生活饮用水标准检验方法微生物指标
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生活饮用水卫生标准GB5749-2019 生活饮用水标准检验方法GB5750-2019
微生物指标及微生物检验的介绍
2020/5/20
广东省CDC微生物检验所 严纪文
我国旧的饮用水水质标准是1985年颁布实施的GB574985，标准检验方法为GB5750-85。该标准与国外的饮用 水标准相比，主要差别在于微生物指标项目少，缺少有机 物和消毒副产物指标。微生物指标只有细菌总数和总大肠 菌群2项，不能确切的评价水质的卫生状况。
淘洗液收集
2020/5/20
3.离心浓缩
1.将装有淘洗液样本的500mL离心管置2000g离心力下，离心15min。慢慢地减速 ，（不能使用制动装置！）以免搅起沉淀物。 2.用吸气装置将沉淀物上层8-10mL处的悬浮物小心吸出
（吸气装置的真空应小于3.3kPa）。
2020/5/20
2020/5/20
2020/5/20
隐孢子虫感染案例
1993 年在美国威斯康星州的东南 部港口城市密尔沃 基暴发 400,000 人被Cryptosporidium感染，4,000人到 医院 就医，60人死亡。调查显示致病源为处理不慎的饮 用水。
2019 年美国CDC将 Cryptosporidium感染列入国家必 须申报的传染病名单，2019年将 Giardia 感染列入国家 必须申报的传染病名单
Filta-Max xpress:快速法滤芯结构
• 40 层海绵: 55mm x 10mm (18mm 中孔) • 39层海绵: 40mm x 10mm (18mm中孔) • 交互叠放 • 从79cm 压缩到 3cm • 螺栓固定
2020/5/20
1.水样过滤
水样从两侧流经压缩的海绵膜汇集至中孔 “两虫”在滤芯表面被捕获
镜检（阴、阳
两虫检测所需要最基本的设备：
1.蠕动泵
2.滤芯的淘洗装置
3.高速离心机
4.磁力混合器、磁极
5源自文库荧光显微镜
2020/5/20
谢谢!
2020/5/20
5.免疫磁珠与孢（卵）囊复合物的分离
60min
5min
10min
染色镜检
2020/5/20
6.染色及镜检 单克隆免疫荧光染色（FA-异硫氰酸荧光素） 或 DAPI(4,6-二氨基-2-苯基吲哚)染色 荧光显微镜（Differential Interference
Contrast, DIC）
培养条件：36±1℃ 培养4h 紫外灯：波长366nm，功率6W
2020/5/20
➢酶底物法定义：在选择培养基上能产生β-半乳糖苷酶分 解色原底物释放出色原体使培养基呈现颜色变化，并能产 生β-葡萄糖酫酸酶分解荧光底物释放出荧光产物，使菌落 能够在紫外光下产生特征性荧光，以此技术来检测大肠埃 希氏菌的方法为大肠埃希氏菌酶底物法。 培养基：ONPG-MUG 结果判定：水样变黄色同时在366nm的紫外光下产生蓝色 荧光为阳性。水样未变黄色而有蓝色荧光产生不能判定为 阳性。
能产生β-半乳糖苷酶的细菌群组分解ONPG使培养基呈黄色 酶底物法的主要特点： 优点： ➢可同时判断水样中大肠菌群和大肠埃希氏菌 ➢检测时间较短，只需18-24h，最长需要28h ➢无需确证试验 ➢操作简单，对试验条件和人员要求低 缺点： ➢检测成本高
2020/5/20
2020/5/20
2020/5/20
2020/5/20
Cryptosporidium 隐孢子虫
