后进行分离纯化。
破碎细胞主要采用的方法有机械法和非机械法两大类。
机械破碎处理量大,破碎速度较快,时间短,效率较高,是工业规模细胞破碎的重要手段,细胞受到挤压,剪切和撞击作用,易被破碎在许多情况下,细胞内含物全部释放出来,由于机械搅拌产生热量,破碎要采用冷却措施,机械破碎主要的方法有珠磨法、高压匀浆法、撞击破碎法和超声波等方法。
其中,超声波法是一种很强烈的破碎方法,细胞破碎是利用声频高于15-20KHz的超声波在高强度声能输入下进行的,普遍认为其破碎机理是与空化现象引起的冲击波和剪切力有关,即空穴作用产生的空穴泡由于又受到超声波的冲击而闭合,从而产生一个极为强烈的冲击力压力,由此而引起悬浮细胞上产生了剪切应使细胞内液体产生流动而使细胞破碎。
机械破碎虽已广泛应用于工业大规模生产,但它仍有许多不足之处,如大量细胞碎片的产生,胞内所有可溶性杂质蛋白的释放,发酵液粘度增加等。
这给后处理工艺带来了很大难度,而非机械破碎方法,其条件比较温和,有利于存在细胞膜附近目标产物的高活力释放回收,适用于所有微生物细胞的破碎,包括物理法、化学法和酶溶法。
细胞物理破碎方法比如渗透压冲击法(Osmotic Shock)。
渗透压冲击法是各种细胞破碎方法中最为温和的一种。
将细胞放在高渗透压的介质中(如一定浓度的甘油或蔗糖溶液),达到平衡后,介质被突然稀释,或者将细胞转入缓冲液中,由于渗透压的突然变化,水迅速通过细胞壁和细胞膜进入细胞,引起细胞壁和膜膨胀破裂,从而使细胞通透性增大。
大肠杆菌是大多科学研究及应用中实现蛋白表达的首选宿主。
周质空间是由大肠杆菌内膜和外膜组成的双层膜结构,能提供一个适合外源蛋白正确折叠的环境。
蛋白纯化
四、反复冻融法
1、将细胞在-20度以下冰冻,室温融解,反复几次,由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液 的盐浓度增高引起溶胀,使细胞结构破碎。 2、至少3次以上冻溶。 3、用液氮冻融三四次就可以了,细胞冻住后,取出放37度水浴,溶解后震荡,再冻 。
五、裂解液处理法: 裂解液处理法:
1、细胞裂解液:50 mmol/L Tris-Cl pH 6.8,100 mmol/L DTT,2% SDS,0.1%溴酚蓝,10% 甘油。SDS是阴离子型表面活性剂、极易促溶、强变性作用。 2、如果是做小量菌液,跑PAGE胶看其表达情况的话,可以直接加蛋白loading buffer煮沸5分 钟即可。
三、超声裂解法
超声破碎 缺点是发热,剪切力强烈。纯化活性蛋白的时候最好少用。 (1). 要设定好超声时间和间隙时间,一般每次超声时间不超过5秒,间隙时间最好大于超声时间,这 些都有利于保护蛋白的活性。我的实验超声时间5秒、间隙时间10秒、工作次数60次 (5min)。具体 的超声条件,可以自行摸索! (2) . 一般超声用的溶液为binding buffer 10mL/g菌体湿重,超声时的溶液最好放在玻璃烧杯中 有利于 散热!增大溶液体积,也有利于充分超声裂解。 (3) . 如果是表达蛋白可溶,而且菌液浓度合适时,超声后菌液应该变澄清。表达包涵体的菌液超声到 液体发淡淡的白灰色即可。也可以用显微镜检测完整菌量,再决定是否再继续超声。
蛋白质分离纯化浅谈
蛋白样品的预处理
