石蜡切片免疫荧光染色方法精修订
石蜡包埋组织免疫荧光染色的技术改进
石蜡包埋组织免疫荧光染色的技术改进发表时间：2013-04-11T14:06:13.500Z 来源：《医药前沿》2013年第4期供稿作者：陈琼霞陈莹黄萱刘丽江[导读] 石蜡包埋组织的免疫荧光染色技术，在基础研究以及临床病理诊断中仍发挥着重要的作用。
陈琼霞1 陈莹1 黄萱2 刘丽江2（通讯作者）（1江大病理诊断所技术部湖北武汉 430056）（2江大病理诊断所组织病理诊断部湖北武汉 430056）【摘要】目的探讨抗原修复方法在石蜡包埋组织免疫荧光染色中的应用。
方法石蜡切片经0.2%Triton X-100和0.5%Triton X-100梯度去垢剂（细胞表面活化剂）处理后，进行免疫荧光染色。
结果免疫荧光染色结果定位明确，无扩散效应和非特异性着色。
其染色强度接近石蜡包埋切片的免疫组化染色效果。
结论低浓度梯度去垢剂Triton X-100进行抗原修复，技术方法简单可行。
【关键词】免疫荧光染色抗原修复【中图分类号】R319 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2013）04-0368-02 石蜡包埋组织的免疫荧光染色技术，在基础研究以及临床病理诊断中仍发挥着重要的作用。
尤其是在多重标记物的定位、膜抗原的鉴定、抗体的类型（荧光标记抗体）、微量蛋白质的定位以及肾穿刺组织活检的病理诊断中具有非常重要的地位。
但是，组织经过福尔马林固定后，在固定的过程中Ca2+和其他二价离子与蛋白质所形成的紧密复合物，封闭了抗原，导致在石蜡切片上进行免疫荧光染色时，抗原抗体的结合受阻，直接影响染色结果的特异性和敏感性[1]。
在临床的实际工作中，常常又会遇到只有石蜡包埋的材料，而又必须进行免疫标记的情况。
如：肾穿刺活检组织冰冻切片中没有肾小球，不得不在石蜡包埋组织中解决诊断的问题等等[2-3]。
因此，在技术上解决石蜡包埋组织的免疫荧光染色问题，具有非常重要的临床应用价值。
我们采用去垢剂修复抗原法对石蜡切片进行抗原修复后，再行免疫荧光染色，取得了比较好的效果。
免疫组化染色(石蜡切片)操作步骤及结果分析方法(精髓版)
免疫组化染色（石蜡切片）操作步骤及结果分析方法一、原理及应用免疫组化，简单说是用标记的抗体对组织中相应抗原进行定位、定性和部分定量的分析。
二、操作步骤：（1）将石蜡组织切片置于65°C恒温箱，烤片1h左右。
（2）脱蜡：二甲苯I 10min→二甲苯II 10min →梯度酒精（由高到低）各5min。
（3）1×PBS 洗涤3次，每次 5min。
（4）0.5% Triton X-100通透（PBS配制），目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。
Triton X-100 可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。
当然了，如果检测的是膜抗原无需通透，忽略该步骤。
（4）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火 3min，之后转成低火 15-30min。
注：福尔马林或多聚甲醛固定，会导致蛋白交联，而解交联的过程称为抗原修复。
所以冰冻切片不需要抗原修复！！抗原修复方法有多种，一般包括两大类：酶抗原修复(胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K) 热抗原修复(高压蒸汽法、微波法、水浴加热法)。
微波法最为常用。
（5）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（6）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。
（7）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（8）使用1% BSA 进行室温封闭30min，用于封闭非特异性抗原表位。
（9）根据抗体说明书使用合适浓度的特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜孵育。
（10）次日取出切片，室温下复温30min。
（11）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（12）按照免疫组化二抗试剂盒说明书操作。
（13）DAB 显色：DAB 显色液按说明书配制，使用时滴加到血管组织上，显微镜下观察并计时，待目的蛋白显色呈棕黄色时结束显色。
（14）苏木素染细胞核：苏木素染液5-10min（根据苏木素染液使用时间的长短，来调整染色时间）→ 流水清洗1min→ 1%盐酸酒精分化瞬时→ 流水清洗1 min→1%氨水反蓝瞬时→流水清洗1min。
