FISH技术在遗传病诊断及产前诊断中的应用

苏州大学硕士学位论文FISH技术在遗传病诊断及产前诊断中的应用姓名：赵丽申请学位级别：硕士专业：妇产科学指导教师：李红;薛永权20040401ＦＩＳＨ技术在遗传病诊断及产前诊断中的麻Ｊ；｛Ｉｊ中文提要ＦＩＳＨ技术在遗传病诊断及产前诊断中的应用中文提要目的：探讨荧光原位杂交技术（ＦＩＳＨ）在遗传病及产前诊断中的应用价值。

方法：采用着丝粒探针、专一序列探针、整条染色体涂染探针对３６例常规染色体分析疑有染色体异常患者的外周血细胞和５７例进行产前诊断孕妇的羊水细胞进行常见或相应染色体异常的检测．并与常规细胞遗传学（ＣＣ）相比较。

结果：本组３６例常规染色体分析有异常患者进行相应的ＦＩＳＨ检测，发现ｌＯ例４５，ＸＯ，３例４５，ＸＯ／４６，ＸＸ，ｌ例４５，ＸＯ／４６，Ｘｒ（Ｘ），ｌ例４６，Ｘ，ｉ（Ｘｑ），１３例４７，ＸＸＹ，２例４７，ＸＹＹ，１例４７，ＸＸＸ，１例４６，ＸＸ，ｔ（４；７），１例４７，ＸＸＹ’ｉｎｖ（７），１例４６，ＸＹ＇ｉｎｖ（７），ｌ例４７，ｘｘ，＋２ｌ，１例４７，ＸＸ＋ｍａｒｋ。

进行产前诊断的５７例孕妇，ＦＩＳＨ检测其羊水细胞珍断出三例染色体异常患儿，分别是ｌ例４７，ＸＸ，＋１８；１例４６，ＸＹ（大Ｙ）；ｌ例４６，ＸＹ，ｔ（Ｙ，１５）。

其中有两例Ｔｕｒｎｅｒ’ｓ综合征患者，ＦＩＳＨ技术检测其为嵌合体，而常规核型分析则未能检测出：另有三例常规核型分析分别是４５，ＸＯ／４６，Ｘｒ（？Ｘ），４６，ＸＹ，ｉｎｖ（？７）及４６，ｘＹ’ｔ（？Ｙ，ｔＳ），我们通过相应的ＦＩＳＨ技术为其准确定性。