➢特点:单一细胞原生动物，约3-7m 。有微小隐孢子虫、 鼠隐孢子虫和贝氏隐孢子虫三种，寄生于人、牛等体内的 主要为微小隐孢子虫（C．parvum）。 ➢宿主：人类、鸟类、鼠类、爬行类、鱼类 ➢感染源:隐孢子虫主要寄生在被感染的动物体肠道内，卵 囊通过粪便排出体外污染环境。 ➢易感人群：免疫缺陷者（如爱滋患者）、儿童、老人、医 务人员等 ➢传播方式:以粪-口，手-口途径为主，污染的水源和空气 均可传播。
2020/5/20
IDEXX Filta-Max® 手动/自动系统 －滤器及滤芯
过滤器
滤芯
FiltaMax Xpress 快速系统-滤器及滤芯
2020/5/20
Filta-Max : 滤芯结构（手动/自动法）
• 60 层环状海绵: 55mm x 10mm (18mm 中孔)
• 从60cm 压缩成 3cm • 螺栓固定
2020/5/20
7.结果的计算、报告和检测限
每升水中的孢（卵）囊数计算公式：
Y=（X×V）/（V1×V2） Y:每升水中的孢囊或卵囊的数目
X：计数样本的体积中孢囊或卵囊的数目 V：离心后再悬浮的体积，单位为mL V1：计数样本的体积，单位为mL V2：过滤后水的体积，单位为L 计算分析的检出限:
2020/5/20
Cryptosporidium 隐孢子虫生活周期
子孢子
滋养体
Ⅰ型裂殖体
裂殖子
裂殖子
成熟卵囊 2020/5/20
合子
雌、雄配子体
Ⅱ型裂殖体
Cryptosporidium 隐孢子虫(染色后荧光显微镜下)
2020/5/20
Giardia 贾第鞭毛虫 ➢ 特点:单一细胞原生动物，大小约10-15m，含4对鞭毛和
水样流向
滤器连接套件
滤器 滤芯（过滤模 块）
2020/5/20
2.洗涤(淘洗)滤芯
➢ 洗涤管 ➢ 滤芯置于洗涤管,并将
滤芯下部的压缩固定锣 栓解除 ➢ 周律性地压缩/扩展海绵滤 芯
2020/5/20
洗涤(淘洗)装置
过滤器
500ml锥 形离心瓶
Filta-Max®手动淘洗装置 Filta-Max®自动淘洗装置
FiltaMax Xpress 快速淘洗装置
2020/5/20
压缩 空气
滤器＋滤芯
Filta-Max xpress快速法淘洗流程
• 滤器（带滤芯）放入淘洗装置 • 淘洗装置连接缓冲液及空气压缩机 • 加 4.0 巴(58 psi)压缩空气 • 按动F1钮 • 2分钟后收集400ml淘洗液 • 快速全自动
2020/5/20
五、贾第鞭毛虫子和隐孢子虫 贾第鞭毛虫和隐孢子虫是一类寄生于人和动物体
内的肠道原虫，可致人兽共患病。患此病的人和动物 从粪便中排出大量的卵(孢)囊污染环境，在地面水和 防护差的地下水及处理不良的自来水中都可检出卵(孢) 囊。随着社会发展，优质供水势在必行。对一些潜在 的危险因素加以限制很有必要。在此基础上，新标准 中增加了贾第鞭毛虫和隐孢子虫的检测方法。
2020/5/20
两虫的单抗染色结果
贾第鞭毛虫
隐孢子虫
2020/5/20
隐孢子虫的单克隆抗体染色结果
2020/5/20
隐孢子虫 DAPI 染色结果
2020/5/20
贾第鞭毛虫的单克隆抗体染色结果
2020/5/20
贾第鞭毛虫 DAPI 染色结果
2020/5/20
贾第鞭毛虫孢囊和隐孢子虫卵囊在荧光镜下的特征 1.在镜下可见苹果绿色的孢（卵）囊。 2.孢（卵）囊的形状、大小符合描述。 3.膜与胞质的对照，膜的荧光要强一些。 4.孢（卵）壁的完整性（孢囊可能会失去！）
酶底物法
酶底物法定义：总大肠菌群酶底物法是指在选择性培养基上能产生β半乳糖苷酶的细菌群组，该细菌群组能分解色原底物释放出色原体 使培养基呈现颜色变化，以此技术来检测水中总大肠菌群的方法。 培养基：MMO-MUG培养基（Minimal Medium ONPG-MUG）。 本方法可分为定性和定量。 定量法：10管法、51孔定量法 培养条件： 36±1℃ 24h