石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法
石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法
一、石蜡切片免疫组化技术
石蜡切片免疫组化方法是一种流行的染色技术，它利用抗原特异性抗
体结合抗原将一种特定蛋白质标记出来，然后对组织交叉剥离切片进行染色，得到对特定抗原的特异性染色，进而可以测定组织中其中一蛋白质的
分布情况及其表达水平。
石蜡切片免疫组化方法主要分为热稳定抗原抗体
保护法、热稳定化学法和抗原保护法三种。
1.热稳定抗原抗体保护法
热稳定抗原抗体保护法又称抗原连接法，它是最常用的一种免疫组化
技术，依赖高温对抗原的特殊保护作用。
其原理是经过化学固定的组织切片，在石蜡上产生隆起；然后用高温阳性抗体（双抗体）将抗原完全覆盖，并产生痕迹，这样便可清楚地观察抗原的分布情况；此外，在有抗原保护
的条件下，抗原保护的组织切片可以用客体抗体染色。
2.热稳定化学法
热稳定化学法是一种特殊的抗原保护法，也是最常用的石蜡免疫染色
技术。
免疫荧光染色步骤
免疫组织化学染色步骤1．将石蜡切片二甲苯脱蜡（二甲苯Ⅰ20→二甲苯Ⅱ10）、入水（100%酒精Ⅰ5→100%酒精Ⅱ3→95%酒精2→80%酒精1→70%酒精1），蒸馏水冲洗后，0.01M 冲洗，5×3次；2．枸橼酸盐缓冲液微波抗原修复，加热使水温达92-96℃，维持10-15，自然冷却至室温，0.01M 冲洗，5×3次；3．32O 2溶液，37℃，20 ，以消除内源性过氧化物酶的活性，0.01M 冲洗，5×3次；4．正常羊血清封闭，37℃，30 ；5．倾去多余血清，滴加一抗，37℃2小时或者4℃过夜，0.01M 冲洗，5×3次；6．滴加二抗工作液，37℃，30 ，0.01M 冲洗，5×3次；7．滴加三抗工作液，37℃，30 ，0.01M 冲洗，5×3次；8．避光显色，显微镜下控制显色时间；9．0.01M 终止显色；10．梯度酒精脱水（70%酒精1→80%酒精1→95%酒精Ⅰ1→ 95%酒精Ⅱ1→无水酒精Ⅰ10→无水酒精Ⅱ10），二甲苯透明（二甲苯Ⅰ15→二甲苯Ⅱ10；11．中性树胶封片。
免疫荧光染色步骤(1)将组织切片脱蜡入水；(2)抗原微波修复，温度92℃-96℃，10-15，自然冷却至室温；(3)正常羊血清封闭，37℃，60 ；(4)倾去多余血清，滴加一抗，37℃2小时或者4℃过夜，冲洗，5×3次；(5)滴加荧光素标记的二抗，避光，37℃，60 ，0.01M 冲洗，5×3次；(6)防淬灭封片剂封片，4℃，避光保存。
(7)荧光显微镜观察拍照。
细胞免疫组化染色（培养板中染色）1．培养的细胞，弃去培养基，冷的洗两次，首先用4%多聚甲醛（4孔板200μl）固定10，洗2次，每次5－10分钟。
2．在含0.1% 100（4孔板200μl）的中进行10的透膜处理，洗2次，每次5-10分钟。
手动轻轻晃动数次，吸尽液体。
3．羊血清用配制成4％羊血清封闭液，室温封闭（4孔板200μl）30分钟。
石蜡切片病理、免疫组化及免疫荧光方案
石蜡切片病理、免疫组化及免疫荧光方案石蜡标本固定、脱水、包埋方法大鼠自心脏灌注4%多聚甲醛内固定1-2h后取材：取脑出血血肿处脑组织（厚度约3mm），置于塑料盒中并浸泡在4%多聚甲醛中固定，室温中固定时间12-48h，固定好的组织脱水前应流水冲洗30min-1h左右除去固定液，取固定好的脑组织标本脱水、包埋。
具体步骤按以下方法进行：此方法参考《组织病理学技术》周庚寅北京大学出版社 2006年⏹70%： 1h-2h⏹80%： 1h-2h⏹90%： 1h-2h⏹95%： 1h-2h⏹95%： 1h-2h⏹无水Ⅰ：30min-60min⏹无水Ⅱ：30min-60min⏹二甲苯及水水酒精 1：1混合液 30min⏹二甲苯Ⅰ：30min⏹二甲苯Ⅱ：30min⏹石蜡Ⅰ： 1h⏹石蜡Ⅱ： 1h⏹石蜡Ⅲ： 1h包埋：在病理科包埋方法基础上灵活改进：在包埋铁模具上进行，融蜡-放置组织于中央-扣包埋盒4℃冷却10min-撬蜡。
注意事项：1、固定液的种类：10%中性甲醛，4%的多聚甲醛最合适，在37°或室温中固定12-48h能很好保存抗原和抗体的反应能力，实验室用的更多的是在4℃冰箱中固定24h-3d。
有人建议中性甲醛40摄氏度固定2~3小时，流水冲洗20min-30min，这样可以缩短制片的时间。
2、熔蜡温度65 ℃左右；3、严格按照预定实验步骤进行，保证脱水及透明完全，透明后见云雾状说明脱水不完全，需退回无水酒精中返工。
4、经一级二甲苯透明后检查组织是否透明，二级二甲苯透明时间以具体时间而定。
5、注意及时更换梯度酒精及二甲苯（1月）。
组织石蜡切片摘自《免疫组织化学实验技术及应用》 P12 化学工业出版社20061.载玻片的处理：采用现成的APES处理过的硅化载玻片。
