考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度含(_Bradford_法)
考马斯亮蓝法测定蛋白浓度
考马斯亮蓝法测定蛋白浓度一、实验原理考马斯亮蓝G250比色法，也被称为Bradford法是常用的一种蛋白质浓度的测定方法。
考马斯亮蓝G250是一种染料，能与蛋白质通过疏水作用结合，形成蛋白质-染料复合物，颜色由红色转变为蓝色，最大光吸收波长为595nm，并且在低浓度范围（0.01~1.0mg/mL）内，与蛋白质浓度的关系服从比尔定律。
二、实验材料1、实验设备电子天平、分光光度计、恒温水浴锅2、试剂考马斯亮蓝G250、牛血清蛋白、NaCl、95%乙醇、85%磷酸三、操作步骤（一）试剂配制1、考马斯亮蓝G250溶液配制准确称取0.1 g考马斯亮蓝G250，溶于50mL 95%乙醇，加入100mL 85%磷酸，最后用蒸馏水稀释定容到1000mL。
备注：考马斯亮蓝G250溶液的用量100mL足够。
2、牛血清蛋白溶液配制准确称取50mg牛血清蛋白，加入0.526gNaCl，溶于少量蒸馏水中，然后稀释定容到500mL，配制成浓度为100 μg/mL的牛血清蛋白原液。
（二）标准曲线的制作1、取5-7支试管，分别准确配制不同浓度梯度的牛血清蛋白溶液（浓度控制在10~100μg/mL范围内）1mL，具体操作：取100-900 μl牛血清蛋白原液，水补足到1 mL，浓度相当于所取原液量的十分之一；2、在不同浓度的1mL牛血清蛋白溶液中，分别加入5mL考马斯亮蓝溶液，混合均匀，置于25℃水浴保温10min；3、以1mL蒸馏水加5mL考马斯亮蓝溶液为空白对照，冷却后测定波长595nm处的吸光值；4、以配制的标准蛋白浓度为横坐标，对应吸光值为纵坐标制作标准曲线，并做线性回归分析，求线性方程。
（三）目标样品的蛋白浓度测定取目标蛋白样品按标准曲线方法测定A595。
依据线性方程计算目标样品的蛋白质浓度。
五、注意事项1、染料-蛋白复合物形成受温度和时间影响较大，反应需控制在同一条件下进行。
2、比色杯易受蓝色污染，应注意用乙醇清洗。
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
蛋白质的含量测定
目前常用的5种经典方法： 凯式定氮法（Kjedahl法） 紫外吸收法 双缩脲法（Biuret法） Folin-酚试剂法（Lorry法） 考马斯亮蓝法（Bradford法）
（一）凯式定氮法
原理： 蛋白质是含氮的有机化合物。蛋白质与硫酸和催 化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与 硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离， 用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根 据酸的消耗量乘以换算系数，蛋白质含量。
Bradford 法的优点
(1)灵敏度高 其最低检测蛋白质含量可达1ug/ml,
这是因为蛋白质与染料相结合后产生 的颜色变化很大,蛋白质-染料复合物有 更高的吸光系数 ,因而光吸收要比Folin –酚试剂法大得多。
(2)测定快速,简洁
只需要加一种试剂，完成一个样品 的测定，只要5分钟左右。由于染料与 蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即 可完成，其颜色可以在1小时内保持稳 定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的 稳定性最好。
(3)干扰物质少 一些阳离子如K+、Mg+、Na+和硫酸铵 等不干扰测定。
干扰物质：去污剂、 SDS、TritonX-100 、0.1 MNaOH
Bradford 法的缺点
(1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含
量不同，因此 Bradford 法用于不同蛋白质时有较
大的偏差，最好选用与待测样品氨基酸成份相同 的标准蛋白。 (2)仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质 有去污剂等。 (3)标准曲线也有轻微的非线形，因而不能用比尔定 律进行计算而只能用标准曲线来测定未知蛋白质 的浓度。
缺点： 操作比较复杂、费时（8-10小时） 灵敏度低，适用于0.2-1.0mg氮测定。
考马斯亮蓝法(Bradford法)测定蛋白质含量：分光光度的使用
2．校正 （1）打开吸收池暗室盖，调节[0% T]旋钮， 使数字显示为“00.0”，将参比溶液置于光路， 盖上吸收池盖，调节透光率[100% T] 旋钮， 数字显示为“100.0”。 （2）如果显示不到“100”，则可适当增加电 流放大器灵敏度档数，当改变灵敏度 后必须重 新校正“0”和“100”。 （3）按（1）连续几次调整“00.0”和 “100.0”后，将选择开关置于“A”，调节吸光 度调零旋钮，使数字显示为“.000”，即可进行 吸光度A的测量.
