普通生物学实验讲义

普通生物学实验（动物、植物）实验一（1）普通光学显微镜及其使用一、实验目的了解普通光学显微镜的构造及其原理，并熟练掌握其操作方法。

二、实验用品普通复式光学显微镜、载玻片、盖玻片、滤纸、擦镜纸。

三、实验原理和方法普通光学显微镜从构造上可分光学、机械和电子三大系统。

1、显微镜的光学系统光学系统通常由物镜、目镜、聚光器和光阑组成。

1)、物镜(objective)显微镜的质量主要取决于物镜。

物镜种类繁多，性能相差悬殊。

物镜的放大倍数用数字表示，如4、10、20、40和100等。

a．干燥系(drysystem)物镜镜检时，物镜与盖片间，不添加任何液体。

如4×、10×、20×和40×物镜都属干燥系，使用时不加用任何浸液，只以空气为介质，其折射率为1，所以干燥系物镜的数值孔径小，分辨率亦低。

b．浸没系(immersionsystem)物镜物镜在使用时，前透镜与盖片之间浸满液体。

依充添的浸液的不同，主要可分为油浸系(oil immersion)和水浸系(water immersion)等类别。

最常用的浸没液为香柏油(cederoil)，其折射率为1.515，与玻片的折射率相近，且不易干涸。

使用水浸物镜时加用水，其折射率1.33。

油浸物镜外壳上刻有：“oil”、“oel”、“imm”和“HI”等字样，水浸物镜刻有“W”或“Water”字样；油、水浸两用物镜则刻上“oil+w”字样；甘油浸没物镜刻有“Glyc”或“Glyz”等字样。

2)、目镜(eyepiece，ocular)目镜作为影像和肉眼间的放大镜，将物镜映来的影像做第二次放大。

同时，目镜作为物镜的补偿，把物镜残留下的像差给予进一步校正，以提高造像质量。

目镜作为投影器，把放大的影像投射在摄影暗箱的焦平面上。

目镜通常由两片(组)正透镜组成，上面的透镜叫接目或眼透镜(eye—lens)，它决定倍数和成像的优劣；下面的透镜叫会聚透镜(collectivelens)或场镜(fieldpiece)，它使视野边缘的成像光线向内折射，进入眼透镜中，使物体的影像均匀明亮。

上下透镜的中点，或场镜下面设有用金属制造的光阑叫做视野光阑或场光阑(field stop)。

场镜或物镜在这个光阑面造像，在光阑上可装入各种目镜测微计、十字线玻片和指针等。

由眼透镜射出的成像光线基本上为平行光束，并在目镜之上约10mm处交叉，此交叉点称作出射光瞳。

3）聚光器(condensers)聚光器等聚光系统，使来自光源的光线放大，并聚成光束，透过载片照明样品，射入物镜。

聚光器由聚光镜和孔径光阑(aperture diaphragm)构成。

聚光镜属正透镜系统，由一至数片透镜组成，具会聚作用，把照明光线会聚放大，射向被检样品，进入物镜。

孔径光阑位于聚光镜下方，光阑的孔径可变，以改变照明光束的直径，调节进光量。

孔径光阑的开度，即聚光器数值孔径，左右显微镜的成像质量。

物镜的有效数值孔径，其中涵容聚光器的数值孔径，即:物镜的有效数值孔径＝物镜数值孔径＋聚光器数值孔径/。

2、显微镜的照明普通光学显微镜，普遍采用中心亮视野透射照明法。

照明光源：照明光源以钨丝灯和卤钨灯为多。

卤钨灯优于钨丝灯，为显微镜的主要光源。

3、光路及成像显微镜的光路或光程(1ight path)即光源照明的通路。

光路始于光源灯，光源装在镜座后方的灯室(1amp housing)内。

光源灯丝(S)发出的色光，由聚光透镜集光成束或光锥，经镜座中的视场光阑(L)，投向反光镜，呈现45°折射向上，入射孔径光阑，光源灯丝在此平面处第一次成像(S1)。

