基因工程抗体

基因工程抗体

生命科学学院 09动物医学

学号：2009082554 姓名：张孝辉指导老师：郑新添

【摘要】：基因工程抗体以其独特的优点(免疫原性低、可按人的意愿加以改造等)正逐渐取代动物源性单抗。随着基因工程和蛋白质工程等生物技术在抗体研制领域的广泛应用, 适应不同需要的基因工程抗体的种类日趋多样化, 构建日趋合理化, 在体内的生物学效应也日臻完善, 使之较天然单抗的治疗效果更好, 范围更广, 并在初步临床试用中展示了光辉的前景。

【关键词】：基因工程抗体; 生物技术

【前言】：单抗作为一种有效的新型生物制剂促进了基础医学、临床医学、生物学、农学等众多生命学科的发展, 尤其在疾病的预防、诊断及治疗方面的作用日益重要。然而作为体内的应用, 啮齿类动物单抗的高免疫原性, 使所有病人均发生不同程度的人抗鼠抗体反应(HAMA), 削弱了治疗的有效性, 并对清除抗体的器官产生毒性损害, 因此其应用严重受限。为了创造出更理想的治疗用抗体分子, 将制备单抗的细胞工程技术与生产重组分子的基因工程技术和蛋白质工程技术相结合, 产生了基因工程抗体。短短的几年研究使得这个领域的发展日新月异, 目前已成为抗体应用研究的热点。但随着研究的深入进展, 也暴露出许多问题。目前在以单抗为基础的临床治疗研究中, 面临五个最重要的问题及技术挑战:

(1)使基因工程抗体具有与亲本抗体相一致的亲和力及特异性;

(2)克服人抗动物单抗及人抗任何与单抗相交联的细胞毒性物质的免疫反应;

(3)制备合适的细胞毒性物质;

(4)符合体内药物动力学及生物分布特性;

(5)高产量, 低成本。本文综述了近几年国内外学者为攻克这几个难题在基因工程抗体领域所做的努力及研究进展。

1.基因工程抗体概述

基因工程抗体又称重组抗体, 是指利用重组DNA 及蛋白质工程技术对编码抗体的基因按不同需要进行加工改造和重新装配, 经转染适当的受体细胞所表达的抗体分子。目前报道的基因工程抗体很多, 分类方法不一, 大体可以分为三类。

1.1完整的抗体分子

该类抗体类似于天然抗体分子, 但经改造后更接近于人的免疫球蛋白, 可在一定程度上

降低HAMA。

1.1.1嵌合抗体(chimeric antibody):

由在基因水平上连接的小鼠抗体V 区及人抗体C 区组成。这种抗体含 75%～ 80%人抗体, 20%鼠抗体, 保留了原来鼠源单抗的特异性, 但对人体仍具一定的免疫原性。

1.1.2人源化抗体(humanized antibody)又称重构型抗体、改型抗体(reshaped antibody)或CDR 移植抗体(CDR grafting antibody):

通过置换三个发夹状环的鼠抗体超变区(又称互补决定区,CDR), 使构成抗原结合部位的

轻重链各 3 个CDR 区是鼠源的, 其余均为人源的。该抗体对人的免疫原性大大降低, 但与

抗原的亲和力也有所下降。虽然目前通过选择与鼠单抗同源性大的抗体及改变骨架(fragment region, Fr)上某些关键的氨基酸残基或遮蔽鼠单抗CDR 表面的残基(veneering) 等方法,

人源化抗体与抗原的亲和力只能达到原先鼠源单抗的33%～ 35%。而且杂交瘤技术使人们可

能在稳定的细胞株中生产任何一种单抗，该技术已广泛应用于科研及临床诊治中。鼠单抗作

为异源性蛋白在人体内可诱发抗鼠抗体（HAMA）的产生（Elliott等，1994），而通过杂交

瘤技术获取人单抗，技术上还存在诸多问题，为解决这一难题，鼠单抗人源化成为最早出现

的基因工程抗体（Vaughan等，1998）。

1.1.3完整的人抗体(fully human antibody):

这是由人淋巴细胞产生的理想的抗体分子, 不包含任何鼠源成分。此种抗体不仅完全避

免了HAMA 的产生, 而且特异性、亲和力不受影响。尽管利用人细胞制备单抗的工艺尚不成熟, 但抗体库技术、体外亲和力成熟及转基因动物的研究等, 已使生产完整的人抗体成为可能。【1】