—U.S.EPA
2020/5/20
两虫的检测方法（免疫磁分离荧光抗体法） 检测程序： 水样过滤 洗涤 离心 免疫磁珠捕获卵囊 磁珠与 卵囊复合物的分离 荧光标记和DAPI染色 显微镜检 查记述 结果报告 检测问题： ➢方法操作复杂 ➢检出率低 ➢无法进行生物活性判定 ➢不能进行属、种鉴定 ➢价格高
修订后的标准，微生物学指标增加为6项：菌落总数、总 大肠菌群、耐热大肠菌群、大肠埃希氏菌、贾第鞭毛虫和 隐孢子虫。
同时在资料性附件中增加了肠球菌和产气荚膜梭状芽胞杆 菌。
2020/5/20
2020/5/20
2020/5/20
2020/5/20
2020/5/20
2020/5/20
2020/5/20
四、大肠埃希氏菌
检测方法：多管发酵法、滤膜法、酶底物法 ➢大肠埃希氏菌多管发酵法定义：大肠埃希氏菌是指多管发酵法总大 肠菌群阳性，在含有荧光底物的培养基上44.5℃培养24h产生β-葡萄 糖酫酸酶，分解荧光底物释放出荧光产物，使培养基在紫外光下产生 特征性荧光的细菌，以此来检测水中大肠埃希氏菌的方法。 培养基：EC-MUG（4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖酫酸苷）。 培养条件：44.5±0.5℃ 培养24±2h。紫外灯：波长366nm，功率6W 大肠杆菌能产生β-葡萄糖酫酸酶分解MUG，菌落在366nm紫外光下产 生蓝色荧光 ➢滤膜法定义：用滤膜法检测水样后，将总大肠菌群阳性的滤膜 在含 有荧光底物的培养基上培养，能产生β-葡萄糖酫酸酶分解荧光底物释 放出荧光产物，使菌落能够在紫外光下产生特征性荧光，以此来检测 水中大肠埃希氏菌的方法。 培养基：NA-MUG
2020/5/20
重要的动物宿主 ➢贾第鞭毛虫在自然界广泛存在，包括两栖动物；鸟类； 哺乳动物在内的40多种动物均可成为贾第鞭毛虫的宿 主。 ➢调查表明，人排出孢囊可使狗、海狸、麝鼠、沙土鼠 及大鼠等动物感染。 ➢一些生活在水中的动物可被来源于人的贾第鞭毛虫孢 囊感染，因此这些动物即使不是主要宿主也可能作为贾 第鞭虫的传播媒介。
D=V/(V1×V2) D:每升孢囊或卵囊的检测限 V:离心后再悬浮的体积，单位为mL V1：计数样本的体积，单位为mL V2：过滤后水的体积，单位为L
2020/5/20
两虫检测的质量控制:
➢免疫荧光质量控制:针对免疫荧光试剂盒,由两个试 验组成(阴、阳性对照）;1次/周。
➢整个程序的质量控制：从采样 性对照）。1次/三个月。
2020/5/20
Giardia
贾第鞭毛虫
2020/5/20
两虫感染的特点 ➢贾第氏鞭毛虫(Giardia)/隐孢子虫(Cryptosporidium) / 感染后无特殊临床症状,无预防疫苗，绝大多数抗生素 无效，治疗依赖于自身抵抗力 ➢大部份作为源水的江河及水库水等地表水是高危的,大 部分地下水都有被地表水污染的潜在危险 ➢可以通过被污染的源水而进入供水系统,水源性感染已 成为最大的感染源，但孢/卵囊对传统的水处理法中氯化 消毒有抗性,氯不能渗透过卵囊，沙滤及膜过滤法也不能 完全去除 ➢饮用水高温煮沸也并非有效 对氯消毒耐受、对热敏感、感染剂量低、感染率高
双核。人、动物共染。寄生人体内为蓝氏贾第鞭毛虫
Giardia lamblia。在不同温度和纬度地区均能发现该病
；发达国家感染率为2-5%；发展中国家感染率可高达到 20-30%。 可引起急慢性腹泻、肠吸收紊乱及延缓儿童的 生长发育。 ➢ 传染源：被孢囊污染的水和食物；往往一人带孢囊全家 感染； ➢ 传播:通过被污染的水和食物经口传播；接触（往往一人 带孢囊全家感染）；娱乐用水；旅游。 ➢ 易感人群：3岁以内婴儿；免疫功能受损害者；旅游者。