细胞的破碎是基因工程上下游的分界;一般采用温和的选择性抽提;大肠杆菌的渗透冲击抽提 可以获得胞内表达的60kD的蛋白。菌体裂解常用的方法: 渗透冲击法: 一、渗透冲击法: 冲击液1:1mM EDTA;50mM磷酸盐缓冲液,20%蔗糖,pH8.0 冲击液2:50mM磷酸盐缓冲液,pH8.0 (1) 将诱导的大肠杆菌,5000g 离心5min,收集菌体; (2) 菌体用冲击液1(按大肠杆菌与冲击液体积比10:1)打散冲击,冰浴30min,5000g离心5min,收 集菌体。 这里可以结合冻融法! (3) 菌体再用冲击液2(按大肠杆菌与冲击液体积比10:1)打散冲击,冰浴20min,12000g 4℃离心 10min,取上清液,即可得到粗制的样品溶液。 二、溶菌酶裂解法 将诱导的大肠杆菌,5000g 离心5min,收集菌体; (1) PBS 洗3遍;加入溶菌酶,终浓度一般是4mg/mL;但是如果你的表达菌是BL21的话,那么你就要 适量的少加(1mg/mL),因为BL21菌株本身自带溶菌酶。 (2) 反应条件我是在37 ℃水浴中杂交炉作用1-2h。根据你的时间和蛋白的稳定性,也可以在4 ℃冰箱 过夜的。
一种大肠杆菌细胞周质蛋白的提取方法[发明专利]
专利名称:一种大肠杆菌细胞周质蛋白的提取方法专利类型:发明专利
发明人:董晓宁,伍波,邹国英,李勇,吴智广,李超辉,南洋申请号:CN202210202794.4
申请日:20220303
公开号:CN114395029A
公开日:
20220426
专利内容由知识产权出版社提供
摘要:本申请涉及蛋白提取技术领域,具体公开了一种大肠杆菌细胞周质蛋白的提取方法,所述大肠杆菌细胞周质蛋白的提取方法,包括配制处理液对大肠杆菌进行预处理后离心,收集获得预处理菌体;利用蔗糖高渗溶液对预处理菌体进行处理后离心,最后用硫酸镁溶液进行处理后离心,即得所需的周质蛋白;上述方法先采用处理液对大肠杆菌的外膜进行干扰,从而使外膜失去完整性,失去了对渗透压的保护作用,再利用高浓度蔗糖溶液造成高渗透压让细胞收缩,最后利用低浓度的硫酸镁处理细胞,从而在保证大肠杆菌内膜完整性的前提下,诱导在细胞周质的蛋白充分释放,显著提高周质蛋白的提取纯度和提取率。
申请人:天津鸿宇泰生物科技有限公司
地址:300451 天津市滨海新区天津空港经济区经二路225号中国民航科技产业化基地一号厂房C 区四层1-6跨西侧厂房
国籍:CN
代理机构:北京维正专利代理有限公司
代理人:李爱民
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渗透休克法从大肠杆菌中提取GST—α1—TP5融合蛋白
渗透休克法从大肠杆菌中提取GST—α1—TP5融合蛋白目的:从大肠杆菌中选择性抽提GST-Tal-TP5融合蛋白。
方法:采用渗透休克法从大肠杆菌中提取GST-Totl-TP5融合蛋白,优化操作条件,并与超声破碎法进行比较。
结果:优化后的渗透休克法从大肠杆菌提取GST-TotI-TP5融合蛋白可使杂蛋白量含量相对超声破碎法降低一个数量级。
结论:渗透休克法可高效提取大肠杆菌表达的GST-Tα1-TP5融合蛋白。
标签:渗透休克法;大肠杆菌;谷胱甘肽硫转移酶;重组胸腺肽Tα1-TP5胸腺素α1(Tα1)是胸腺组分5(thvmosin fraction 5)中分离出来的由28个氨基酸残基组成的多肽,胸腺五肽(TP5)是胸腺生成素Ⅱ第32—36位的氨基酸残基片段。
Tod和TP5均属免疫调节剂,临床上二者均被用于治疗免疫缺陷、肝炎、肿瘤和艾滋病等疾病。
为了进一步研究二者的联合作用,本实验构建了与GST基因融合表达的重组胸腺肽Tα1-TP5表达菌株,在乳糖的诱导下实现了高效可溶性表达。
渗透休克法可选择性提取大肠杆菌周质空间蛋白,对简化后期纯化工艺十分有利。
有文献报道采用渗透休克法提取重组大肠杆菌周质空间的青霉素G酰化酶,回收率92.4%,纯化倍数3.22。
目前,大肠杆菌表达的GST融合蛋白大多采用超声破碎法,该法得到的粗酶液比活较低。
本研究探讨用渗透休克法从大肠杆菌中提取GST-Tα1-TP5融合蛋白,并优化操作条件。