结论：ＦＩＳＨ方法不仅具有与ＣＣ法一样的准确性，同时可以提高ＣＣ法异常染色体的检出率．因此能作为ＣＣ法的必要补充用于遗传病及产前诊断中。

关键词：遗传病：染色体异常；细胞遗传学；荧光原位杂交；产前诊断；羊水细胞作者：赵丽指导老师：李红薛永权Ｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＦＩＳＨ）ｔｏｔｈｅｄｉａｇｎｏｓｉｓｏｆｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅａｂｎｏｒｍａｌｉｔｙｉｎｇｅｎｅｔｉｃｄｉｓｅａｓｅｓａｎｄｐｒｅｎａｔａｌｄｉａｇｎｏｓｉｓＡｂｓｔｒａｃｔＯｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｖａｌｕｅｏｆｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＦＩＳＨ）ｔｏｔｈｅｄｉａｇｎｏｓｉｓｏｆｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅａｂｎｏｒｍａｌｉｔｙｉｎｇｅｎｅｔｉｃｄｉｓｅａｓｅｓａｎｄｐｒｅｎａｔａｌｄｉａｇｎｏｓｉｓ．Ｍｅｔｈｏｄ：Ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｌａｂｅｌｅｄｐｒｏｂｅｓ（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇａ－ｓａｔｅｌｌｉｔｅｓＤＮＡｐｒｏｂｅ，ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｏｂｅａｎｄｗｈｏｌｅｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｐａｉｎｔｉｎｇｐｒｏｂｅ）ｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｈｙｂｒｉｄｉｚｅｗｉｔｈｂｌｏｏｄｓａｍｐｌｅｓｆｒｏｍ３６ｐａｔｉｅｎｔｓｗｈｏｗｅｒｅｓｕｓｐｅｃｔｅｄｈａｖｉｎｇｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅａｂｎｏｒｍａｌｉｔｙｂｙｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（ＣＣ）ａｎｄａｍｎｉｏｆｌｕｉｄｃｅｌｌｓｆｒｏｍ５７ｐｒｅｇｎａｎｔｗｏｍｅｎｗｉｔｈｈｉｇｈｒｉｓｋ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ａｍｏｎｇ３６ｐａｔｉｅｎｔｓ，ｔｈｅｋａｒｙｏｔｙｐｅｓ４５，Ｘ［１０ｃａｓｅｓ］、４５，Ｘ／４６，ｘｘ［３ｃａｓｅｓ］、４５，Ｘ／４６，Ｘｒ（ｘ）【ｌｃａｓｅｓ］、４６，Ｘ，ｉ（Ｘｑ）［１ｃａｓｅｓ］、４７，ＸＸＹ［１３ｃａｓｅｓ】、４７，ＸＹＹ［２ｃａｓｅｓ］４７，ＸＸＸ［１ｃａｓｅｓ］，４６，ＸＸ，ｔ（４；７）［１ｃａｓｅｓ］、４７，ｘｘｙ，ｉｎｖ（７）［１ｃａｓｅｓ］、４６，ＸＹｉｎｖ（７）［ｔｃａｓｅｓ］、４７，ＸＸ，＋２１［１ｃａｓｅｓ］、４７，ＸＸ，＋ｍａｒｋ［１ｅａｓｅｓ］ｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＦＩＳＨ．Ａｍｏｎｇｔｈｅ５７ｐｒｅｇｎａｎｔｗｏｍｅｎ，ｔｈｒｅｅｆｅｔｕｓｗｉｔｈｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅａｂｎｏｒｍａｌｉｔｙｗｅｒｅｄｉａｇｎｏｓｅｄｂｙＦＩＳＨ，ｔｈｅｋａｒｙｏｔｙｐｅｓａｒｅ４７，ＸＸ＋１８；４６，ｘＹ．（大Ｙ）；４６，ＸＹ，ｔ（Ｙ；１５）ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ‘‰・ｐｐ¨ｎＩ啪ｏｆｎ……ｎ￥１１ｕ晰ｄ山ｂｏｎｔｃｃｈｒｍｌｏｇｙ（ｎｓＨ）ｔｏＩｋｄｉｌｇｒ∞￥１ｓｏｆｃｈ㈣∞眦ｔｂｎｏｒｍｔｌｉｔｙｉｎＥｅｍｌｌｃｄ…：ａｎｄ唑”ｍ‘壁！！竺６些“竺Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：（１）ＳｏｍｅｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓｃａｎｂｅｄｅｔｅｃｔｅｄｐｒｅｃｉｓｅｌｙａｎｄｒａｐｉｄｌｙｂｙＦＩＳＨ．（２）ＴｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｒａｔｅｏｆｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅａｂｎｏｒｍａｌｉｔｙｉｓｉｍｐｒｏｖｅｄｂｙＦＩＳＨ．（３）ＦＩＳＨｉｓａｎｅｃｅｓｓａｒｙｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｔｏｔｈｅｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓＫｅｙｗｏｒｄｓ：Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅａｂｎｏｒｍａｌｉｔｙ；ｃｅｌｌｇｅｎｅｔｉｃｓ；ｐｒｅｎａｔａｌｄｉａｇｎｏｓｉｓ；ａｍｎｉｏｃｙｔｏＷｒｉｔｔｅｎｂｙＺｈａｏＬｉＳｕｐｅｒｖｉｓｅｄｂｙＬｉＨｏｎｇＸｕｅＹｏｎｇｑｕａｎＹ６４５５３６苏州大学学位论文独创性声明及使用授权的声明学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。

除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。

对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。

本人承担本声明的法律责任。

研究生签名：ｚ錾！日期：塑盐垒＝ｚ』学位论文使用授权声明苏州大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、清华大学论文合作部、中国社科院文献信息情报中心有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。

本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。

除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布（包括干Ｕ登）论文的全部或部分内容。

论文的公布（包括刊登）授权苏州大学学位办办理。

／孓岭日期：巡：里垒：！！研究生签名：日Ｕ吾遗传病是指其发生需要有一定的遗传基础，通过这种遗传基础，按一定的方式传于后代的疾病。

遗传病主要包括两大类：基因病与染色体病。

其中染色体病由于染色体异常涉及一个或多个基因结构或数量的改变，因此对个体的危害较基因病（单基因病和多基因病）大的多、严重的多，而且染色体病的检查、诊断及预防又比较方便，因此检测细胞染色体畸变一直是人们广泛研究的热点。