考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋 白质含量：分光光度的使用
【实验目的】
1. 掌握考马斯亮蓝染色法定量测
定蛋白质的原理与方法。 2. 熟练分光光度计的使用和操作
方法。
【实验原理】 考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量 属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝 G250在酸性溶液中呈棕红色，最大吸 收峰在465nm；当它与蛋白质通过范 德华键结合成复合物时变为蓝色，其 最大吸收峰移至595nm，而且消光系 数更大。
灵敏度
0
100
暗盒盖
调波长旋钮
比色皿拉杆
1．调整
（1） 接通电源。 （2） 调波长调节器至所需波长。 （3） 开启电源开关，指示灯亮，选择开关置
于“T”，将灵敏度旋钮调至”1”档位，调节透 光率[100%T]。预热20min . 预热仪器应在不测定时，将比色皿暗箱盖打开， 使光路切断。
液。残渣用2.0ml蒸馏水悬浮，
4000rpm离心10min，合并上清液并含量测定:
取3支试管，各吸取样品提取液0.1ml，
加入考马斯亮蓝G250试剂3.0ml，充分振荡
混合,放置5min后，测 A595值。
3. 根据A595值，在标准曲线上求出样品中蛋 白含量。
蛋白质浓度测定-Bradford
蛋白质浓度测定—Bradford法一、实验目的学会用考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度。
二、实验原理考马斯亮蓝能也与蛋白质的疏水微区相结合，这种结合具有高敏感性。
考马斯亮蓝G250的磷酸盐呈棕红色，最大吸收峰在465nm。
当它与蛋白质结合形成复合物时呈兰色，其最大吸收峰改变为595nm。
考马斯亮蓝G250在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律，因此可以通过测定染料在595nm处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。
（二）试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液，用g―球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的标准蛋白质溶液。
（2）考马斯亮兰G―250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G―250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。
2. 器材：（1）可见光分光光度计（2）旋涡混合器（3）试管16支三、操作方法1.标准曲线制作（按下表0-11管操作，每管做3个平行）0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100标准蛋白含量( g)0 0．1 0．2 0．3 0．4 0．5 0．6 0．7 0．8 0．9 1．0标准蛋白溶液（0.1mg/mL）(mL)0．1 0．2 0．3 待测蛋白质溶液(mL)2 1.9 1.8 1.7 1.6 1.5 1.4 1.3 1.2 1.1 1.0 1.9 1.8 1.7 蒸馏水(mL)2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2考马斯亮蓝试剂摇匀，1 h内以0号试管为空白对照，在595nm处比色OD595nm以OD595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。
2. 未知样品蛋白质浓度的测定测定方法同上（上表11-13管），将未知待测样品做一定的稀释（鸡血清1：100稀释；羊血清1：200稀释；肝匀浆1：100稀释），使其测定值在标准曲线的直线范围内，每管做3 个平行。
实验九考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度含( Bradford 法)
1
0 1.0
2
0.1 0.4
3
0.2 0.3
4
0.3 0.2
5
0.4 0.1
6
0.5 0
考马斯亮蓝
蛋白质浓度 (μg/ml) O.D595
3.0
3.0
3.0
3.0
3.0
3.0
混匀，室温静臵３min，以第１管为空
பைடு நூலகம்
白，于波长595nm处比色，读取吸光度，
以吸光度为纵坐标，各标准液浓度为
横坐标作标准曲线．
２、样液的测定
另取2支干净的试管，加入样品液0.5
ml及考马斯亮蓝染液3.0 ml，混匀，
室温静臵3 min, 于波长595nm处比色，
读取吸光度，由样品的吸光度查标准
曲线求样品含量。
思考题
在考马斯亮蓝法测定蛋白质含量中 需要注意那些事项？
量的去污剂如Triton X-100，SDS，玻璃去污剂有少
量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。
考马斯亮蓝染色法的缺点：
1. 由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的
含量不同,因此 Bradford 法用于不同蛋白质时有较
大的偏差。因为研究发现，染料主要是与蛋白质中的
碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相
结合。 2.显色剂的稳定性较差。 3.溶液中有大量去污剂的存在是对颜色影响太大,不 宜使用此法测定蛋白质含量。
三、试剂和器材
1、试剂 （1） 考马斯亮蓝试剂 考马斯亮蓝G-250 100 mg溶于50 ml 95%乙醇中，加入100 ml 85%磷酸，用蒸馏 水稀释至1000 ml。 （2） 标准蛋白质溶液 牛血清蛋白或卵其清白蛋白等，预先测 定其蛋白纯度，再根据纯度用蒸馏水或0.9 ％NaCl 准确配制。
考马斯亮蓝测蛋白实验报告
实验二：分光光度计的学习之考马斯亮蓝G-250法（Bradford法）测定蛋白质含量定一实验目的学习分光光度计的基本原理和使用方法，并使用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量。
二实验原理考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
考马斯亮蓝G-250 在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm 波长下有最大光吸收。