透过聚光镜使光线放大、聚集，透射、照明载物台的样品，视场光阑在此平面处第一次成像(L1)，即在样品聚焦的同时，可见清晰的、缩小的视场光阑的影像。

成像光束继而进入物镜，在物镜的后焦面(rearfocal plane)的平面处，光源灯丝第二次成像(S2)。

成像光束经转折进入目镜，在目镜的场光阑平面处，视场光阑第二次成像(L2)。

最终，成像光束从目镜眼透镜射出，在目镜的出射光瞳处，光源灯丝第三次成像(S3)。

视场光阑的第三次成像(L3)在人眼的视网膜上。

在成像系统中，一个位置的改变，会引起整个成像关系的改变，光源灯前后位置的稍许位移将导致光源成像位置的变动。

4、放大率(magnification)显微镜最后形成的物体放大影像，对被检物体的大小比例称为放大率，即像高比物高。

放大倍数以长度计算，而不是以面积或体积计算。

某些显微镜为适应不同需要，镜筒内装有倍数不同的附加透镜系统。

在专用的显微摄影装置中，附有摄影透镜(photographic lens)。

显微摄影总放大率的计算，除目镜、物镜的放大率外，摄影透镜的放大率亦要计算在内。

显微镜的总放大率(Mt)应为；Mt＝Mob×Me×MphMob：物镜放大率Me：目镜放大率Mph：摄影透镜放大率5、显微镜的使用正确、合理地使用显微镜，是做好镜检和显微摄影的前提。

1）光路合轴调整照明光束应与显微镜的光轴合一，使光源均匀地照明视场。

镜检和摄影前，光路要合轴调整，使照明光束与显微镜的光轴于同一轴线上。

光路系统中的目镜、物镜和视场光阑位置固定，勿需调整，仅聚光器可调。

因此，光路的合轴实为聚光器和光源灯的调中。

a.聚光器的调中聚光器的调中步骤如下：(1)转动聚光器升降旋钮，把聚光器升至最高位置。

(2)接通光源灯的电源开关。

(3)将制片标本放在载物台上，用4X或低倍物镜对样品聚焦。

(4)缩小视场光阑，在视场中可见边缘模糊的视场光阑图像。

(5)微降聚光器，至视场光阑的图像清晰聚焦止。

(6)用聚光器两个调中的螺杆推动聚光器，使缩小的视场光阑的图像，调至视场中心。

(7)开放视场光阑，使多角形的周边与视场边缘相接。

(8)反复缩放视场光阑，确认光阑中心和边缘与视场完全重合。

(9)使聚光器回复顶点位置。

在视场中，通过观察视场光阑影像的相对移动，使聚光器调中，达到光轴合一。

2）光阑及其使用显微镜有两种光阑：视场光阑和孔径光阑。

视场光阑控制照明光束，限定视场大小。

孔径光阑通过光阑的放缩，限定，聚光镜的孔径大小。

两者皆为可变光阑(irisdiaphragm)，正确调节和使用光阑，是保证镜检和摄影质量的重要环节。

四、思考题1．物镜的种类各具何种特点?2．目镜在显微镜的成像上起何作用?3．聚光器的构成及其作用?4．如何进行光路合轴调节?5．物镜和目镜的选用及其组合的原则?实验一（2）细胞的形态与结构一、实验目的和要求1、学习并掌握显微镜的正确使用方法。

2、了解真核细胞的各种形态和基本结构。

3、学习临时装片标本的制作方法。

4、了解植物细胞中贮藏的内含物种类及其特性。

二、实验原理细胞是构成植物体的基本单位，也是植物生命活动的基本单位。

根据细胞的结构和生命活动的方式，可以把构成生物有机体的细胞分为两类，即原核细胞和真核细胞。

原核细胞内没有典型的细胞核，也没有分化出以膜为基础的具有特定结构和功能的细胞器；而真核细胞的DNA主要集中在由核膜包被的细胞核中，并分化出多种以膜为基础的细胞器。

高等植物核绝大多数低等植物均由真核细胞构成。

植物细胞通常很小，其直径一般在20~50μm之间，因而要借助显微镜才能观察到。

但也有少数植物细胞，如苎麻(Boehmeria nivea)的纤维细胞长可达550mm，用肉眼即可看到。

尽管不同植物细胞在形态、大小上有一定差异，但它们的基本结构是一致的。

三、实验材料和用品实验材料：1、洋葱鲜鳞茎。

2、新鲜菠菜。

3、马铃薯块茎。

4、新鲜花生米或菜豆种子。

实验器材：显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、剪刀、吸管、尖头镊子、刀片等实验试剂：1、碘－碘化钾溶液：取3g碘化钾溶于100ml蒸馏水中，再加入1g碘，溶解后即可使用。

