分子生物学基因重组培训课件

• 功能：减数分裂时染色体分配、DNA修复、特定噬菌体 的复制、酵母的交配型转换、真核基因组的遗传作图、 基因导入
• 模型：
❖ 拷贝-选择：在DNA复制中，新生链延伸时转换为新的模 板。如DNA修复。
❖ 断裂-重新连接：重组没有在复制中产生，DNA链在双链 间断裂、交换和重新连接。如减数分裂时染色体交换
分子生物学基因重组
分子内重组
• 同源重组homological recombination：同源性依赖，非序 列专一性依赖。在大肠杆菌由RecA蛋白指导。
• 位点特异性重组site specific recombination：序列专一性 依赖，非同源性依赖。由位点特异性重组酶指导。
• 转座transposition：非同源性依赖。由转座酶、整合酶指 导。酶识别转座因子两端特异序列，但受体位点相对非 特异。
• 一个链与另一个链 的连接点叫做重组 关节。
分子生物学基因重组
9
• 重组关节能沿着 DNA双链分子移动， 这种移动叫做枝状 迁移
• 在一条链被另一条 链取代的过程中， 分叉点可以沿任一 个方向移动
分子生物学基因重组
10
• 交差分子旋转 后形成一个平 面结构-----Holliday结构
分子生物学基因重组
❖ 杂合模型：包括上面两种特征。
分子生物学基因重组
3
修复损伤DNA的同源重组
分子生物学基因重组
4
真核生物同源重组的断裂与重接模型
Darlingtong D. C.于1936年提出：减数分 裂同源染色体联会时，非姊妹染色单体由于缠绕而 产生张力，两个染色单体在同一位置断裂、重节， 以消除张力，从而产生重组。
How: Holliday model
1. Nicks made near Chi (GCTGGTGG/each 4 kb) sites by a nuclease with recBCD.
证据：姊妹染色单体的交换
分子生物学基因重组
5
Diploid eukaryotes: crossing over ( 双倍体染色体交换)
1. Homologous chromosomes line up in meiosis (when) 2. The nonsister chromatids exchange equivalent sections (what)
分子生物学基因重组
6
同源重组
• 发生在两条DNA双链之间 • 重组酶能以任何的同源序列为底物
• 重组的频率在整组基因中并不很频繁，但对 整体和局部都有影响
• 重组的总频率在精子和卵子中并不相同，在 人类中女性是男性的两倍
• 在整组基因内部，同源重组的频率与染色体 ห้องสมุดไป่ตู้构象有关，例如，十字结构将阻止附近的 DNA重组变异。
• 大约10～20个与重组有关的DNA位点通过E. coli 的Rec基因突变体鉴定
• Chi序列能刺激它周围附近的重组：
•
5’GCTGGTGG 3’
•
3’CGACCACC 5’
• Chi序列在大肠杆菌中每5—10kb出现一次
• Chi是一个被RecBCD基因编码的酶的作用目标。
分子生物学基因重组
17
11
细菌基国重组中的单链同化作用 single-strand assimilation
• DNA分子的单链部分通过碱基互补配对转移到 另一DNA双链分子中，称为单链吸收或单链同 化。
• 有三个必备条件：
◆
DNA分子必须有单链区
◆
DNA分子必须有自由3’端
◆
3’端必须设置在两分子互补区内
分子生物学基因重组
• 不正常重组或非常规重组illegitimate recombination：很 少或不需要同源性。一般使用不正常底物进行细胞正常 加工。与癌症相关。
• 人工重组artificial recombination: 体外进行DNA的剪切和 连接引起的重组，即基因重组。
分子生物学基因重组
2
一、同源重组
12
RecA催化单链的同化作用
• RecA催化单、双链DNA的反应分为三个阶段：
◆ RecA在单链DNA上慢慢聚合。
◆
DNA与其互补物在双链上快速配对反
应，产生异源双链连接
◆ 源双链DNA区带。
，产生一个长的异
• SSB(单链结合蛋白)的存在刺激了这个反应
分子生物学基因重组
13
RecA catalyzes single-strand assimilation
分子生物学基因重组
7
细线期
• 染色体的重 组包含部分 的物理性的 改变：破损
两与条再DN联A合双链 分子的联接作 用是基因重组 的关健环节
偶线期 粗线期 双线期
终变期
分子生物学基因重组
在DNA双 链中制造 一个破损
同化作用
8
• 同源染色体两对 DNA双链在相应点 产 生 nick ， 一 条 单 链离开它的伙伴， 与另一个双链分子 的相应位置倒易位 置，创造了两个 DNA双链之间的连 系，这种连接在一 起的一对双链叫做 交差分子。
RecA promotes the assimilation of invading single strands into duplex DNA so long as one of the reacting strands has a free end.
分子生物学基因重组
14
• RecA介导的DNA修复
分子生物学基因重组
15
重组热点
• 重组起始于双链破损。双链破损在轴素形成期 产生，在联会丝复合物形成阶断消失(~60min)
• 在染色体上容易发生双链破损的位点，称为重 组热点。
分子生物学基因重组
16
Chi序列刺激它周围附近的重组
• 与重组有关的基因称为Rec基因
• Rec突变体不能进行同源重组
•RecBCD是有强烈降解DNA能力的核酸酶，在SSB存在
下，有解开DNA双链的酶活性和ATP酶活性，它在重组
中所起的作用便是提供带有自由3’端的单链DNA。
分子生物学基因重组
18
分子生物学基因重组
19
Haploid prokaryotes (单倍体生物原核同源重组）
Between the two homologous DNA duplex (where) • partially duplicated DNA of the chromosome • between chromosomal DNA and “foreign” DNA