2.石蜡切片注意事项：1、用于免疫组化的蜡温应为56~58℃，切片水温为40℃左右，应先置于冷水中（冷水中可参入酒精有利快速展片-见相关方法），然后再移入热水中，这样可以使切片顺利展平；2、烤片时要注意：一般在62℃烤片30-60min，抗原较强的组织可在60摄氏度烤3~8h，抗原较弱的组织可于37℃的恒温箱内过夜；3、切片如需长期保存，可置于4℃或室温下，千万不可脱蜡后4℃保存，因脱蜡后失去了对抗原决定族的保护。
免疫组化和荧光步骤修改版
免疫荧光染色（全程避光）（1）切片晾干后用0.01mol/L PBS（PH值7.2－7.4）漂洗10min×3次；（2）0. 3％Trion-100溶液37℃25min；0.01mol/LPBS漂洗10min×3次；（3）滴加5％BSA37℃封闭抗原25min，甩去多余液体，不洗；（4）滴加用1％封闭血清稀释的一抗50ul/张，置4℃冰箱40－48hr。
PBS洗10min×3次；（5）滴加1％封闭血清稀释的荧光二抗羊抗兔，室温下2h；PBS洗5min×2次；晾干，60％甘油封片。
荧光双标步骤同上，仅在滴加一抗和二抗时分别将两种一抗和二抗一起加入。
但两种一抗需种属来源不同。
1.用0.01 mol/L PBS漂洗3×10 min2. 3 mL/L Triton X-100漂洗10 min。
3.正常羊血清封闭30 min。
4.一标一抗兔抗GFAP (北京中杉)孵育液,稀释度为1∶50，37℃孵育1h,室温过夜（室温24~48 h）。
5.用0.01 mol/L PBS漂洗3×10 min，6.加入FITC标记的山羊抗兔IgG(北京中杉)荧光二抗,稀释度为1：50,37℃孵育1 h，0.01 mol/LPBS洗10×3 min。
7.捞片,阴干,甘油封片。
冰冻切片免疫组化染色步骤：（SP试剂盒为例)1.冰冻切片4~8um，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。
2.用3％过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。
3.PBS洗，5分钟×2。
4.5~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。
倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。
5.PBS冲洗，5分钟×3次。
6.滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。
石蜡切片免疫荧光染色方法
石蜡切片免疫荧光染色方法1.组织固定将待染的组织标本取出，用生理盐水或磷酸盐缓冲液进行冲洗，以去除血液和其他污染物。
然后用组织固定剂（如4%的多聚甲醛）进行固定，时间一般为12-24小时。
固定后，将组织转移到30%蔗糖缓冲液中，保持在4°C下过夜。
2.组织包埋将固定后的组织进行脱水和透明化处理。
首先用70%乙醇进行脱水，然后使用95%和100%的乙醇进行脱水，每个浓度的乙醇浸泡时间为30分钟。
接下来，用细胞脱水剂（如xylene）进行透明化处理，每次浸泡30分钟。
最后，将组织置于石蜡中，使其逐渐浸透，浸泡时间一般为12-24小时。
3.组织切片将石蜡浸透的组织取出，固定在切片架上。
使用旋转切片机将组织切成5-10微米厚的切片。
切好的切片用除去石蜡的溶剂（如xylene）处理，然后通过悬浮在磷酸盐缓冲液中移至玻璃切片上。
4.抗原修复在切片上涂抹抗原修复液，将其加热至适当温度进行修复，以恢复组织中的抗原活性。
不同的修复条件适用于不同的抗原修复液，一般修复温度为95°C，时间为20-30分钟。
修复后，将切片用磷酸盐缓冲液冲洗数次。
5.抗体染色在切片上涂抹首要抗体（抗体与所要检测的抗原有特异性结合）。
将切片置于湿润箱中，室温孵育1小时，或在4°C下孵育过夜。
然后，用PBS缓冲液冲洗切片，以去除未结合的抗体。
接下来，涂抹荧光标记的二抗（与首要抗体结合的二抗），并孵育30分钟。
6.荧光显微镜观察将切片加装到玻璃片上，并用适当的荧光封装剂封盖。
使用荧光显微镜观察切片，观察和记录荧光信号和组织结构。
注意事项：1.在操作过程中，要严格避免组织检测和悬浮液受到光照。
2.切片机和刀片必须保持清洁和尖锐，以确保切片的质量。
3.在染色过程中，要注意温度和时间的控制，以保证染色效果。
4.切片和显微镜观察时，要确保显微镜的光源和滤光片与所使用的荧光标记相匹配。
5.进行染色之前，要检查抗体的适用性和浓度，以确保染色结果的准确性和可靠性。
石蜡切片免疫荧光染色方法审批稿
石蜡切片免疫荧光染色方法审批稿摘要：免疫荧光染色是一种通过免疫反应将抗原与特异性抗体结合并用荧光标记显示的技术。
本审批稿介绍了一种使用石蜡切片进行免疫荧光染色的方法，包括样品处理、抗体选择、标记物选择等。