微生物指标及微生物检验的介绍
2020/5/20
广东省CDC微生物检验所 严纪文
我国旧的饮用水水质标准是1985年颁布实施的GB574985，标准检验方法为GB5750-85。该标准与国外的饮用 水标准相比，主要差别在于微生物指标项目少，缺少有机 物和消毒副产物指标。微生物指标只有细菌总数和总大肠 菌群2项，不能确切的评价水质的卫生状况。
淘洗液收集
2020/5/20
3.离心浓缩
1.将装有淘洗液样本的500mL离心管置2000g离心力下，离心15min。慢慢地减速 ，（不能使用制动装置！）以免搅起沉淀物。 2.用吸气装置将沉淀物上层8-10mL处的悬浮物小心吸出
（吸气装置的真空应小于3.3kPa）。
2020/5/20
2020/5/20
2020/5/20
隐孢子虫感染案例
1993 年在美国威斯康星州的东南 部港口城市密尔沃 基暴发 400,000 人被Cryptosporidium感染，4,000人到 医院 就医，60人死亡。调查显示致病源为处理不慎的饮 用水。
2019 年美国CDC将 Cryptosporidium感染列入国家必 须申报的传染病名单，2019年将 Giardia 感染列入国家 必须申报的传染病名单
Filta-Max xpress:快速法滤芯结构
• 40 层海绵: 55mm x 10mm (18mm 中孔) • 39层海绵: 40mm x 10mm (18mm中孔) • 交互叠放 • 从79cm 压缩到 3cm • 螺栓固定
2020/5/20
1.水样过滤
水样从两侧流经压缩的海绵膜汇集至中孔 “两虫”在滤芯表面被捕获
镜检（阴、阳
两虫检测所需要最基本的设备：
1.蠕动泵
2.滤芯的淘洗装置
3.高速离心机
4.磁力混合器、磁极
5源自文库荧光显微镜
2020/5/20
谢谢!
2020/5/20
5.免疫磁珠与孢（卵）囊复合物的分离
60min
5min
10min
染色镜检
2020/5/20
6.染色及镜检 单克隆免疫荧光染色（FA-异硫氰酸荧光素） 或 DAPI(4,6-二氨基-2-苯基吲哚)染色 荧光显微镜（Differential Interference
Contrast, DIC）
培养条件：36±1℃ 培养4h 紫外灯：波长366nm，功率6W
2020/5/20
➢酶底物法定义：在选择培养基上能产生β-半乳糖苷酶分 解色原底物释放出色原体使培养基呈现颜色变化，并能产 生β-葡萄糖酫酸酶分解荧光底物释放出荧光产物，使菌落 能够在紫外光下产生特征性荧光，以此技术来检测大肠埃 希氏菌的方法为大肠埃希氏菌酶底物法。 培养基：ONPG-MUG 结果判定：水样变黄色同时在366nm的紫外光下产生蓝色 荧光为阳性。水样未变黄色而有蓝色荧光产生不能判定为 阳性。
能产生β-半乳糖苷酶的细菌群组分解ONPG使培养基呈黄色 酶底物法的主要特点： 优点： ➢可同时判断水样中大肠菌群和大肠埃希氏菌 ➢检测时间较短，只需18-24h，最长需要28h ➢无需确证试验 ➢操作简单，对试验条件和人员要求低 缺点： ➢检测成本高
2020/5/20
2020/5/20
2020/5/20
2020/5/20
Cryptosporidium 隐孢子虫
➢特点:单一细胞原生动物，约3-7m 。有微小隐孢子虫、 鼠隐孢子虫和贝氏隐孢子虫三种，寄生于人、牛等体内的 主要为微小隐孢子虫（C．parvum）。 ➢宿主：人类、鸟类、鼠类、爬行类、鱼类 ➢感染源:隐孢子虫主要寄生在被感染的动物体肠道内，卵 囊通过粪便排出体外污染环境。 ➢易感人群：免疫缺陷者（如爱滋患者）、儿童、老人、医 务人员等 ➢传播方式:以粪-口，手-口途径为主，污染的水源和空气 均可传播。
