sCAR—PPAb基因的原核表达载体构建及重组蛋白的表达纯化
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浙江理 工大学 学报 ， ２ 第 ７卷 ， ２期 ，０ ０ ３月 第 ２１ 年
Ｊ ｕ ｎ ｌ ｆ ｈ ｊ ｎ ｃ ＴｅｈＵｎｖ ｒｉ ｏ ｒ ａ ｏ ｅ ａ ｇＳ ｉ ｃ ｉｅｓ ｙ Ｚ ｉ — ｔ
Ｖｏ． ７ １２ ，Ｎｏ ２，Ｍ ａ ． ２ １ ． ｒ ００
文章 编 号 ：１７ －８ １（Ｏ Ｏ ０— ３ ８０ ６ ３３ ５ ２ １ ） ２ ０ １—５
并结 合甘露糖 ［ ， ５ 其特 有的糖 结合特性 为分 析各种肿 瘤细 胞表 面糖 链结 构 变化 及 对肿 瘤 恶化 、 ］ 迁移 、 后等 预
方 面的研究提 供有用 的工具 ＿ 。 ６ ｊ
掌 叶半夏蛋 白有 ３个保守 的甘露糖 结合 位点 ， 发 现 Ｐ Ａ 蛋 白前 体含 有两 个 结构 域［ ， 研究 Ｐ ７ 经过 蛋 白剪 ］ 接 修饰成 两个不 同 的亚基 Ａ（ 一个 甘露糖结 合位点 ） 含 和亚基 Ｂ（ 两个 甘露 糖 结合 位 点 ） 两个 １ Ｄ 的亚 含 ， ２ｋ 基 Ａ 和 两 个 １ Ｄ 的 亚 基 Ｂ再 组 成 分 子 量 约 为 ４ Ｄ 的 异 四 聚体 ， 甘 露 糖 结 合 位 点 为 保 守 的序 列 ２ｋ Ｏｋ 其 ＱＸ ＮＸ Ｙ， ＤＸ ＶＸ 同源性 分析 表明亚 基 Ｂ（ ｏ ｉＢ 为识 别 甘露 糖 的亚 基 ＿ ］ Ｄ ｍａ ） ｎ ８ 。可 以应 用 于恶 性 肿瘤 细 胞膜
通 讯 作 者 ： 恭 楚 ， 子 邮箱 ： ｃ ｓｕ ｅｕ ｃ 李 电 ｌ ＠ｚｔ．ｄ ．ｒ ｇ ｌ
第 ２期
李 娜等： Ａ Ｐ ｂ ｓ ＲＰ Ａ 基因的原核表达载体构建及重组蛋白的表达纯化 Ｃ
３９ １
１ 材
料
１１ 载 体 、 ． 菌及 细胞 ｐ ３ ＱＥ Ｏ载体 、 大肠 杆菌 Ｍ１ ５购 自 Ｎｏ ａ ｅ ｖ ｇ ｎ公 司 ， 大肠 杆 菌 ＤＨ５ 为 浙江 理 工大学生 命科 学 学 院实 验室 ａ 保存 。ｐ ３ Ｃ ＱＥ Ｏｓ ＡＲ表 达载 体 、 ＧＦ ＡｄＥ Ｐ病毒 为 本课 题 组 构 建 。Ｋａｕ ｓ ｍｉ １细胞 由浙 江 大学 钱 文斌 教授 惠
糖链 的识别［］ 。本研究 将 Ｐ Ａ 的亚基 Ｂ Ｐ Ａｂ序 列克 隆人 带 有六 聚 组氨 酸 （ ×Ｈｉ 纯 化标 签且 有 腺病 Ｐ （Ｐ ） ６ ｓ ） 毒受体 Ｃ ＡＲ序列 的原核表 达载体 ｐ ３—Ｃ ＱＥ Ｏｓ ＡＲ 中， 功地表 达和纯 化 了重 组 ｓ ＡＲＰ Ａ 亚基 Ｂ融合 蛋 白 成 Ｃ －Ｐ
后荻得工程茵。该 菌株经 ＩＴ Ｐ Ｇ诱导后 ， 高效表 达 出带有 组氨酸 标签 以包涵体 形式存在 的融合蛋 白 ｓ Ａ ＿Ｐ 。 ｃ Ｒ Ｐ Ａｂ
包 涵体 经过 尿 素 变性 溶 解 、Ｂ Ｐ Ｓ稀 释 复性 、 ｉ Ｎ 离子 亲 和 层 析 柱 纯 化 ， 得 目的 蛋 白 。ｓ Ｐ ＧＥ及 Ｗ ｅｔｒ ｌｔｎ 获 Ｄ Ａ ｓ ｎｂｏｔ ｇ ｅ ｉ