该方法具有操作简单、结果准确等优点，适用于石蜡切片的免疫染色分析。
关键词：免疫荧光染色、石蜡切片、抗体、标记物引言：免疫荧光染色是一种常用的细胞和组织学研究方法，通过特异性抗体与抗原结合并使用荧光标记物显示的技术。
在研究细胞或组织的分布、定位和相互关系等方面具有很高的准确性和敏感性。
然而，在使用石蜡切片进行免疫荧光染色时，存在一些挑战，包括固定、脱脂和脱水的过程对抗原的破坏，以及石蜡对抗体的影响等。
因此，合理选择方法和条件对于免疫染色的成功至关重要。
方法：1.样品处理：a.取石蜡切片，去除石蜡：将石蜡切片浸于2次苯脱蜡液中，每次15分钟b.脱水和再水化：将切片浸入浓缩乙醇（如100%和95%）并保持5分钟，然后再用蒸馏水漂洗2次c.抗原修复：将切片浸入抗原修复液中，在高压加热或微波辅助下进行抗原修复，确保切片上抗原的发现和杀伤程度小于25分钟d.脱脂和再水化：重复步骤1b中的操作2.抗体选择：a.选择特异性抗体：根据研究目的选择特定的抗体，确保免疫染色的特异性b.分辨率标记：选择合适的荧光标记物，以获得清晰的图像和高分辨率c.防止非特异性结合：添加适当的阻断缓冲液以防止非特异性抗体结合3.免疫染色：a.准备工作液：配制适当浓度的抗体溶液，并在最佳条件下进行稀释b.添加抗体：将工作液添加到处理好的石蜡切片上，并保持在适当的温度下孵育c.清洗：使用PBS或TBS缓冲液，将上述切片清洗3次d.核染色：使用DAPI等核染色剂染色，以便确定细胞核的位置e.盖玻片：将切片封装到适当尺寸的盖玻片上，并用包固定剂封装结果与讨论：结论：石蜡切片免疫荧光染色方法为免疫染色提供了一种有效的选择。
通过合理选择方法和条件，可以成功地在石蜡切片上进行免疫染色，获得准确和可靠的结果。
石蜡切片免疫荧光实验步骤
石蜡切片免疫荧光实验步骤
一、样品处理
1、选择适当体积的样品石蜡切片，防止干燥，封好盖子到-80℃，直
到使用时将其取出变性到室温，以备后续操作。
2、室温下取出石蜡切片，施加蛋白酶将切片上原有的细胞、细胞膜
分解，具体操作步骤为：将取出的石蜡切片放入0.1%胰蛋白酶(Protease，Roche)或0.5% Triton X-100溶液中，置于37℃水浴摇床，25min后将石
蜡切片放入3mm×2mm的转移槽内，加入200ul去离子水，搅拌进行超声
处理，30s后用1000ul去离子水冲洗，放入4℃冰箱保存，以备后续操作。
二、组织切片染色
1、在刻线玻片上放入石蜡切片，用吸水棉柱将石蜡切片固定。
2、用0.1%胰蛋白酶(Protease, Roche)或0.3% Triton X-100溶液
浸泡石蜡切片，置于37℃水浴摇床，15min后去除液体，另用500μl去
离子水洗涤，将含有抗体的抗体溶液稀释至0.3μg/ml，加入石蜡切片上，放入35℃恒温箱，反应1h。
3、取出石蜡切片，加入1000μl去离子水洗涤，放入4℃冰箱保存，以备后续操作。
三、免疫荧光检测
1、把石蜡切片放入适量的去离子水中浸泡，去除多余的抗体。
2、将放入去离子水中浸泡的石蜡切片放入多孔玻片，在摇床上稀释FITC标记的抗体，加入石蜡切片上，置于37℃水浴摇床上，1h后去除液体。
石蜡切片免疫荧光组化
免疫荧光组化（IHC）1.脱蜡Ⅰ二甲苯：3 minⅡ二甲苯：3 min1:1二甲苯：无水乙醇：3 min2.复水Ⅰ无水乙醇：3 minⅡ无水乙醇：3 min95%乙醇：3 min70%乙醇：3 min50%乙醇：3 min30%乙醇：3 min3.流动的自来水冲洗：5 min（在水龙头上接一个软管，水流放慢，注意管口要放在载玻片反面）4.抗原修复：20 min用双蒸水配制新鲜的10 mM的二水柠檬酸三钠，调节PH=6，加入0.05%的吐温20，将配制好的柠檬酸盐溶液加到染色缸内，放入玻片（带架子），95℃水浴20 min。
5.室温冷却6.PBS冲洗（每次洗换新的）：3X5 min将染色缸中加满PBS，放在水平摇床上，50 rpm，轻摇。
7.透明：10 min配制0.2%的Triton X-100 PBS溶液。
先将载玻片上的PBS吸净，然后用专用笔围绕组织画一个封闭的圆圈，室温晾干后，紧挨内圈再画一个封闭的外圈，室温晾干。
用移液器向封闭圈内加一定量的0.2%的Triton X-100 PBS溶液，保证液体浸没组织。
8.PBS冲洗：3X5 min同步骤6。
9.封闭：30 min（RT）配制1%马血清PBS溶液。
先将载玻片上的PBS吸净，用移液器向封闭圈内加一定量的1%马血清PBS溶液，保证液体浸没组织。
10.孵一抗：在湿盒中4℃过夜。
按比例在封闭液中稀释抗体.先将载玻片上的封闭液轻轻甩掉，将载玻片摆放在湿盒内，用移液器向封闭圈内加一定量的稀释后的抗体溶液，保证液体浸没组织。
11.PBS冲洗：3X5 min同步骤6。
12.孵二抗：30 min（RT，避光）按比例在封闭液中稀释抗体。