2020/5/20
IDEXX Filta-Max® 手动/自动系统 －滤器及滤芯
过滤器
滤芯
FiltaMax Xpress 快速系统-滤器及滤芯
2020/5/20
Filta-Max : 滤芯结构（手动/自动法）
• 60 层环状海绵: 55mm x 10mm (18mm 中孔)
• 从60cm 压缩成 3cm • 螺栓固定
2020/5/20
7.结果的计算、报告和检测限
每升水中的孢（卵）囊数计算公式：
Y=（X×V）/（V1×V2） Y:每升水中的孢囊或卵囊的数目
X：计数样本的体积中孢囊或卵囊的数目 V：离心后再悬浮的体积，单位为mL V1：计数样本的体积，单位为mL V2：过滤后水的体积，单位为L 计算分析的检出限:
2020/5/20
Cryptosporidium 隐孢子虫生活周期
子孢子
滋养体
Ⅰ型裂殖体
裂殖子
裂殖子
成熟卵囊 2020/5/20
合子
雌、雄配子体
Ⅱ型裂殖体
Cryptosporidium 隐孢子虫(染色后荧光显微镜下)
2020/5/20
Giardia 贾第鞭毛虫 ➢ 特点:单一细胞原生动物，大小约10-15m，含4对鞭毛和
水样流向
滤器连接套件
滤器 滤芯（过滤模 块）
2020/5/20
2.洗涤(淘洗)滤芯
➢ 洗涤管 ➢ 滤芯置于洗涤管,并将
滤芯下部的压缩固定锣 栓解除 ➢ 周律性地压缩/扩展海绵滤 芯
2020/5/20
洗涤(淘洗)装置
过滤器
500ml锥 形离心瓶
Filta-Max®手动淘洗装置 Filta-Max®自动淘洗装置
FiltaMax Xpress 快速淘洗装置
2020/5/20
压缩 空气
滤器＋滤芯
Filta-Max xpress快速法淘洗流程
• 滤器（带滤芯）放入淘洗装置 • 淘洗装置连接缓冲液及空气压缩机 • 加 4.0 巴(58 psi)压缩空气 • 按动F1钮 • 2分钟后收集400ml淘洗液 • 快速全自动
2020/5/20
五、贾第鞭毛虫子和隐孢子虫 贾第鞭毛虫和隐孢子虫是一类寄生于人和动物体
内的肠道原虫，可致人兽共患病。患此病的人和动物 从粪便中排出大量的卵(孢)囊污染环境，在地面水和 防护差的地下水及处理不良的自来水中都可检出卵(孢) 囊。随着社会发展，优质供水势在必行。对一些潜在 的危险因素加以限制很有必要。在此基础上，新标准 中增加了贾第鞭毛虫和隐孢子虫的检测方法。
2020/5/20
两虫的单抗染色结果
贾第鞭毛虫
隐孢子虫
2020/5/20
隐孢子虫的单克隆抗体染色结果
2020/5/20
隐孢子虫 DAPI 染色结果
2020/5/20
贾第鞭毛虫的单克隆抗体染色结果
2020/5/20
贾第鞭毛虫 DAPI 染色结果
2020/5/20
贾第鞭毛虫孢囊和隐孢子虫卵囊在荧光镜下的特征 1.在镜下可见苹果绿色的孢（卵）囊。 2.孢（卵）囊的形状、大小符合描述。 3.膜与胞质的对照，膜的荧光要强一些。 4.孢（卵）壁的完整性（孢囊可能会失去！）
酶底物法
酶底物法定义：总大肠菌群酶底物法是指在选择性培养基上能产生β半乳糖苷酶的细菌群组，该细菌群组能分解色原底物释放出色原体 使培养基呈现颜色变化，以此技术来检测水中总大肠菌群的方法。 培养基：MMO-MUG培养基（Minimal Medium ONPG-MUG）。 本方法可分为定性和定量。 定量法：10管法、51孔定量法 培养条件： 36±1℃ 24h
—U.S.EPA
2020/5/20