染色体异常的发生率很高，在人群中每２５０对夫妇中就有一个携带者，他们生育患儿的风险率高达５０％一１００％…。

传统的染色体异常检测方法都是采用常规细胞遗传学（ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，ＣＣ）分析，即经细胞培养获取中期分裂相后Ｇ显带识别，其有许多局限性：只能分析中期细胞：结果受分裂相数量和质量的高度制约：对一些微小缺失、插入、倒位及标记染色体的识别无能为力，因而可能导致核型分析失败或假阴性结果，这在客观上要求产生出一种分辨率高且不依赖中期分裂细胞的技术，荧光原位杂交技术因此应运而生。

荧光原位杂交（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＦＩＳＨ）是近年来在细胞遗传学、分子生物学和免疫学基础上发展起来的一门新技术，是基于碱基互补的原则，用已知序列标记后的ＤＮＡ作探针，与载玻片上的待测ＤＮＡ互补链杂交，通过检测杂交位点的荧光来判断染色体结构或数目的改变。

ＦＩＳＨ检测的标本可以是中期分裂相也可以是间期细胞。

选择恰当的探针是用ＦＩＳＨ进行染色体分析的前提，常用的ＦＩＳＨ探针主要包括三类：ｌ，染色体重复序列探针（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎｐｒｏｂｅ，ＣＥＰ），主要是针对染色体着丝粒的ａ一卫星ＤＮＡ而设计的探针，主要用于检测染色体的数目异常如三体、单体和其他非整倍体等。

２，染色体序列特异性探针（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｏｂｅ），主要用于某种特定基因的缺失、插入和染色体易位所致的基因重排的研究。

３，整条染色体涂染探针（ｗｈｏｌｅｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｐａｉｎｔｉｎｇ，ＷＣＰ）．探针为整条染色体或染色体的一臂，在信号显示时靶染色体被全部涂成某种颜色，适合于中期细胞，主要用于识别标记染色体的来源和检测染色体易位瞳１。

ＦＩＳＨ技术使细胞遗传学和分子学改变联系起来，让微小的基因改变显现于肉眼之下．准确而形象，不但大大拓展了细胞遗传学检测的范围，而且显著提高了其识别异常的能力，为检测染色体数目和结构异常、确定标记染色体等研究提供了新的有效手段ｂ１。

国外已有不少实验室将这一技术运用到遗传病的诊断及产前诊断上，而在国内这一工作则刚刚起步。

本课题综合应用着丝粒探针、专一序列探针及整条染色体涂染探针来检测各种染色体异常，并与ＣＣ法相比较，旨在为遗传病诊断及产前诊断提供一种快速而准确地检测染色体异常的方法。

ＦＩＳＨ技术在遗传痫诊断及产前诊断中的席川第一部分第一部分各种ＦＩＳＨ技术和常规核型分析的方法学研究资料统计表明，染色体异常占早＿孕自然流产胚胎的５０％、占死产婴儿的６％、占新生儿死亡者的６％、占～股人群的５‰。

文献报道，每１２０—ｌ５０个新生儿中就有‘个染色体异常患者“１。

因此遗传病的广“前珍断，对预防患儿的出，Ｊｉ，提高人口素质有着重要意义。

目前，羊水细胞培养进行染色体核型分析成为世界各地最常用且安全可靠的产前诊断方法，但其有许多无法克服的局限性，如取材时间受限、培养耗时长、对一些微小的缺失、易位、倒位及标记染色体无能为力。

荧光原位杂交技术弥补了经典显带法的不足，具有快速、灵敏、可靠的特点，可以较精确地测定各种染色体数量和结构的畸变。

本研究用ＦＩＳＨ技术来检测各种染色体异常，同时与ＣＣ法比较束探讨ＦＩＳＨ技术的可行性与准确性。

一、试剂和仪器：１．ＲＰＭｌｌ６４０培养基（北京协和医院）。

２．秋水仙胺：浓度为５ｕｇ／ｍｌ，４℃保存备用。

３．Ｏ．０７５ｍｏｌ／ＬＫｃｌ低渗液。

４．３：ｌ甲醇／冰醋酸固定液。

５．２０ＸＳＳＣ：氯化钠１７５．３９，柠檬酸钠８８．２９溶于８００ｍｌ双蒸水中，０．１ＮＮａＯＨ调节Ｄｈ至７．０，补加水至１０００ｍｌ，室温保存备用。

６．２×ＳＳＣ：由２０×ＳＳＣ加双蒸水配置，室温保存备用。