先将载玻片上的PBS吸净，用移液器向封闭圈内加一定量的稀释后的抗体溶液，保证液体浸没组织。
13.PBS冲洗：3X5 min同步骤6。
14.梯度脱水30%乙醇：3 min50%乙醇：3 min70%乙醇：3 min95%乙醇：3 minⅡ无水乙醇：3 minⅠ无水乙醇：3 min15.1:1二甲苯：无水乙醇：3 minⅠ二甲苯：3 minⅡ二甲苯：3 min（14-15可选）16.封片将载玻片放在白色纸盒中，在载玻片上滴加适量mounting buffer，盖盖玻片，室温水平放置，过夜后观察。
石蜡切片及免疫荧光
一、石蜡切片1.固定：将新鲜组织切成小块，固定于4%多聚甲醛过夜。
凝固组织中的物质成分，尽可能保持其活体时的结构。
同时能使组织硬化，有利于切片的进行。
2.脱水：为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行经70%、85%、95%直至纯酒精（无水乙醇），每次时间为1小时。
固定后的组织材料需除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响后期的染色效果。
3.透明：常用的透明剂有二甲苯，二甲苯是石蜡的溶剂。
纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的溶剂，替换出组织内的酒精。
材料块在透明剂浸渍过程称透明。
4.浸蜡：先把组织材料块放在熔化的石蜡和二甲苯的等量混合液浸渍1小时。
先后移入2个熔化的石蜡液中浸渍1小时左右。
5包埋:以少许热蜡液将其底部迅速贴附于包埋盒内上，然后置于速冻台，让石蜡固定。
6.切片:切片刀的锐利与否、蜡块硬度是否适当都直接影响切片质量，可将蜡块至于冷水中改变蜡块硬度。
通常切片厚度为3-5um，用毛笔轻托轻放在37度水浴中展片。
7.贴片与烤片:般使用恒温水浴锅，温度控制在37-401左右，有利于石蜡切片的展开，贴好的切片置于60^恒温箱内干燥2小时，蛋白质凝固后即可染色。
8.切片脱蜡及水化:干燥后的切片置于二甲苯中进行脱蜡，然后依次使用从高浓度到低浓度递减的顺序进行经纯酒精、95%、85%、70%进行水化。
9染色:经典的苏木精和伊红：细胞核被苏木精染成紫蓝色，多数细胞质及非细胞成分被伊红染成粉红色。
实验操作简单。
免疫组化：指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应。
二、冰冻切片1.取材：应尽可能快地采取新鲜的材料，防止组织发生死后变化。
2.速冻：1）将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm）。
2）如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内。
3）当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20S组织即迅速冰结成块。
石蜡冰冻片免疫荧光染色程序
1.石蜡片二甲苯、酒精梯度脱蜡复水；2.透化。
0.25%TritonX-100处理细胞10-30分钟；3.抗原修复。
微波热修复（柠檬酸盐修复液或EDTA抗原修复液）6分钟两次，中间间隔5分钟。
冷却至室温。
4.滴加与二抗同源的正常血清封闭（如10%山羊血清），室温20分钟。
甩去多余液体，不洗。
5.滴加适当稀释的一抗，37C1～2小时或4℃过夜。
0.01MPBS洗2分钟×3次。
6.滴加一抗相对应的荧光素标记二抗，37℃避光孵育30-60分钟。
0.01MPBS洗2分钟×3次。
7.DAPI染细胞核2-5分钟，清洗。
8.抗荧光衰减封片剂封片。
荧光显微镜观察。
1.冰冻片从冰箱取出后PBS浸泡恢复至室温；2.透化。
0.25%TritonX-100处理细胞10-30分钟；3.抗原修复。
预实验可以尝试不修复，若结果不理想可尝试蛋白酶消化10分钟（为主），或微波热修复（柠檬酸盐修复液或EDTA抗原修复液）6分钟两次，中间间隔5分钟。
冷却至室温。
4.滴加与二抗同源的正常血清封闭（如10%山羊血清），室温20分钟。
甩去多余液体，不洗。
5.滴加适当稀释的一抗，37℃1~2小时或4C过夜。
0.01MPBS洗2分钟×3次。
6.滴加一抗相对应的荧光素标记二抗，37℃避光孵育30-60分钟。
0.01MPBS洗2分钟×3次。
7.DAPI染细胞核2-5分钟，清洗。
8.抗荧光衰减封片剂封片。
荧光显微镜观察。
最新石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法整理
石蜡切片免疫组化及免疫荧光染色方法1、组织的采集、固定和保存：采取组织后，方法一：4%多聚甲醛（4%PFA）4C 固定1小时（根据组织大小和致密程度调整固定时间）或过夜方法二：采用bouin’s固定RT 2h（6-8d tesis）or RT 过夜（成年tesis）PBS缓冲液洗三次，每次5min，4C保存于70%乙醇中。