分析表 明， ４ Ｄ左右 有一条 明显 的特异性 蛋 白条带 。同时细胞 实验 结果表 明融合蛋 白 ｓ Ａ － Ｐ ｂ能提 高 在 ２ｋ Ｃ Ｒ ＰＡ
ＡｄＥ Ｆ 对 Ｋ ｓ ｍｉ —Ｇ Ｐ ａ ｕ － 感 染效 率 。 １的
关键词 ： Ｐ ｓ Ａ —Ｐ Ｐ Ａ； Ｃ Ｒ Ｐ Ａｂ融 合蛋 白 ；亲 和层 析
摘
要： 为获得腺 病毒 受体 ｓ ＡＲ与 掌叶半夏蛋白（ Ｐ 的亚基 Ｂ Ｐ Ａｂ 的融合蛋 白， Ｐ Ａ６基因克隆入 已 Ｃ Ｐ Ａ） （Ｐ ） 将 Ｐ
构 建 的 原核 表 达 栽 体 ｐ ３一Ｃ Ｒ 中 ， Ｐ Ｒ和 测 序 鉴 定 正确 的重 组 质 粒 ｐ ３ 一Ｃ ＿Ｐ ， 化 大 肠杆 菌 Ｍ１ ＱＥ ０ｓ Ａ 经 Ｃ ＱＥ ０ｓ ＡＲＰ Ａｂ 转 ５
ｓ ＝Ｐ Ａ Ｃ ｆ Ｐ ｂ基 因 的原 核 表 达 载 体 构 建 ｝ 一 及 重 组 蛋 白 的 表 达 纯 化
李 娜 。王双 辉 ， 学 田 ， 艳 红 ， 岳 张 仰 毅 ， 玉梅 ， 武 李 新， 牛 娜 ， 恭 楚 李
（ 江 理 工 大 学 生命 科 学 学 院 ，杭 州 ３ ０ １ ） 浙 １ ０ ８
中 图分 类 号 ： ３３ ２ Ｒ７—６
文 献 标 识码 ：Ａ
０ 引 言
白血病 （ ｅ ｋ ｍｉ） Ｌ ｕ ｅ ａ 是造血 系统 的原发恶 性 肿瘤 ， 容易 发 生全 身 多脏 器 的转 移 和 浸润 ， 过 程与 细胞 很 该
膜 表面糖蛋 白及糖链 结构变 化有关 ＿ ］ ｌ 。由于血液 细胞 及 白血 病 细胞 表 面均 缺乏 柯 萨奇一 病毒 受体 （ ｏ — 腺 Ｃ ｘ
ｓｃ ｉ ｄｎ ｖｒｓｒｃｐｏ ， ＡＲ）因此 限制 了 ５型腺 病 毒 载 体 应 用 于 白血病 的 治疗 ］ ａｋ ａｅｏｉ ｅｅｔｒ Ｃ ｕ ， 。 。掌 叶半 夏 蛋 白 （ ｎｌａＰ ｄ ｔ ｅｔ ｇｕｉｉ， Ｐ 是 存在 于掌 叶半 夏 中的单 子 叶甘露糖 型植物 凝集素 ， Ｐｉｅｌ ｅａｉ ｃ Ａｇ ｌｔ ｎ Ｐ Ａ） ｉ ｓ ａ ｎ 能特异性 识别
Βιβλιοθήκη Baidu收稿 日期 ：２Ｏ 一Ｏ — １ ０９ ３ ６ 基 金 项 目 ：国家 自然科 学 基 金 （０ ０３ ９ ３ ８ ０ ９ ）浙 江 省 生 物 医药 工 程 重 中之 重 学 科 开 放 基 金 （Ｗ ＹＸ ８ ４ ３ ８ １ ７ ，０ ０ ０ ３ ； Ｓ ００）
作者简介 ： 李
娜（ ９２ ， ， １８ 一）女 山东临沂人 ， 硕士研究生 ， 研究方 向为肿瘤的靶 向基 因一病毒治疗 。
（Ｃ － Ｐ ） 该融合 蛋 白的 ｓ ＡＲ部分 可与 ５型腺病 毒结 合 ， 基 Ｂ部 分 与 白血 病细 胞 表 面的甘 露糖 结 ｓ ＡＲ Ｐ Ａｂ ， Ｃ 亚
合 ， 而介导 ５型腺病 毒 ＡｄＥ Ｐ标记 细胞 表 面暴 露甘 露糖 基 的 白血 病细 胞 。为 开展 以甘 露糖 为 靶点 筛 从 —ＧＦ 选具 有高 甘露糖 型而低 Ｃ ＡＲ受体 的 白血病细胞 ， 研究 此类细 胞在肿 瘤发生 、 转移 中的作用 奠定 基础 。