1材料与方法1.1材料与试剂大肠杆菌BL21(DE3)[PGEX-4T-1],携带重组胸腺肽Tα1-TP5基因。
BCA蛋白质定量检测试剂盒购自上海生物工程公司;TB培养基:酵母粉2.4%,蛋白胨1.2%,甘油0.4%,磷酸二氢钾17 mmol/L,磷酸氢二钾72 mmol/L,高壓灭菌时磷酸盐与其他组分分开,待溶液冷却至60%以下后混合。
1.2实验方法1.2.1培养条件500ml三角瓶装TB培养基100ml,接种量0.5%,37℃,250 r/min,摇床培养,2.5 h后加终浓度1 dL乳糖诱导,继续培养6h后收集菌体。
大肠杆菌蛋白提取方法
大肠杆菌周质蛋白提取提取胞周质蛋白,渗透压破壁的方法是经典也好用的办法。
步骤如下:1、离心收集菌体,8000rpm/3~5min;2、PBS重悬菌体,洗涤2次,离心条件同上;3、30%蔗糖(1克菌体至少20ml)重悬菌体,放置10分钟;4、离心收集菌体,离心条件同上;5、纯水重悬菌体(1克菌体至少20ml),放置10分钟;6、离心,条件同上,小心移出上清即为提取液;如果不清亮,再15000rpm/10min离心一次。
注意事项:蔗糖和水悬浮时间长,则可能菌体全部破碎;而时间短了,则可能提取不完全。
同理,离心力太大离心时间长,可能造成菌体完全破碎。
上面说的条件,是指台式小离心机,如果处理的样品多,使用大的转头或连续流转头,则适当考虑离心力的换算,同时考虑加速/减速比较慢而适当调整离心时间。
提取液测定260/280吸收值,再走电泳,应该能够初步判断提取的效果。
260很高、杂蛋白很多,则破菌过分了。
1. 以冰冻的20% 蔗糖、2.5 mM EDTA、20 mMTris-HCl (pH 8.0)重溶诱导细胞,浓度达到5OD550单位/ml,冰浴10 分钟。
2. 15000g离心30 秒,取出沉淀再重溶于同样体积的冰冻的2.5 mM EDTA,20 mMTris-HCl,pH 8.0。
冰上静置10 分钟。
注意EDTA 不与His•Bind® 树脂相匹配。
3. 15000g离心10 分钟。
上清液为渗透休克组分。
用SDS-PAGE分析上清和沉淀。
我刚试过这个方法,效果很好,我表达的是约9.5KD的多肽。
1. 是将冰冻的20%蔗糖,2.5mMEDTA,20mM Tris-Hcl(pH8.0)直接加入诱导培养的菌液中吗?还是将菌液离心收集沉淀,将沉淀用上述溶液重溶?12000rpm30s离心菌液,沉淀用高渗液重悬,冰上放10min,12000rpm30s再次离心,沉淀用低渗液重悬,冰上放置10min,并不时颠倒混匀,以利于目的蛋白的释放。
蛋白纯化
有的做法在Binding buffer 加少量的咪唑,减少非特异性的结合! Wash buffer: 50mM磷酸盐缓冲液,0.5M NaCl. 40mM咪唑 pH 8.0
这里可以降低pH值至4-5 除去咪唑不能除去的杂蛋白 Elution buffer: 50mM磷酸盐缓冲液,0.5or 1M NaCl. 250mM咪唑 pH 8.0 Denature condition: Binding buffer: 100mM NaH2PO4 ; 10mMTris Cl; 8M Urea pH 8.0(adjust pH to 8.0using NaOH) Wash buffer: 100mM NaH2PO4 ; 10mMTris Cl; 8M Urea pH 6.0(adjust pH to 6.0using HCl) Elution buffer:100mM NaH2PO4 ; 10mMTris Cl; 8M Urea pH 4.5(adjust pH to 4.5using HCl) 使用Urea 的时候 需要现配现用!防止尿素分解后的产物使蛋白变性! 另外变性条件下进行蛋白纯