2、组织的包埋、切片、展片及保存：：固定后的样品经梯度乙醇脱水、二甲苯透明，52-54C石蜡包埋，常规切片，切片厚4 -10m，贴于处理过的干净载玻片上，37C烤片过夜，之后收集于载片盒中，RT密封保存。
石蜡包埋：保存于4C 70%乙醇中的组织样品80%乙醇15 min95%乙醇15 min100%乙醇15min 21/2乙醇1/2二甲苯15 min二甲苯透明5-10 min1/2二甲苯1/2石蜡30 min石蜡（1） 1.5hr石蜡（2） 1.5-2.5hr石蜡（3）包埋RT保存3、石蜡组织切片的免疫组化方法：密封保存于RT的组织切片二甲苯(1) 20 min二甲苯(2) 20 min100%乙醇20min95%乙醇10 min80%乙醇10 min通风橱晾干，阻水笔在组织周围画圈切片在PBS中浸泡 5 min*20.4%Tritonx RT 10 min切片在PBS中浸泡 5 min*33%H2O2 RT 10min切片在PBS中浸泡 5 min*30.25%胰酶RT 10min切片在PBS中浸泡 5 min*3Blocking buffer(3%BSA+5%NGS+0.2%Tritonx-100 in PBS) RT 60min倾去blocking buffer，勿洗一抗4C overnight in blocking buffer取出切片复温1h，切片在PBS中浸泡 5 min*3二抗in blocking buffer GAR1：200 （GAM1：100），RT 1h切片在PBS中浸泡 5 min*3DAB显色5-10min（50微升A+50微升B+900微升PBS+5微升3%H2O2）如果是增强型DAB只要1min即可。
免疫荧光染色步骤
免疫组织化学染色步骤1．将石蜡切片二甲苯脱蜡（二甲苯Ⅰ20min→二甲苯Ⅱ10min）、入水（100%酒精Ⅰ5min→100%酒精Ⅱ3min→95%酒精2min→80%酒精1min→70%酒精1min），蒸馏水冲洗后，0.01M PBS冲洗，5min×3次；2．枸橼酸盐缓冲液微波抗原修复，加热使水温达92-96℃，维持10-15min，自然冷却至室温，0.01M PBS冲洗，5min×3次；3．3%H2O2溶液，37℃，20 min，以消除内源性过氧化物酶的活性，0.01M PBS 冲洗，5min×3次；4．正常羊血清封闭，37℃，30 min；5．倾去多余血清，滴加一抗，37℃2小时或者4℃过夜，0.01M PBS冲洗，5min×3次；6．滴加二抗工作液，37℃，30 min，0.01M PBS冲洗，5min×3次；7．滴加三抗工作液，37℃，30 min，0.01M PBS冲洗，5min×3次；8．DAB避光显色，显微镜下控制显色时间；9．0.01M PBS终止显色；10．梯度酒精脱水（70%酒精1min→80%酒精1min→95%酒精Ⅰ1min→95%酒精Ⅱ1min→无水酒精Ⅰ10min→无水酒精Ⅱ10min），二甲苯透明（二甲苯Ⅰ15min →二甲苯Ⅱ10min；11．中性树胶封片。
免疫荧光染色步骤(1)将组织切片脱蜡入水；(2)抗原微波修复，温度92℃-96℃，10-15min，自然冷却至室温；(3)正常羊血清封闭，37℃，60 min；(4)倾去多余血清，滴加一抗，37℃2小时或者4℃过夜，PBS冲洗，5min×3次；(5)滴加荧光素标记的二抗，避光，37℃，60 min，0.01M PBS冲洗，5min×3次；(6)防淬灭封片剂封片，4℃，避光保存。
(7)荧光显微镜观察拍照。
细胞免疫组化染色（培养板中染色）1．培养的细胞，弃去培养基，冷的PBS洗两次，首先用4%多聚甲醛（4孔板200μl）固定10min，PBS洗2次，每次5－10分钟。
免疫荧光染色步骤
免疫组织化学染色步骤1．将石蜡切片二甲苯脱蜡（二甲苯Ⅰ20min→二甲苯Ⅱ10min）、入水（100%酒精Ⅰ5min→100%酒精Ⅱ3min→95%酒精2min→80%酒精1min→70%酒精1min），蒸馏水冲洗后，0.01M PBS冲洗，5min×3次；2．枸橼酸盐缓冲液微波抗原修复，加热使水温达92-96℃，维持10-15min，自然冷却至室温，0.01M PBS冲洗，5min×3次；3．3%H2O2溶液，37℃，20 min，以消除内源性过氧化物酶的活性，0.01M PBS 冲洗，5min×3次；4．正常羊血清封闭，37℃，30 min；5．倾去多余血清，滴加一抗，37℃2小时或者4℃过夜，0.01M PBS冲洗，5min×3次；6．滴加二抗工作液，37℃，30 min，0.01M PBS冲洗，5min×3次；7．滴加三抗工作液，37℃，30 min，0.01M PBS冲洗，5min×3次；8．DAB避光显色，显微镜下控制显色时间；9．0.01M PBS终止显色；10．梯度酒精脱水（70%酒精1min→80%酒精1min→95%酒精Ⅰ1min→95%酒精Ⅱ1min→无水酒精Ⅰ10min→无水酒精Ⅱ10min），二甲苯透明（二甲苯Ⅰ15min →二甲苯Ⅱ10min；11．中性树胶封片。