其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合在2min 左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h 内保持稳定。
该法是1976年Bradford 建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry 法还高4 倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
三实验材料1. 实验材料：未知浓度的牛血清样品2. 主要仪器：试管、移液枪、分光光度计等。
3. 试剂：蛋白试剂考马斯亮蓝G-250 的配制：称取100mg 考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1 000mL。
此溶液在常温下可放置一个月。
四实验步骤标准曲线制作：取6 支10mL 干净的试管，按表1 取样。
摇匀后放置2min ，用1cm 光经的比色杯在595nm 波长下比色，记录测定的光密度OD595nm，并做标准曲线。
表1 低浓度标准曲线制作管号 0 1 2 3 4 51mg/ml标准蛋白(ml)0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10蒸馏水(ml) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0考马斯亮蓝G-250（ml）555555蛋白浓度（mg /ml）00.02 0.040.060.080.10OD595nm00.3390.4910.6010.7750.799上图数据标准曲线如下：拟合标准方程：y=7.7329x+0.11422．未知蛋白质浓度的测定另取2 支10mL 试管，按下表取样。
实验1考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量
蛋白质含量的测定
微量凯氏定氮法 Folin-酚试剂法（Lowry法） 双缩脲法（Biuret法） 紫外光吸收法 考马斯亮蓝法（Bradford法）
▪ 实验类型——基础验证型
实验目的
掌握和学习考马斯亮蓝G-250染色法 测定蛋白质含量的基本方法。
五 思考题
测定蛋白质含量还有哪些方法， 测定原理有哪些不同？
移液枪的使用方法
量程的调节 枪头（吸液嘴）的装配 移液的方法 移液器的正确放置 维护保养时的注意事项
吊钩 手柄
移液控制及调节旋纽 吸/枪头推出器
数字显示器
枪杆
移液枪的结构
1.量程的调节 ！！看清量程再调节
千万不要将按钮旋出量程， 否则会卡住内部机械装置而损坏了移液枪。
➢ 吸量管上端标有“吹”字。将所量液体全部放出后，还需要吹出 残留于管尖的溶液。此类吸量管为“吹出式”，未标“吹”字的 吸量管，则不必吹出管尖的残留液体。(0.5ml以下的都要吹）
➢ 吸量管尖应接触受器内壁，但不应插入受器内的原有液体之中， 以免污染吸量管及试剂。
➢ 吸取血液、尿、组织样品、粘稠试剂或有颜色的吸量管，用后应 及时用自来水冲洗干净。如果吸取一般试剂的吸量管可不必马上 冲洗，待实验完毕后，用自来水冲洗干净，晾干备用。
/mL
0
10
蛋白质浓度
(μg/mL)
A595
3
4
5
6
7
0.2
0.4
0.6
0.8 1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
4.0
4.0
4.0
4.0 4.0
20
40
60
考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量
蛋白质含量测定(考马斯亮蓝G-250法)一、目的考马斯亮蓝(Coomassie brilliant blue) G-250法是比色法与色素法相结合的复合方法，由Bradford于1976年建立，具有简便快捷，灵敏度高，稳定性好等特点，是一种较好的蛋白质定量测定常用方法。
通过本实验学习应用该法测定蛋白质含量的原理，复习分光光度计的使用及标准曲线的绘制等基本实验技能。
二、原理考马斯亮蓝G-250是一种染料，游离态呈红色，与蛋白质结合后转变为青色。
在0~1000μg 范围内，蛋白质-色素结合物在595 nm下的吸光度与蛋白质含量正相关，可用比色法测定。
三、仪器、试剂和材料1．仪器设备：(具塞刻度)试管吸管分光光度计2．试剂(1) 标准蛋白质溶液称取100 mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100 ml，制成 1 mg/ml溶液。
(2) 考马斯亮蓝G-250蛋白试剂称取100 mg考马斯亮蓝G-250，溶于50 ml 95%乙醇中，加入85% (m/v)的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容到1000 ml (此溶液在常温下可放置一个月)。
(3) 样品蛋白液(10~100 μg/ml)四、操作步骤1标准蛋白质含量(μg)为横坐标、吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。
2．样品中蛋白质含量的测定取2支(具塞)试管，分别准确加入0.l ml样品蛋白液，再各加5 ml考马斯亮蓝G-50试剂，充分混合，放置2min后，以标准曲线0号试管做参比，在595 nm波长下比色，记录吸光度。
五、结果处理根据所测样品提取液的平均吸光度，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量(μg/ml)六、思考题1．考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理是什么？还有哪些蛋白质定量法？2．如何正确使用分光光度计？。
蛋白质含量测定法考马斯亮蓝法
蛋白质含量测定法——考马斯亮蓝法[实验目的]学习、掌握考马斯亮蓝法（Bradford 法）测定蛋白质含量的方法[实验原理]（蓝色）变为氨基酸芳香族碱性染料考马斯亮蓝磷酸nm G 595250m ax λ−−→−+-[器材与试剂]器材722型可见光分光光度计、漩涡混合器、试管16支 试剂1.标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（BSA ），配制成1.00mg/ml 。
2.考马斯亮蓝G-250染料试剂：称100mg 考马斯亮蓝，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85% 的磷酸，用水稀释至1升。