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四、反复冻融法
1、将细胞在-20度以下冰冻,室温融解,反复几次,由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液 的盐浓度增高引起溶胀,使细胞结构破碎。 2、至少3次以上冻溶。 3、用液氮冻融三四次就可以了,细胞冻住后,取出放37度水浴,溶解后震荡,再冻 。
渗透压冲击法提取大肠杆菌周质中的人生长激素
渗透压冲击法提取大肠杆菌周质中的人生长激素陈耀国【摘要】目的改进渗透压冲击法提取大肠杆菌周质中的人生长激素.方法用1~20 mmol·L-1 的Ca2+预处理细胞10 min对渗透压冲击法提取人生长激素进行优化.结果优化后人生长激素的回收率提高了17.8%.结论 Ca2+预处理细胞可有效提高渗透压冲击法提取人生长激素的收率.【期刊名称】《药学研究》【年(卷),期】2012(031)007【总页数】2页(P373-374)【关键词】大肠杆菌;渗透压冲击;人生长激素;周质提取【作者】陈耀国【作者单位】上海联合赛尔生物工程有限公司,上海,201206【正文语种】中文【中图分类】R977.1周质空间(periplasmic space)是由大肠杆菌内膜和外膜组成的双层膜结构,能够提供一个适合外源蛋正确折叠的环境.利用大肠杆菌系统,在外源基因的N端融合一段细菌蛋白的疏水信号肽,可将目的蛋白运送到周质空间,经信号肽酶将信号肽切除后,即可获得与天然蛋白一致的构象(不含N端多余的甲硫氨酸)[1].本研究所构建的工程菌可分泌人生长激素到周质空间中,并采用渗透压冲击法提取目的蛋白.1 材料和方法1.1 菌株 Escherichia coli BL21(Novagen公司),质粒pIN-III-OmpA-hGH由公司研发工艺部提供.1.2 培养基1.2.1 摇瓶培养基选用LB培养基,用前加入氨苄西林钠50 mg⋅L-1.1.2.2 发酵培养基 Glucose 5 g⋅L-1,Tryptone 10 g⋅L-1,Yeast extract 5 g⋅L -1,KH2PO43 g⋅L-1,Na2HPO46 g⋅L-1,(NH4)2SO41.2 g⋅L-1,MgSO40.5 g⋅L-1,CaCl20.15 g⋅L-1,泡敌0.2 mL⋅L-1(葡萄糖单独灭菌,发酵前加入).1.2.3 补料培养基 Glucose 350 g⋅L-1,Tryptone 300 g⋅L-1.1.3 发酵罐 5 L发酵罐,为上海保兴生物设备工程有限公司产品.1.4 种子液的制备取-70℃甘油菌1‰接种到50 mL (250 mL锥形瓶)的LB培养基中,37℃,200 r⋅min-1,培养12~15 h进行菌种活化.将活化好的菌液以2%的接种量加入到200 mL(500 mL锥形瓶)LB培养基中,37℃,200 r⋅min-1,培养4~5 h即为种子液.1.5 发酵培养培养基体积为3 L,pH控制在7.20±0.20,由发酵控制系统自动补入4 mol⋅L-1NaOH调节培养基pH.培养温度控制在(37±0.5)℃,发酵过程控制溶氧在30%以上,当溶氧低于30%时通过提高通气量和搅拌速度提高溶氧.当发酵进行到3.5~4 h后,溶氧开始上升时,以25~30 mL⋅h-1的流速滴加补料液,补料体积为300 mL.1.6 周质蛋白的提取取200 mL的发酵液,加入不同浓度的蔗糖和EDTA,室温150 r⋅min-1,温育20 min,4℃ 14 000 ×g离心20 min,弃高渗液,向菌泥中加入60 mL的4℃ RO水,轻轻搅匀,冰浴20 min,4℃14 000×g离心20min,得60 mL上清液即为周质蛋白,试验重复两次.