免疫荧光染色步骤(1)将组织切片脱蜡入水；(2)抗原微波修复，温度92℃-96℃，10-15min，自然冷却至室温；(3)正常羊血清封闭，37℃，60 min；(4)倾去多余血清，滴加一抗，37℃2小时或者4℃过夜，PBS冲洗，5min×3次；(5)滴加荧光素标记的二抗，避光，37℃，60 min，0.01M PBS冲洗，5min×3次；(6)防淬灭封片剂封片，4℃，避光保存。
(7)荧光显微镜观察拍照。
细胞免疫组化染色（培养板中染色）1．培养的细胞，弃去培养基，冷的PBS洗两次，首先用4%多聚甲醛（4孔板200μl）固定10min，PBS洗2次，每次5－10分钟。
如何用石蜡切片做出高质量组化和荧光图之经验
[原创] 如何用石蜡切片做出高质量免疫组化和免疫荧光图之经验组织病理染色是我们做研究经常需要用到的实验技术，是基本的实验室技术之一。
很多人都认为病理染色相对Western blot（之前我也专门写了一篇经验贴）来说更容易出结果，这一点我不否认，但要想做出一张漂亮的图还是有点难度的，尤其是免疫荧光。
本人在这方面算得上是有点经验，做出来的图片受到导师和同学们的一致认可。
今天我就跟大家分享一下我艰辛摸索出来的经验。
我将从取材部分开始讲，到显微镜拍片结束。
由于我是基本只做中枢神经系统的研究，所以下面以鼠脑为例。
一、取材1、物品试剂准备：生理盐水或PBS（每只小鼠80ml），4%多聚甲或者10%中性福尔马林（每只小鼠100ml），麻药，250ml玻璃烧杯两个，泡沫箱两个，泡沫箱盖子一个，1ml注射器一个，20ml注射器两个，7号头皮针一个，大头针四个，止血弯钳（12.5cm）两把，组织剪一把（25cm），眼科剪一把，眼科弯镊一把，10mlEP管若干（一个鼠脑一管，提前装好固定液）。
2、取材步骤心脏灌注首先是麻醉小鼠。
等待麻醉诱导时把两个烧杯分别装上生理盐水和多聚甲，然后将烧杯半埋在冰中预冷。
麻醉后用大头针将小鼠固定于泡沫箱盖子上（用组织剪戳个洞，用以引流灌注出来的废液至泡沫箱中），暴露小鼠胸腔和心脏（用止血钳固定，用组织剪剪皮和开胸），注意别剪破肝脏和肺脏了，暴露后持止血弯钳稍微用力夹住一点心尖部（不要锁死钳子,留出进针的缝隙），微微用力向上提，仔细看心尖两侧颜色深浅，较浅那边是左心室部分，然后用头皮针（剪断针尖斜面，以防戳穿心底，提前接上装满生理盐水的注射器并赶走导管中的气泡）从心尖沿着左心室的长轴进针，全神贯注体会手感，当刚好有突破感时再进一点点，这时锁死止血钳。
然后用眼科镊夹起右心耳，并以眼科剪剪破之，见暗红的血涌出，接着手推注射器活塞，大概半分钟推完20ml生理盐水，连推4管，这期间观察肝脏颜色、肺脏大小及口鼻有无渗液。
石蜡切片免疫组化步骤修订稿
石蜡切片免疫组化步骤 WEIHUA system office room 【WEIHUA 16H-WEIHUA WEIHUA8Q8-
石蜡切片免疫组化步骤
1.石蜡切片放置在60℃恒温箱中烘烤120分钟。
2.脱蜡和水化：二甲苯(20min)→二甲苯(20min)→无水乙醇(5min×2次)→95%乙
醇(5min×2)→90%(5min)→80%乙醇(5min)
3.PBS洗2次各5min，蒸馏水冲洗1次5min，
4.抗原修复：压力锅开始喷气时，盖上气阀约~，冷却，取下气阀，冷却至室
温
5.蒸馏水洗1次5min，PBS洗2次各5min
6.加3%H2O2孵育30min(室温)
7.PBS洗3次各5min
8.加兰色试剂，室温孵育30min，倾去，勿洗
9.滴加一抗，37℃孵育2~3h，或4℃过夜
10.PBS冲洗3次各5min
11.滴加黄色试剂(B)，37℃孵育30min
12.PBS洗3次各5min
13.滴加试剂C(橙色)，37℃孵育30min
14.PBS洗3次各5min
15.DAB显色5~20min，自来水充分冲洗
16.苏木素复染2~3min，自来水充分冲洗
17.盐酸酒精分化2s，自来水充分冲洗
18.脱水、透明80%(5min)→95%(5min)→95%(5min)→100%(5min)→100%(5min)
→二甲苯(10min)→二甲苯(10min)
19.封片：中性树脂，加盖玻片(组织部位切勿残留小气泡)，自然晾干。
肾组织石蜡切片直接免疫荧光染色方法的再改良
肾组织石蜡切片直接免疫荧光染色方法的再改良郑爱萍;熊祖应【期刊名称】《南昌大学学报：医学版》【年(卷),期】2012(052)004【摘要】目的探讨肾组织石蜡切片直接免疫荧光染色再改良的方法,以提高石蜡切片的诊断准确率。
