细胞遗传学论文

细胞融合技术的发展及其应用

摘要

细胞融合技术作为细胞工程的一项核心技术在农业、医药、环保等领域得到迅速发展和应用，且其应用领域不断扩大。本文简述了细胞融合技术技术中的常用方法：仙台病毒(HVJ)诱导法、聚乙二醇(PEG)化学诱导法、电融合诱导法、激光诱导法及此技术的最新研究进展：空间细胞融合技术、离子束细胞融合技术、非对称细胞融合技术等。该技术不仅为核质关系、基因定位、基因调控、遗传互补、细胞免疫、疾病发生、膜蛋白动力学等理论领域的研究提供了有力的手段，而且被广泛应用于免疫学、遗传学、发育生物学，在实际应用中特别是在单克隆抗体、抗肿瘤疫苗及动植物远缘杂交育种和微生物茵种选育，绘制基因图谱等方面具有十分重要的意义。随着细胞融合技术的不断改进和完善，动物、植物及微生物细胞融合技术无论在基础理论研究还是在实际应用产生的影响将日益显著。

关键词：细胞融合；方法；应用；进展

细胞融合技术是近年来迅速发展起来的一项新生物工程技术。所谓细胞融合指在外力(诱导剂或促融剂)作用下，两个或两个以上的异源(种、属间)细胞或原生质体相互接触，从而发生膜融合、胞质融合和核融合，并形成杂种细胞的现象称为细胞融合(cell fusion)或细胞杂交(cell hybridization)[1]。利用现代科学技术，把来自于不同种生物的单个细胞融合成一个细胞，这个新细胞(杂合细胞)得到了来自两个细胞的遗传物质(包括细胞核的染色体组合和核外基因)，将具有新的遗传学或生物学特性。目前，通过原生质体融合进行体细胞杂交已成为细胞工程研究的重要内容之一[2]。

细胞融合技术不仅为核质相互关系、基因调控、遗传互补、肿瘤发生、基因定位、衰老控制等领域的研究提供了有力的手段，而且在遗传学、动植物远缘杂交育种、发生生物学、免疫医学以及医药、食品、农业等方面都有广泛的应用价值。特别是在单克隆抗体的制备、哺乳动物的克隆以及抗癌疫苗的研发等技术中，细胞融合技术已成为关键技术。随着研究的不断深入，细胞融合技术的应用领域越来越广，产生的影响也日益显著。本文就其目前的研究进展及其应用进行综述。

1细胞融合技术的常用方法

1.1 仙台病毒(HVJ)诱导法

1962年日本的冈田善雄(Okada)[3]偶然发现了由日本血凝性病毒(HVJ)或称仙台病毒引起的艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞的现象。冈田善雄的研究为人工诱导体细胞杂交奠定了方法学基础。细胞融合现象的发现引起细胞学界的高度重视，1965年英国的Harris和watkins在利用灭活病毒诱导细胞融合方面做了大量的工作，并进一步利用这种灭活病毒来诱导不同种动物细胞问的融合。

但是，利用灭活的病毒诱导细胞融合，存在着许多问题，如病毒制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异大、实验的重复性差、融合率很低等。目前，这种方法主要适用于动物细胞融合，用于实验室研究。

1.2 聚乙二醇(PEG)化学诱导法

1974年华裔加拿大籍科学家高国楠(Kao)[4]发现PEG可促进不同科属的植物原生质体之间的融合。当加入一定分子量的PEG时，融合效率较病毒诱导法提高1 000倍以上。后来人们又发现还有许多其他的化学剂可促进细胞凝集和融合，如磷酸盐、高级脂肪酸衍生物、脂质体等，但诱导的效果都不如PEG。由于病毒诱导细胞融合存在诸多缺点，所以1975年以后，利用PEG诱导细胞融合逐渐发展成为一种规范的重要化学融合方法。

PEG法的优点是没有种间、属间、科间的特异性或专一性，所以这种方法一直沿用至今。PEG法以其低廉的实验成本和相对较高的融合率，大量应用于诸多实验中。虽然PEG 作为融合剂有很多成功的报道，但仍存在着对细胞损伤大、残存毒性、融合率较低及经验性大等缺陷。近年来，一种物理融合技术——细胞电融合技术迅速崛起并显示出强大的生命力。