两虫的检测方法（免疫磁分离荧光抗体法） 检测程序： 水样过滤 洗涤 离心 免疫磁珠捕获卵囊 磁珠与 卵囊复合物的分离 荧光标记和DAPI染色 显微镜检 查记述 结果报告 检测问题： ➢方法操作复杂 ➢检出率低 ➢无法进行生物活性判定 ➢不能进行属、种鉴定 ➢价格高
修订后的标准，微生物学指标增加为6项：菌落总数、总 大肠菌群、耐热大肠菌群、大肠埃希氏菌、贾第鞭毛虫和 隐孢子虫。
同时在资料性附件中增加了肠球菌和产气荚膜梭状芽胞杆 菌。
2020/5/20
2020/5/20
2020/5/20
2020/5/20
2020/5/20
2020/5/20
2020/5/20
四、大肠埃希氏菌
检测方法：多管发酵法、滤膜法、酶底物法 ➢大肠埃希氏菌多管发酵法定义：大肠埃希氏菌是指多管发酵法总大 肠菌群阳性，在含有荧光底物的培养基上44.5℃培养24h产生β-葡萄 糖酫酸酶，分解荧光底物释放出荧光产物，使培养基在紫外光下产生 特征性荧光的细菌，以此来检测水中大肠埃希氏菌的方法。 培养基：EC-MUG（4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖酫酸苷）。 培养条件：44.5±0.5℃ 培养24±2h。紫外灯：波长366nm，功率6W 大肠杆菌能产生β-葡萄糖酫酸酶分解MUG，菌落在366nm紫外光下产 生蓝色荧光 ➢滤膜法定义：用滤膜法检测水样后，将总大肠菌群阳性的滤膜 在含 有荧光底物的培养基上培养，能产生β-葡萄糖酫酸酶分解荧光底物释 放出荧光产物，使菌落能够在紫外光下产生特征性荧光，以此来检测 水中大肠埃希氏菌的方法。 培养基：NA-MUG
2020/5/20
重要的动物宿主 ➢贾第鞭毛虫在自然界广泛存在，包括两栖动物；鸟类； 哺乳动物在内的40多种动物均可成为贾第鞭毛虫的宿 主。 ➢调查表明，人排出孢囊可使狗、海狸、麝鼠、沙土鼠 及大鼠等动物感染。 ➢一些生活在水中的动物可被来源于人的贾第鞭毛虫孢 囊感染，因此这些动物即使不是主要宿主也可能作为贾 第鞭虫的传播媒介。
D=V/(V1×V2) D:每升孢囊或卵囊的检测限 V:离心后再悬浮的体积，单位为mL V1：计数样本的体积，单位为mL V2：过滤后水的体积，单位为L
2020/5/20
两虫检测的质量控制:
➢免疫荧光质量控制:针对免疫荧光试剂盒,由两个试 验组成(阴、阳性对照）;1次/周。
➢整个程序的质量控制：从采样 性对照）。1次/三个月。
2020/5/20
Giardia
贾第鞭毛虫
2020/5/20
两虫感染的特点 ➢贾第氏鞭毛虫(Giardia)/隐孢子虫(Cryptosporidium) / 感染后无特殊临床症状,无预防疫苗，绝大多数抗生素 无效，治疗依赖于自身抵抗力 ➢大部份作为源水的江河及水库水等地表水是高危的,大 部分地下水都有被地表水污染的潜在危险 ➢可以通过被污染的源水而进入供水系统,水源性感染已 成为最大的感染源，但孢/卵囊对传统的水处理法中氯化 消毒有抗性,氯不能渗透过卵囊，沙滤及膜过滤法也不能 完全去除 ➢饮用水高温煮沸也并非有效 对氯消毒耐受、对热敏感、感染剂量低、感染率高
双核。人、动物共染。寄生人体内为蓝氏贾第鞭毛虫
Giardia lamblia。在不同温度和纬度地区均能发现该病
；发达国家感染率为2-5%；发展中国家感染率可高达到 20-30%。 可引起急慢性腹泻、肠吸收紊乱及延缓儿童的 生长发育。 ➢ 传染源：被孢囊污染的水和食物；往往一人带孢囊全家 感染； ➢ 传播:通过被污染的水和食物经口传播；接触（往往一人 带孢囊全家感染）；娱乐用水；旅游。 ➢ 易感人群：3岁以内婴儿；免疫功能受损害者；旅游者。