方法选择2010年6-12月在北京大学深圳医院行肾组织活检确诊为肾小球疾病的患者44例,其中IgA肾病20例,狼疮性肾炎12例,膜性肾病12例。
对其肾组织除常规冰冻切片直接免疫荧光染色外,对石蜡切片进行高温、高压修复和胃蛋白酶消化处理,再分别行免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM）、补体（C3、C1q）、纤维蛋白（Fib）、HBsAg及HBcAg直接免疫荧光染色,比较石蜡与冰冻切片的直接免疫荧光染色结果。
结果冰冻切片：肾小球数1～12个,平均5个;石蜡切片：肾小球数7～30个,平均15个。
20例IgA肾病、12例狼疮性肾炎、12例膜性肾病患者的肾组织行冰冻（IgA、IgG、IgM、C3、C1q、Fib、HbcAg和HbsAg）直接免疫荧光染色时在不同荧光强度中所占比例与行石蜡直接免疫荧光染色比较差异均无统计学意义（均P〉0.05）。
结论再改良的肾组织石蜡切片直接免疫荧光染色是冰冻切片失败时较好的补救手段。
其石蜡切片组织结构更清晰,免疫复合物沉积部位较冰冻切片更易判断。
【总页数】6页(P73-77,F0003)【作者】郑爱萍;熊祖应【作者单位】【正文语种】中文【中图分类】R446.8【相关文献】1.肾活检标本石蜡切片免疫荧光染色方法的探讨 [J], 李兵;苗里宁;刘树军;吴曼2.肾组织石蜡切片直接免疫荧光染色方法的再改良 [J], 郑爱萍;熊祖应3.免疫荧光染色中改良石蜡切片技术的应用 [J], 史本彩4.不同的抗原修复方法对肾活检标本石蜡切片免疫荧光染色的影响 [J], 谭文;贾晓敏5.改良石蜡切片技术在免疫荧光染色中的应用 [J], 于光耀;史本彩;牛保华;陈奎生;蒋杞英因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
石蜡切片免疫荧光染色
方法
GE GROUP system office room 【GEIHUA16H-GEIHUA GEIHUA8Q8-
对于石蜡切片：
1、烤片：60℃ 60分钟
2、脱蜡：二甲苯中Ⅰ脱蜡15分钟→二甲苯Ⅱ脱蜡15分钟→无水乙醇Ⅰ5分钟→无水乙醇Ⅱ5分钟→90%乙醇Ⅰ5分钟→90%乙醇Ⅱ5分钟→70％乙醇5分钟
→蒸馏水5分钟→蒸馏水5分钟。
3、抗原修复：高压修复，事先烧开锅中的水，修复盒中加入0.01mol/l柠檬酸钠，pH6.0(柠檬酸三钠 3g,柠檬酸 0.4g加入1000ml蒸馏水中)，上汽后加热10分钟，关火。
修复盒取出，放入装有自来水的瓷缸中缓慢冷却至室温。
2. 去除内源性酶：玻片取出放入湿盒，加3%H
2O2
2
(2ml H
2
O2
2
加入18ml蒸馏水
中，现配现用，避光)，室温孵育10分钟，PBS洗3次，每次5分钟。
（也可不用去除内源性酶）。
3. 封闭(Blocking)
加10%正常驴血清（原液100ul+900ulPBS,1ml够用30张片子），室温孵育封闭30分钟。
如果背景较高，可以4℃封闭过夜。
不用洗，用滤纸吸干周边水分。
从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。
4. 一抗孵育(Primary antibody incubation)
参考一抗的说明书，按照适当比例用免疫染色一抗稀释液（10%山羊血清PBS或1%BSA-PBS）稀释一抗。
立即加入稀释好的一抗， 4℃过夜，第二天取出复温45分钟。
PBS洗3次，每次5分钟。
5. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)
按照适当比例用免疫荧光染色二抗稀释液稀释荧光标记的二抗，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。
PBS洗涤3次。
每次5分钟。
如果结果背景较高，可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
6. 蛋白检测(Detection of proteins)
对于免疫荧光染色，此时已经可以直接到荧光显微镜下观察。
7. 复染
用DAPI对细胞核进行染色，室温10分钟，PBS冲洗5分钟×3次，封片（封片剂或分析纯的甘油与0.5molpH9.5碳酸缓冲液1：1混合）显微镜观察，染色后为蓝色荧光。
多重荧光染色：可使用红色荧光、绿色荧光和蓝色荧光进行三重荧光染色。
例如用免疫荧光染色试剂盒-抗小鼠Cy3(P0193)进行红色荧光染色，随后可以用免疫荧光染色试剂盒-抗兔FITC(P0186)进行绿色荧光染色，在完成上述两种染色后可以使用Hoechst染色试剂盒(C0003)对细胞核进行染色，染色后为蓝色荧光。
0.5molpH9.5碳酸缓冲液配方：
NaHCO3 3.7g
Na2CO3 0.6g
双蒸水溶解至100ml，调节pH至9.5。