胶体金标记蛋白A技术(ProteinA-goldtechnique,PAg法)

液体配制：
1、胶体金稀释液配方：
那本书被木子用得很小心。袁慕野毕业要走的时候，木子去买了一块德芙巧克
的 0.02mo1／LTrisTBS 缓冲液，加入试剂级 卵清白蛋白至 1％。｛免疫电镜按 1：20-50 稀释， 淡红色为适宜稀释液,胶体金稀释后应于当天使 用，未用完的应该丢弃。｝
2、清洗液：
0.5mol／L，pH7.4Tris-Hcl 缓冲液：Tris， 60.57g，1mol／LHcl 约 420m1，调 pH 值至 7.4， 最后加双蒸水至 1000m1，此为储备液。
后染色。其主要区别于一般胶体金免疫染色在：
须 1% 卵 白 蛋 白 － PBs 或 1% 卵 白 蛋 白 0.05mol/lTris 缓冲液来封闭非特异性的结合部 位，而不是采用羊或其它的动物的正常抗血清， 因为 PAg 复合物能够与正常血清组中的 Ig 结合， 从而给出假阳性结果；②在应用第一抗血清孵育 和 PBS 冲洗后作第二抗血清即 PAg 复合物孵育前 的准备时，应用的 PBS 或 TBS 的 pH 应变更为 pH8.2。其它可参照本节中包埋后染色法进行。
4、将 PAg 原液稀释 10～20 倍，载网浮于该 液滴上，室温孵育 10min 至 1h。
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5、0.02mo1／LTBSpH8.2，洗 5min×3 次。0.05mo1／LTBSpH7.4，洗 5min×3 次。 最后切片浸于 0.05m01／LTBSpH7.4 缓冲液中， 送电镜室处理。
将免疫组织化学技术与电子显微镜技术相 结合，则可以利用电子显微镜高分辨率的优点， 在超显微结构水平定位细脑内的特异性抗原。为 疾病的病因、发病机理、组织来源等方面的探索 研究，为提高疾病的认识与诊断提供可靠的手 段。
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四、电子染色以及电镜观察：
1、5%醋酸铀染 5min，然后用双蒸水洗。
2、枸橼酸铀染色 5min，双蒸水洗净。
3、H－600 透射电镜观察。 免疫胶体金试验成功的要求：
抗体高度特异性和亲和力以及被检组织内 抗原含量高；标本的前处理和染色也至关重要。
取消锇酸后固定，聚合温度不宜高于 45 度， 可以选用 37 度 12 小时，45 度 48 小时作为聚合 温度。试验全过程应保持网面的湿润。缓冲液要 清洁，最好用新鲜配制的或经微孔滤纸过滤后使 用。
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对中枢神经系统切片，有主张以 1%过碘酸钾代替 H2O2 的。
2、双蒸水洗 3 次，每次 10min，第 1，2 次 浮于液滴上清洗，第 3 次以盛双蒸水的注射器沿 镍网面冲洗，水流应有适当压力，但不宜过高强， 用滤纸在网缘将水吸干。(0.05mo1／LTBSpH7.4 洗 5min×3 次?)
染色前所用器皿必须清洁干净且专用，并用 双蒸水冲洗三遍，染色程序中的洗涤必须充分， 以减少背景染色。尤其双重免疫标记的切片染色
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时，第一次金标二抗孵育后必须充分洗涤，以不 影响第二次金标二抗的反应结果。摘自:贾云香, 卓夏阳,顾云娣.双重胶体金标记的免疫电镜技 术.江西医学院学报,2003,43(4):22-24
三、封闭以及免疫反应：
1、载有超薄片的镍网或金网浮于 1%卵白蛋 白－TBS 液滴上，室温约 1h，阻断非特异性吸附，
吸去多余血清，不洗。
2、载网直接移至第一抗血清液滴上(抗体稀 释度较常规免疫组化低 l 倍)，在室温孵育 2h 或 4℃18～24h。
3、0.05mo1／LTBSpH7.4，洗 5min×3 次。0.02mo1／LTBSPH8.2，洗 5min×3 次。 1％卵清白蛋白 0.02mo1／LTBS37℃孵育 lh，再 次阻断非特异性吸附，吸去多余液体，不洗。
3、H2O2 的配制:3%H2O2
4、8％过碘酸钠水溶液
5、封闭液：
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前封闭液：1%卵白蛋白 0.05mo1／LTris 缓 冲液；
后封闭液以及胶体金稀释液：1%卵白蛋白 0.02mo1／LTris 缓冲液，后封闭为胶体金结合作 准备。
具体操作:
一、包埋：
常规电镜制样，样品只需要戊二醛固定，不 需要锇酸后固定。丙酮梯度脱水时 70％的丙酮中
没有添加染色剂。样品于 37 度烘箱中固化。
二、切片：
超薄切片厚 50～70nm 左右，载于 300 网孔 的镍网上。
抗原修复：
1、置 1%H2O2 内 10min 至 1h，以去锇酸和增 进树脂穿透性，有利抗体进入。如切片很薄或于 低温包埋时，此步可省略。操作时，滴入 1%H2O2 液 1 滴于蜡板上，将网的载片面轻浮于液滴上。
0.05mo1／LTris 缓冲生理盐水：氯化钠 8.5-9g；0.5mo1／L，pH7.4Tris-Hcl 缓冲液 100m1；加双蒸水至 1000m1，调 pH 值至 7.4。
0.02mo1／LTris 缓冲生理盐水：氯化钠 8.5-9g； o.5mo1／L， pH7.4Tris-Hcl 缓冲液 40m1， 加双蒸水至 l000m1，调 pH 值至 8.2。
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1ci0f6c7b 金世豪/
关键词：胶体蛋白标记胶体金标记蛋白 A 技 术 ProteinA-goldtechniquePAg 法胶体金 PAg 复 合物制备方法简便，作为第二抗体，无种属特异 性，可以免去不同种属动物要制备不同的特异性 免疫球蛋白。PAg 复合物与包埋剂和细胞成分都 极少发生非特异性的交互作用，蛋白 A 和金粒间 非共价的结合特性既不影响蛋白 A 的活性，又能 保持高度的稳定性，PAg 复合物分子最小易于穿 透组织。PAg 复合物的原液在 4℃可保存达一年 之久。电镜水平的 PAg 染色法 PAg 法在电镜技术 的应用原则是二步标记法，可用于包埋前和包埋