蛋白含量测定:采用Bradford法[2].以对照品溶液浓度与其相对应的吸光度计算线性回归方程.另精密量取待测样品溶液适量,同法测定,从线性回归方程计算待测样品溶液中的蛋白浓度,并乘以稀释倍数.SDS-PAGE分析:取周质蛋白溶液50 μL与2×Loading Buffer等比例混匀,100℃水浴加热5~10 min,按文献[3]方法进行SDS-PAGE电泳,分离胶溶液的浓度为15%.2 结果2.1 不同蔗糖浓度对生长激素回收率的影响加入终浓度0~30%的蔗糖温育发酵液20 min,SDS-PAGE表明,随着蔗糖浓度的增加,周质蛋白中的hGH含量也逐渐增多,蔗糖溶液浓度为20%和30%时,hGH含量达到较高水平(见图1).表1数据也表明了蛋白含量逐渐增多的趋势.考虑到生产成本以及操作的可行性,试验采用20%浓度的蔗糖温育发酵液.表1 不同蔗糖浓度周质蛋白含量蔗糖浓度(%) 0 5 10 15 20 30周质蛋白含量(μg⋅mL-1)110 439 961 1079 1513 1975图1 不同蔗糖浓度SDS-PAGE分析2.2 不同EDTA浓度对生长激素回收率的影响加入终浓度20%的蔗糖和0~20 mmol⋅L-1的EDTA温育发酵液20 min,SDS-PAGE表明,不同浓度EDTA温育发酵液,周质蛋白中的hGH含量相差不明显(见图2).表2数据表明,10mmol⋅L-1和15 mmol⋅L-1的EDTA条件下的周质蛋白含量较高,分别为2 472 μg⋅mL-1和2 559 μg⋅mL-1.考虑到两者hGH含量差不多,试验采用10 mmol⋅L-1浓度的EDTA温育发酵液.表2 不同EDTA浓度周质蛋白含量EDTA浓度(mmo⋅L-1) 2 063 2 161 2 281 2 472 2 559 2 492图2 不同EDTA浓度SDS-PAGE分析2.3 不同CaCl2浓度对生长激素回收率的影响加入0~20 mmol⋅L-1的CaCl2溶液预处理发酵液10 min,再加入终浓度20%的蔗糖和10 mmol⋅L-1的EDTA 温育发酵液20 min,SDS-PAGE表明,不同浓度CaCl2溶液中,1 mmol⋅L-1的CaCl2溶液预处理发酵液后,周质蛋白中的hGH含量最高(见图3).表3数据表明,随着Ca2+浓度的升高,周质蛋白含量逐渐减少,15 mmol⋅L-1和20 mmol⋅L-1浓度Ca2+预处理发酵液后,相应周质蛋白含量反而低于空白对照. 表3 不同CaCl2浓度周质蛋白含量CaCl2浓度(mmol⋅L-1) 1 929 2 271 2 213 2 191 1 756 1 606图3 不同CaCl2浓度SDS-PAGE分析3 讨论大肠杆菌外膜主要组成为脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),LPS具有吸附Mg2+、Ca2+等阳离子的作用,利用EDTA的螯合阳离子的能力,与吸附于LPS 表面上的Ca2+结合,提高细胞外膜的通透性,以增加周质蛋白的回收[4].本研究用Ca2+预处理发酵液,随着 Ca2+浓度的升高,过多的Ca2+与EDTA结合,反而削弱了外膜的通透性,导致周质蛋白回收的减少.1 mmol⋅L-1浓度Ca2+预处理发酵液10 min,能提高周质蛋白回收率为17.8%(表3数据得出).另外,以往渗透压冲击法先离心发酵液收集菌体,再加入蔗糖溶液重悬菌体.本研究直接向发酵液加入终浓度为20%的蔗糖,减少了一次离心和重悬程序,减轻了操作者的劳动强度和节约了能源消耗.改进后的渗透压冲击法可以处理湿重为40~60 g⋅L-1的发酵液.参考文献:[1]李振国,徐明波,牛罡,等.在大肠杆菌周质表达重组蛋白的研究进展[J].