1.3 电融合诱导法

自1978年Zimmermann[5]等及1979年Senda[6]等报道电脉冲诱导细胞融合成功以来，Zimmermann及其同事们做了大量的工作，创立了物理的、实用的Zimmermann电融合法。其原理是在短时间强电场的作用下，细胞膜发生可逆性电击穿，瞬时失去其高电阻和低通透特性，然后在数分钟后恢复原状．当可逆电击穿发生在2个相邻细胞的接触区时，即可诱导它们的膜相互融合，从而导致细胞融合．利用电融合的方法，人们对膜的融合过程和机制进行了进一步的探索．电融合诱导法在农业和医学上也展现了广泛的应用前景。

与使用PEG的化学法相比，电融合诱导法是一种非常高效的细胞融合方法。电融合技术的优点在于：融合频率高，是PEG的100倍；操作简便、快速；对细胞无毒；可在镜下观察融合过程。故这种方法得以在短期内被广泛采用，成为细胞融合的主要技术手段。该方法的缺点是必须购置专用的细胞电融合设备。

1.4激光诱导法

1984年Schierenberg首次报道利用微束激光成功地进行了细胞融合实验，为细胞融合找到了另一种有效的方法。细胞之间相互接触是实现细胞融合的前提，除了采用病毒、化学剂或电场的方法使细胞接触以外，还可以利用激光的光镊建立细胞间接触。利用激光微束可以对相邻细胞的接触区细胞进行破坏，从而诱导许多细胞中所需的2个相邻细胞融合。使用此技术时，为促使细胞接触可用光俘虏法，也可用低浓度的融合剂PEG(5％)使细胞聚集。

激光微束融合法与以前的病毒法、PEG法、电融合法相比较，最突出的优点在于它可选择任意两个细胞进行融合，易于实现特异性细胞融合，作用于细胞的应力小，定时定位性强，损伤小，参数易于控制，操作方便，可利用监控器清晰地观察整个融合过程，实验重复性好，无菌无毒性，但它只能逐一处理细胞。

2细胞融合技术的最新进展

2.1 基于微流控芯片的细胞融合技术

随着微机电系统(MEMS)技术和微加工技术的发展，微电极阵列的设计加工制作也日趋成熟，加之微通道网络可以整合到生物芯片之上，这将使得微流控系统成为细胞融合的理想平台，利用微流控系统可以按照预定的要求大量融合异种细胞。目前，基于微流控芯片的细胞融合技术已成为细胞融合技术研究的重点领域[7]。

利用基于芯片技术的微流控系统不仅可以实现对细胞甚至单个细胞的操控，比如转移、定位、变形等，也可以同时输送、合并、分离和分选大量细胞，细胞融合在芯片上可以通过并行或快速排队的方式实现。此外由于在微通道内的腔体容积很小，所以会大幅减少细胞融合中所需的细胞数量，同时细胞融合率和杂合细胞的成活率会大大提高。

2.2 高通量细胞融合芯片

高通量细胞融合芯片利用微电极阵列在微米范围内(10一40μm)产生的高强度、高梯度辐射电场，使得细胞在特殊辐射电场的作用下产生介电质电泳力，精确处理和刺激预定的目标细胞，从而使目标细胞按照预先设计的方向(可以是任何预先设计好的方向)以预定的速度(可以是不同种的细胞以不同的速度定向)移动，从而按照设计要求准确地、大批量地得到目标细胞配型，集成微电极阵列的微流控系统，可以方便灵活地实现对细胞的操作、隔离和转移。由于在微通道内微电极间距可以做得很小，因此获得同样强度的辐射电场强度只需施加较低电压的交变电场和脉冲即可，不用加载昂贵的高电压发生装置[7]。

高通量细胞融合芯片可以与化学诱导融合、电诱导融合等方法相互结合，比如：在细胞融合缓冲液中加入少量的PEG可大大提高细胞的融合率．此外，二价阳离子(例如：Ca2+)以及蛋白酶对细胞进行预处理，融合率也可大幅提高。然而，截至目前各国与此相关的细胞融合实验工作只有几篇文章见诸报端，许多构想也只是在理论层次上的探讨。

2.3 空间细胞融合技术