Ｊ ｕ ｎ ｌ ｆ ｈ ｊ ｎ ｃ ＴｅｈＵｎｖ ｒｉ ｏ ｒ ａ ｏ ｅ ａ ｇＳ ｉ ｃ ｉｅｓ ｙ Ｚ ｉ — ｔ
Ｖｏ． ７ １２ ，Ｎｏ ２，Ｍ ａ ． ２ １ ． ｒ ００
文章 编 号 ：１７ －８ １（Ｏ Ｏ ０— ３ ８０ ６ ３３ ５ ２ １ ） ２ ０ １—５
并结 合甘露糖 ［ ， ５ 其特 有的糖 结合特性 为分 析各种肿 瘤细 胞表 面糖 链结 构 变化 及 对肿 瘤 恶化 、 ］ 迁移 、 后等 预
方 面的研究提 供有用 的工具 ＿ 。 ６ ｊ
掌 叶半夏蛋 白有 ３个保守 的甘露糖 结合 位点 ， 发 现 Ｐ Ａ 蛋 白前 体含 有两 个 结构 域［ ， 研究 Ｐ ７ 经过 蛋 白剪 ］ 接 修饰成 两个不 同 的亚基 Ａ（ 一个 甘露糖结 合位点 ） 含 和亚基 Ｂ（ 两个 甘露 糖 结合 位 点 ） 两个 １ Ｄ 的亚 含 ， ２ｋ 基 Ａ 和 两 个 １ Ｄ 的 亚 基 Ｂ再 组 成 分 子 量 约 为 ４ Ｄ 的 异 四 聚体 ， 甘 露 糖 结 合 位 点 为 保 守 的序 列 ２ｋ Ｏｋ 其 ＱＸ ＮＸ Ｙ， ＤＸ ＶＸ 同源性 分析 表明亚 基 Ｂ（ ｏ ｉＢ 为识 别 甘露 糖 的亚 基 ＿ ］ Ｄ ｍａ ） ｎ ８ 。可 以应 用 于恶 性 肿瘤 细 胞膜
通 讯 作 者 ： 恭 楚 ， 子 邮箱 ： ｃ ｓｕ ｅｕ ｃ 李 电 ｌ ＠ｚｔ．ｄ ．ｒ ｇ ｌ
第 ２期
李 娜等： Ａ Ｐ ｂ ｓ ＲＰ Ａ 基因的原核表达载体构建及重组蛋白的表达纯化 Ｃ
３９ １
１ 材
料
１１ 载 体 、 ． 菌及 细胞 ｐ ３ ＱＥ Ｏ载体 、 大肠 杆菌 Ｍ１ ５购 自 Ｎｏ ａ ｅ ｖ ｇ ｎ公 司 ， 大肠 杆 菌 ＤＨ５ 为 浙江 理 工大学生 命科 学 学 院实 验室 ａ 保存 。ｐ ３ Ｃ ＱＥ Ｏｓ ＡＲ表 达载 体 、 ＧＦ ＡｄＥ Ｐ病毒 为 本课 题 组 构 建 。Ｋａｕ ｓ ｍｉ １细胞 由浙 江 大学 钱 文斌 教授 惠
糖链 的识别［］ 。本研究 将 Ｐ Ａ 的亚基 Ｂ Ｐ Ａｂ序 列克 隆人 带 有六 聚 组氨 酸 （ ×Ｈｉ 纯 化标 签且 有 腺病 Ｐ （Ｐ ） ６ ｓ ） 毒受体 Ｃ ＡＲ序列 的原核表 达载体 ｐ ３—Ｃ ＱＥ Ｏｓ ＡＲ 中， 功地表 达和纯 化 了重 组 ｓ ＡＲＰ Ａ 亚基 Ｂ融合 蛋 白 成 Ｃ －Ｐ
后荻得工程茵。该 菌株经 ＩＴ Ｐ Ｇ诱导后 ， 高效表 达 出带有 组氨酸 标签 以包涵体 形式存在 的融合蛋 白 ｓ Ａ ＿Ｐ 。 ｃ Ｒ Ｐ Ａｂ
包 涵体 经过 尿 素 变性 溶 解 、Ｂ Ｐ Ｓ稀 释 复性 、 ｉ Ｎ 离子 亲 和 层 析 柱 纯 化 ， 得 目的 蛋 白 。ｓ Ｐ ＧＥ及 Ｗ ｅｔｒ ｌｔｎ 获 Ｄ Ａ ｓ ｎｂｏｔ ｇ ｅ ｉ