药物生物技术,2011,18(1):73-76.[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版(二部)[S].北京:中国医药科技出版社,2010:附录VII M.[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版(三部)[S].北京:中国医药科技出版社,2010:附录ⅣC.[4] Chen YC,Chen LA,Chen SJ,et al.A modified osmotic shock for periplasmic release of a recombinant creatinase from Escherichia coli [J].Biochem Eng J,2004,19(3): 211-215.。
重组人促红细胞生成素的分离纯化工艺
第15页,共46页。
亲和层析选择性最强,但不能放在第一步,一方 面因为杂质多,易受污染,降低使用寿命;另一方面, 体积较大,需要大量的介质,而亲和层析介质一般较 贵。因此亲和层析多放在第二步以后。有时为了防止 介质中毒,在其前面加一保护柱,通常为不带配基的 介质。
经过亲和层析后,还可能有脱落的配基存在,而 且目的蛋白质在分离和纯化过程中会聚合成二聚体或 更高的聚合物,特别是当浓度较高,或含有降解产物 时更易形成聚合体,因此最后需经过进一步纯化操作, 常使用凝胶过滤色谱,也可用高效液相色谱法,但费 用较高。
第24页,共46页。
26.5典型重组药物制造技术及工艺
下面介绍几种临床上极为重要的重组药物如干 扰素、生长素、胰岛素等的生产技术及工艺。
26.5.1重组人干扰素生产技术及工艺 26.5.2重组人胰岛素生产技术及工艺 26.5.3重组人生长素生产技术及工艺 26.5.4重组人促红细胞生成素生产技术及工艺
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4.分离纯化工艺的要求
在重组药物分离纯化过程中,通常需要综合 使用多种分离纯化技术。另外,作为药品,其生产 必须保证安全、无菌、无热源、无污染。 1、分离纯化工艺要求有良好的稳定性和重复性, 减小原料及设备对产品的影响。 2、工艺的步骤尽可能少,时间要尽可能短,以减 少生物活性物质的破坏失活。 2、组成工艺的各技术、步骤之间及设备间要能相 互适应和协调,且高效,收率高,易操作,对设备 条件要求低,能耗低,并尽可能少用试剂,以免增 加分离纯化步骤或干扰产品质量。
渗透冲击对大肠杆菌糖运输的影响
渗透冲击对大肠杆菌糖运输的影响
易全成;颜日祥
【期刊名称】《淮北煤师院学报:自然科学版》
【年(卷),期】1990(011)003
【摘要】渗透冲击对大肠杆菌半乳糖运输有明显的降低作用,对葡萄糖影响较小,对乳糖检测不出有影响。
营养条件对大肠杆菌冲击细胞半乳糖的运输产生影响。
【总页数】4页(P36-39)
【作者】易全成;颜日祥
【作者单位】不详;不详
【正文语种】中文
【中图分类】R378.21
【相关文献】
1.渗透压冲击法提取大肠杆菌周质中的人生长激素 [J], 陈耀国
2.过表达氨基葡萄糖脱氨酶对大肠杆菌氨基葡萄糖合成及中心碳代谢的影响 [J], 王珊珊;高璐;严明;许琳
3.ptsG/mglB双基因敲除对大肠杆菌发酵混合糖产L-乳酸的影响 [J], 刘汝婷;张倩;郭西鹏;王金华;高娃
4.葡萄糖氧化酶对大肠杆菌攻毒肉鸭生长性能、免疫功能及肠道健康的影响 [J], 刘娇;陈志敏;郑爱娟;刘国华;蔡辉益;常文环
5.麦芽糖浓度和渗透压对游动放线菌生长及阿卡波糖生物合成的综合影响 [J], 姜玮;生英涛;蔡月明;郭美锦;储炬