此液应放在棕色试剂瓶中，暗处保存。

2、苏丹III染液：、先将0.1g苏丹Ⅲ或Ⅳ溶解在50ml丙酮中，再加入70％酒精50ml。

四、实验内容1、以洋葱鳞茎的表皮为材料，在光镜下观察植物细胞的基本组成和结构。

2、菠菜叶肉细胞中叶绿体的观察。

3、蚕豆表皮细胞气孔的观察。

4、运用特异性染色方法鉴定植物细胞中主要的内含物。

五、实验方法和步骤1、物细胞结构的观察1)洋葱鳞片叶表皮细胞临时装片标本的制作与观察a.取一洗净的载玻片，用纱布擦干，于玻片中央滴一滴蒸馏水，用尖头镊子从洋葱肉质鳞片叶内表皮撕下一小块表皮，铺在水滴上，用解剖针轻轻将其压入水中，使之展平。

b.用镊子夹住洗净擦干的盖玻片的一边，使另一边接触水滴的边缘，然后慢慢地放下，以便驱走盖玻片下的空气，不致产生气泡。

c.用吸水纸吸去盖玻片周围的水，于显微镜下观察。

d.在低倍下，可见洋葱表皮细胞略呈长方形，排列紧密，每个细胞内有一圆形或扁圆形的细胞核。

e.在盖玻片的一侧滴上一滴碘－碘化钾溶液，滴在盖玻片边缘的载玻片上，然后用吸水纸一侧将盖玻片下的水分吸去，把染料引入盖玻片与载玻片之间，对材料进行染色观察。

注意：1.撕表皮时不要把表皮撕得过大，如撕下的表皮面积大于盖玻片，要将表皮放在有水的载玻片上，用刀片切成小块，便于观察。

2.撕表皮时动作要迅速，勿将撕下的表皮在空气中暴露时间过久，以免使生活细胞由于失水而受到损伤。

3.撕开的一面最好朝上放在载玻片上，以利于染色和进行组织化学实验的观察。

4.撕下的表皮一定要平铺在有水的载玻片上，如发生褶皱或重叠要用解剖针将其铺平，以免影响观察效果。

2).菠菜叶肉细胞叶绿体的观察取一新鲜菠菜叶片，用镊子撕去一小块下表皮，用小刀轻轻刮取一点叶肉细胞，制作菠菜叶肉细胞临时装片标本。

将所制标本先置低倍镜下观察，然后再转高倍镜，注意叶肉细胞内叶绿体的形态、数目。

3).气孔的观察取新鲜蚕豆叶片，用刀片在叶的背面轻轻划一个小方块，用镊子从切口处夹住表皮，并向切开的方向撕下表皮，放在载玻片上的水滴中，用镊子展平，盖上盖玻片，在显微镜下观察，先在低倍镜下找出比较薄的部位，然后换至高倍镜下观察。

注意观察气孔的形态及类型。

4). 植物细胞的内含物在细胞代谢活动中，常常有一些代谢产物以不同形式贮存在液泡、细胞质或细胞器中，其中有些物质，如淀粉、脂肪、蛋白质等可以通过特殊的显色方法显示出来。

取马铃薯(Solanum tuberosum)块茎切成两半，用解剖刀在切开的块茎表面轻轻刮一下，将附着在刀口附近的浑浊汁液放在载玻片上，用碘－碘化钾染色，然后盖上盖玻片，在显微镜下观察。

取一粒菜豆(Phaweolus vulgaris)种子，剥去种皮，用刀片对含有丰富贮藏物质的肥厚子叶做徒手切片，选取较薄的切片放在载玻片上，用碘－碘化钾染色，盖上盖玻片后在显微镜下观察。

其中被染成金黄色的颗粒是糊粉粒，这是蛋白质的一种贮藏形式。

取花生(Arachis hypogaea)种子，做徒手切片，选取较薄的切片放在载玻片上，用苏丹III 染色，然后盖上盖玻片在显微镜下观察。