1.2抗体分子片段

小分子抗体片段具有免疫原性低, 分子量小, 易于渗入目标组织及清除, 不与Fc 受体

阳性细胞相结合等优点, 并便于发展其他效应, 如与毒素相连, 融合表达免疫毒素; 与放射

性同位素相连, 在体内成像定位检查时本底低, 能呈现清晰图像。

1.2.1 单区抗体又称单域抗体:

由单个VH 功能区构成, 制备方法简便。但亲和力较完整抗体下降了一个数量级, 另外

VH 暴露了原先和VL 结合的疏水性表面,影响了其特异性。因此如果要应用VH 仍需进一步改造。【2】

1.2.2单链抗体:

由VH 和VL 中间联以含14～ 15 个氨基酸残基的小肽, 较稳定, 但亲和力比完整抗体

及Fab 低, 可能与肽连接物干扰有关。除此之外, 一些scFv 有很强的聚集趋势。因此, 双价、三价 scFv 应运而生。研究表明, 多价 scFv 在结构和功能上更接近亲本抗体, 与抗原

结合比单价 scFv 更敏感, 亲和力更高, 几乎与亲本抗体结合抗原的功能一致。

1.2.3 二硫键稳定的Fv :

链内二硫键通过联结VH 和VL 功能区中结构上固定的骨架区使VH 和VL 成为一体。这种方法适用于任何Fv, 因为用来连接二硫键的残基位于结构上固定的骨架区, 链内二硫键远离CDRs, 不干扰抗体与抗原结合。因此与 scFv 相比,dsFv 更具稳定性及亲和性。

1.2.4 Fab 和嵌合 Fab:

Fab 包括重链的VH2CH1 和轻链的VL2CL, 如果CH1 和CL 是人源的, 就为嵌合Fab。Fab 由于两条链间的非极性相互作用, 很稳定, 而且因为有CH1 便于检测。基因工程菌表达的Fab 与酶解获得的Fab 具相同的功能。它的表达有时会比scFv 低, 可能与两条链在细菌周质中的折叠有关, 但亲和力比 scFv 好, 几乎与亲本抗体一致。

1.2.5分子识别单位(molecular recognition unit,MRU ):

一种肽或非肽类分子, 表达一个CDR, 可能模拟亲本分子的特异性。有一些模拟抗体的肽类似物已被合成, 并证明能阻断病毒与细胞的结合;只构建并合成了一例非肽类分子, 完全消除了抗体对人的免疫原性。MRU分子量小, 在药物动力学、生物分布尤其是组织穿透性、用药规则等方面具优越性, 可能成为显像分子及打靶分子中很重要的一部分。不过MRU 是否具有同Fab 及Fv 片段一样的亲和力还有待于进一步证实。【3】

1.3新型抗体分子

将抗体的部分片段连接到与抗体无关的序列上或被其他功能性分子所取代, 使这些抗体不仅具有与抗原结合的特性, 还能发挥其他效应。

1.3.1 抗体相关分子又称新效能抗体:

通过基因拼接、化学交联等方法, 使不同类型抗体分子与酶、化学药物、放射性同位素、生物毒素、超抗原等相结合。抗体发挥导向及载体效应, 使所连接物质准确无误地聚集于靶组织, 具有特异性高、用量少、副作用小的优点。

1.3.2双特异性抗体又称双功能抗体:

这种抗体的两个Fab 段能同时与两个不同的抗原相结合, 如与特异性抗原及效应细胞相结合。可通过化学交联、二硫键交换连接两种特异性不同的抗体或通过两种杂交瘤细胞融合而制备。还有人报道用逆转录病毒衍生的穿梭载体进行基因转移来生产。

1.3.3 催化抗体(catalytic antibody)又称抗体酶(abzyme):

指具有催化活性的抗体, 不仅能与抗原结合, 还能使他们发生化学转变。这些抗体明显的作用是选择性结合并降解病毒、肿瘤细胞及其他生理靶细胞表面表达的蛋白质及碳水化合物抗原。此外, 催化抗体还参与药物、化学制剂、新物质的合成, 并能为基本化学反应提供理论依据。例如转换态稳定、酸2碱反应及亲电、亲核反应的催化。自从第一例与酯类水解有关的转换态类似物的催化抗体的研制成功, 已建立了许多方法以提高催化抗体的反应性 , 包括蛋白质工程的应用及协同因子结合位点的设计等。最近, 还有人报道用抗体库制备出切割各种核酸的抗体酶。表面表达的噬菌体抗体库也为催化抗体的生产及临床诊断、治疗方面的发展提供了一条可行的途径。【4】

2基因工程抗体生产技术