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渗透压冲击法提取大肠杆菌周质蛋白
许多生物产物特别是蛋白质、基因重组产品、胞内产品如:青霉素酰化酶,碱性磷酸酶等胞内酶,干扰素、胰岛素、生长激素等基因工程产物以及部分植物细胞产物等都是胞内物质,这类生物产物需要分离纯化的第一步是收集细胞及细胞破碎,使目标产物释放出来,然后进行分离纯化。
破碎细胞主要采用的方法有机械法和非机械法两大类。
机械破碎处理量大,破碎速度较快,时间短,效率较高,是工业规模细胞破碎的重要手段,细胞受到挤压,剪切和撞击作用,易被破碎在许多情况下,细胞内含物全部释放出来,由于机械搅拌产生热量,破碎要采用冷却措施,机械破碎主要的方法有珠磨法、高压匀浆法、撞击破碎法和超声波等方法。
其中,超声波法是一种很强烈的破碎方法,细胞破碎是利用声频高于15-20KHz的超声波在高强度声能输入下进行的,普遍认为其破碎机理是与空化现象引起的冲击波和剪切力有关,即空穴作用产生的空穴泡由于又受到超声波的冲击而闭合,从而产生一个极为强烈的冲击力压力,由此而引起悬浮细胞上产生了剪切应使细胞内液体产生流动而使细胞破碎。
机械破碎虽已广泛应用于工业大规模生产,但它仍有许多不足之处,如大量细胞碎片的产生,胞内所有可溶性杂质蛋白的释放,发酵液粘度增加等。
这给后处理工艺带来了很大难度,而非机械破碎方法,其条件比较温和,有利于存在细胞膜附近目标产物的高活力释放回收,适用于所有微生物细胞的破碎,包括物理法、化学法和酶溶法。
细胞物理破碎方法比如渗透压冲击法(Osmotic Shock)。
渗透压冲击法是各种细胞破碎方法中最为温和的一种。
将细胞放在高渗透压的介质中(如一定浓度的甘油或蔗糖溶液),达到平衡后,介质被突然稀释,或者将细胞转入缓冲液中,由于渗透压的突然变化,水迅速通过细胞壁和细胞膜进入细胞,引起细胞壁和膜膨胀破裂,从而使细胞通透性增大。
大肠杆菌是大多科学研究及应用中实现蛋白表达的首选宿主。
周质空间是由大肠杆菌内膜和外膜组成的双层膜结构,能提供一个适合外源蛋白正确折叠的环境。
在大肠杆菌周质空间表达的重组蛋白有众多优点,由于周质空间的蛋白含量低,蛋白酶活性要比胞质中低,所表达的目的蛋白能避免胞内降解而稳定的存在,有利于目的蛋白的浓缩。
但是周质蛋白提取需要定向释放技术,该技术的关键在于只破坏大肠杆菌的外膜而
不损害内膜,否则大肠杆菌胞内蛋白的和核酸的释放将给目的蛋白的纯化带来困难。
利用渗透压冲击法,研究者们已经成功地从大肠杆菌中分离纯化出许多具有重要价值的目标蛋白,比如血管内皮生长因子受体-2。
血管内皮生长因子受体-2具有重要的治疗意义。
Wanlu Cao等采用并优化了渗透压冲击法有效的提取和浓缩这种受体[1]。
文中,通过5000g离心30min收集发酵罐中的菌体,去上清,重悬菌体,并混匀,加入等量的渗透压冲击缓冲液(36%蔗糖,20mM磷酸缓冲液,pH7;2.5Mm EDTA),在20℃下充分混匀10分钟,迅速加入5倍体积得得预冷蒸馏水,引发渗透压冲击,经过20分钟的平衡时间,悬浮液在4℃下离心(7500g,20min),收集上清即为大肠杆菌周质破碎上清,用于进一步纯化。
渗透压冲击法分离蛋白的优化方法曾
击法的优化》一文中,平衡时间,渗透缓冲液的浓度和类型,pH值对于该法具有关
键作用。
研究表明在渗透冲击之间增加平衡时间和渗透缓冲液中的Tris-HCl的浓度,初始细胞在渗透缓冲液中的扩散能够提高提取的效果[2]。
在利用大肠杆菌制备C-藻青蛋白时,Ramos, Amparo等改进了一种大规模纯化该蛋白的方法,藻青蛋白的提取通过渗透压冲击法并通过层析法分离离心后的上清液。
在提取的过程中,溶剂中添加了0.01%的叠氮化钠,2g菌体与40ml的缓冲液混匀,
