β-葡萄糖醛酸糖苷酶GUS组织化学染色检测转基因植物

也存在一些缺点：1）虽然非致死检测的研究取得了一些进展，但
这一检测对于活体组织仍然不太合适；2）由于酶和产物非常稳定， 因而不能真实地反映出GUS替代的那个蛋白在稳定状态下的丰度；3）
在GUS表达水平很高的组织中会发生无色反应中间产物渗漏的现象，
但是这可以通过在底物溶液中加入氧化剂高铁氰化钾或亚铁氰化钾 或者二者都加来使这种渗漏减至最少；4）同所有的组织化学方法
β -葡萄糖醛酸糖苷酶（GUS） 组织化学染色检测转基因植物
实验目的
学习转GUS基因的植物组织化学染 色方法，掌握染色的原理。
实验原理
β -葡萄糖醛酸糖苷酶（GUS）基因是植物转基因中常用
的一个报告基因。GUS基因是从大肠杆菌中分离出来的，在 GUS基因附近插入启动子区就产生了转录融合基因或翻译融 合基因。在稳定转化的植物中，利用一个简单的组织化学检 测就可以精确地分析GUS融合基因的时空表达模式。用X-
5．70% 乙醇
实验步骤
1．将阴性对照材料和转GUS基因或带有可表达的GUS基 因的烟草叶片切成小块，浸入盛有 100 μ l 染色液的 0.5ml的离心管中。 2．抽真空后37℃温育4-16h。
3．叶片等绿色材料转入70%乙醇中脱色2-3次，至阴性 材料呈白色。
4．肉眼或显微镜下观察，白色背景上的蓝色小点即为 GUS表达位点。
gluc（5-溴-4-氯-3-吲哚葡糖苷酸）作为底物可以精确地进
行活体GUS活性的定位。这一反应分两步进行：首先是切割 葡糖醛酸部分，产生无色的吲哚氧基中间产物，随后吲哚氧 基中间产物氧化成为不溶的蓝色沉淀。
用GUS进行这些实验有如下优点：1）大多数植物组织中GUS活
性的本底低；2）反应产物不扩散，在表达基因的植物细胞内积累； 3）通过简单的扩散或真空渗入，底物易被植物细胞吸收。当然，
0.1 mmol/l K4[Fe(CN)6].3H2O、1mmol/L EDTA
3．X-gluc母液：称取10mg X-gluc，溶于100μ l的N，N-二甲基甲酰胺
（DMF，C3H7NO），得到80㎎/ ml 的 X-gluc母液，-20℃保存。
4．X-gluc反应液：取6.5μ l X-gluc母液于500μ l buffer中
5．组织可在70%乙醇中保存数日。
一样，其检测结果不是定量的。
用于GUS染色的植物材料的制备方法因涉及的 特定组织和器官的不同而异。例如拟南芥的根、花
Байду номын сангаас
和叶片可以不做任何处理直接染色。但是像烟草和
马铃薯这些植物的茎和叶在染色前必须切成薄片。 有时特别是当操作大的组织样品时真空渗入法会有 所帮助。
实验材料和试剂
实验材料：转GUS基因的烟草叶片 试剂：
1．50mmol/l 磷酸钠缓冲液
A液：称NaH2PO4.2H2O 3.12g，定容100 ml 水中。 B液：称 Na2HPO4.12 H2O 7.17g，定容100 ml 水中。 取39 ml A液、61ml B液混匀
2．缓冲液：50mmol/l 磷酸钠缓冲液中含有0.1 mmol/l K3[Fe(CN)6]、