分析表 明， ４ Ｄ左右 有一条 明显 的特异性 蛋 白条带 。同时细胞 实验 结果表 明融合蛋 白 ｓ Ａ － Ｐ ｂ能提 高 在 ２ｋ Ｃ Ｒ ＰＡ
ＡｄＥ Ｆ 对 Ｋ ｓ ｍｉ —Ｇ Ｐ ａ ｕ － 感 染效 率 。 １的
关键词 ： Ｐ ｓ Ａ —Ｐ Ｐ Ａ； Ｃ Ｒ Ｐ Ａｂ融 合蛋 白 ；亲 和层 析
摘
要： 为获得腺 病毒 受体 ｓ ＡＲ与 掌叶半夏蛋白（ Ｐ 的亚基 Ｂ Ｐ Ａｂ 的融合蛋 白， Ｐ Ａ６基因克隆入 已 Ｃ Ｐ Ａ） （Ｐ ） 将 Ｐ
构 建 的 原核 表 达 栽 体 ｐ ３一Ｃ Ｒ 中 ， Ｐ Ｒ和 测 序 鉴 定 正确 的重 组 质 粒 ｐ ３ 一Ｃ ＿Ｐ ， 化 大 肠杆 菌 Ｍ１ ＱＥ ０ｓ Ａ 经 Ｃ ＱＥ ０ｓ ＡＲＰ Ａｂ 转 ５
ｓ ＝Ｐ Ａ Ｃ ｆ Ｐ ｂ基 因 的原 核 表 达 载 体 构 建 ｝ 一 及 重 组 蛋 白 的 表 达 纯 化
李 娜 。王双 辉 ， 学 田 ， 艳 红 ， 岳 张 仰 毅 ， 玉梅 ， 武 李 新， 牛 娜 ， 恭 楚 李
（ 江 理 工 大 学 生命 科 学 学 院 ，杭 州 ３ ０ １ ） 浙 １ ０ ８
中 图分 类 号 ： ３３ ２ Ｒ７—６
文 献 标 识码 ：Ａ
０ 引 言
白血病 （ ｅ ｋ ｍｉ） Ｌ ｕ ｅ ａ 是造血 系统 的原发恶 性 肿瘤 ， 容易 发 生全 身 多脏 器 的转 移 和 浸润 ， 过 程与 细胞 很 该
膜 表面糖蛋 白及糖链 结构变 化有关 ＿ ］ ｌ 。由于血液 细胞 及 白血 病 细胞 表 面均 缺乏 柯 萨奇一 病毒 受体 （ ｏ — 腺 Ｃ ｘ
ｓｃ ｉ ｄｎ ｖｒｓｒｃｐｏ ， ＡＲ）因此 限制 了 ５型腺 病 毒 载 体 应 用 于 白血病 的 治疗 ］ ａｋ ａｅｏｉ ｅｅｔｒ Ｃ ｕ ， 。 。掌 叶半 夏 蛋 白 （ ｎｌａＰ ｄ ｔ ｅｔ ｇｕｉｉ， Ｐ 是 存在 于掌 叶半 夏 中的单 子 叶甘露糖 型植物 凝集素 ， Ｐｉｅｌ ｅａｉ ｃ Ａｇ ｌｔ ｎ Ｐ Ａ） ｉ ｓ ａ ｎ 能特异性 识别
Βιβλιοθήκη Baidu收稿 日期 ：２Ｏ 一Ｏ — １ ０９ ３ ６ 基 金 项 目 ：国家 自然科 学 基 金 （０ ０３ ９ ３ ８ ０ ９ ）浙 江 省 生 物 医药 工 程 重 中之 重 学 科 开 放 基 金 （Ｗ ＹＸ ８ ４ ３ ８ １ ７ ，０ ０ ０ ３ ； Ｓ ００）
作者简介 ： 李
娜（ ９２ ， ， １８ 一）女 山东临沂人 ， 硕士研究生 ， 研究方 向为肿瘤的靶 向基 因一病毒治疗 。
（Ｃ － Ｐ ） 该融合 蛋 白的 ｓ ＡＲ部分 可与 ５型腺病 毒结 合 ， 基 Ｂ部 分 与 白血 病细 胞 表 面的甘 露糖 结 ｓ ＡＲ Ｐ Ａｂ ， Ｃ 亚
合 ， 而介导 ５型腺病 毒 ＡｄＥ Ｐ标记 细胞 表 面暴 露甘 露糖 基 的 白血 病细 胞 。为 开展 以甘 露糖 为 靶点 筛 从 —ＧＦ 选具 有高 甘露糖 型而低 Ｃ ＡＲ受体 的 白血病细胞 ， 研究 此类细 胞在肿 瘤发生 、 转移 中的作用 奠定 基础 。