并利用磁力搅拌器将液体和细菌充分混匀,时间大约30min。
结束后,将液体转移到离心管中,在12000rpm下离心15min,收集上清[3]。
渗透压冲击法还被用于分离大肠杆菌合成的人抗体片段。
在该研究中,作者利用自我切割亲和标签技术来对几种目标蛋白进行分离,其中两种蛋白含有二硫键。
这些蛋白首先通过基因工程的方法与自我切割几丁质结合结构域(内含肽标签),并通过
几丁质琼脂糖树脂进行纯化。
通过将目的基因与内含肽的片段融合后,表达的蛋白能够被大肠杆菌分泌到周质空间,通过渗透压冲击法能够被释放出来[4]。
应用渗透压冲击法裂解细菌时,所表达的蛋白不能够形成包涵体,应该在目标蛋白上连接一段信号肽,使表达的蛋白能够分泌到周质空间,否则时间效果将不如其他裂菌方法比如超声波法。
蔡媛媛等在构建肿瘤坏死因子相关凋亡配体胞外功能区的原核表达质粒,优化诱导蛋白表达的相关条件,检测切胶纯化所得蛋白的抗原结合活
性,以及亲和层析纯化蛋白的促凋亡功能的研究中同时比较超声、渗透冲击和IP 裂解三种破碎细菌方法,在A600值、IPTG以及诱导时间都相同的情况下,37℃出现包涵体表达,裂解细菌方法的比较中,渗透冲击法以及IP 裂解法的实际效率不及超声法,实验者可根据实验目的来选择最适合的方法,需注意的是,若要提取上清里的可溶性蛋白,超声时菌液一定要冰浴以防蛋白高温变性[5]。
参考文献:
1.Cao, W., et al., Periplasmic expression optimization of VEGFR2 D3 adopting response
surface methodology: Antiangiogenic activity study.Protein Expression and Purification, 2013. 90(2): p. 55-66.
2.Rathore, A.S., R.E. Bilbrey, and D.E. Steinmeyer, Optimization of an osmotic shock
procedure for isolation of a protein product expressed in E. coli. Biotechnol Prog, 2003.
19(5): p. 1541-6.
3.Zhang, C., et al., Changed loading conditions and lysate composition improve the
purity of tagged recombinant proteins with tacn-based IMAC adsorbents. Biotechnol J, 2015. 10(3): p. 480-9.
4.Ramos, A., et al., Development of a process for large-scale purification of C-
phycocyanin from Synechocystis aquatilis using expanded bed adsorption chromatography. Journal of Chromatography B, 2011. 879(7–8): p. 511-519.
5.Wu, W.-Y., et al., Intein-mediated one-step purification of Escherichia coli secreted
human antibody fragments. Protein Expression and Purification, 2011. 76(2): p. 221-228.。