[实验方法]标准方法1.取10支试管，分别编号后按 表1 剂量依次加入标准蛋白（或未知蛋白）、去离子水和考马斯亮蓝染料。
每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。
2.加完染料20min 后，使用722分光光度计，塑料比色皿，在595nm 处测量吸光度A 595。
3.用标准蛋白浓度（mg/ml ）为横坐标，用A 595为纵坐标，进行直线拟合，得到标准曲线。
根据测得的未知样品的A 595，代入公式即可求得未知样品的蛋白质含量。
根据所测样品的吸光度,在标准曲线上查得相应的蛋白质含量,按下式计算: 样品蛋白质含量(μg/g 鲜重)=）测定时提取液体积（）样品重（）提取液总体积（）查得的蛋白质（ml g ml g g ⨯⨯/μ以蛋白标准溶液浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
计算出回归方程。
如Y=aX+b让后把待测样品的吸光值代入回归方程，算出待测样品浓度 SDS 干扰实验1.取5支试管，分别编号后按表2剂量依次加入标准蛋白、SDS 、去离子水和考马斯亮蓝染料。
每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。
2.加完染料20min 后，使用753分光光度计，塑料比色皿，在595nm 处测量吸光度A 595。
[实验数据与结果分析]（一）标准方法的数据和图表1 考马斯亮蓝标准法实验表格根据表1，以A595为纵坐标，标准蛋白质量/（μg）为横坐标，作图1。
考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度含(_Bradford_法)
反应化合物在595nm处有最大光吸收，化合物颜色 的深浅在一定范围内与蛋白质浓度成正比，，因
此可通过测定595nm处的光吸收值来计算蛋白的含
量。
考马斯亮蓝染色法的优点：
（1）灵敏度高（比Lowry法灵敏4倍），测 其最低蛋白质测量可达1mg。 (2)测定快速,简洁。只需加入一种试剂， 完成一个样品的测定，只需5min左右。 (3)此方法干扰物少 如干扰Lowry法的K+、 Na+、Mg+例子，Tris缓冲液、蔗糖、甘油、
思考题
1.考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的原理 是什么？ 2.为什么不能用试管刷来清洗比色皿？ 3.能否将卫生纸塞入比色皿中吸干余液？ 4.为什么最后要用95%的乙醇来润洗比 色皿？
尽管相对于其他方法来说尽管相对于其他方法来说??尽管相对于其他方法来说此法的干扰物较少尽管相对于其他方法来说此法的干扰物较少此法的干扰物较少此法的干扰物较少但但由于每种蛋白质与该染料的结合能力不同由于每种蛋白质与该染料的结合能力不同故故标准品的选择非常重要选择标准品的选择非常重要选择尽可能与待测蛋白尽可能与待测蛋白一致的样品一致的样品做标准能最大限度的提高该方法的做标准能最大限度的提高该方法的准确性
七.补充
蛋白质含量测定方法比较
蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最
常用、最基本的分析方法之一。目前常用 的有四种古老的经典方法，即定氮法，双 缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法 （Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种 近十年才普遍使用起来的新的测定法，即 考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中 Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外 吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100 倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确， 往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法 的标准蛋白质。
考马斯亮蓝法测蛋白浓度
考马斯亮蓝法（Bradford)测蛋白浓度考马斯亮兰法：一种蛋白定量法具体操作步骤:（一）实验原理双缩脲法（Biuret法）和Folin—酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。
1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。
这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。
这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。
经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。
在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。
Bradford法的突出优点是：（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。
这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。
（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。
完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。
由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。
因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。
（3）干扰物质少。
如干扰Lowry法的K 、Na 、Mg2 离子、Tris 缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。
此法的缺点是：（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。
考马斯亮蓝法测蛋白质含量(原理
考马斯亮蓝法测蛋白质含量(原理考马斯亮蓝法（Bradford Assay）是一种常用的蛋白质含量测定方法。
它基于蛋白质与一种铜离子络合的原理，通过测定在碱性条件下蛋白质-考马斯亮蓝配合物与吸光度之间的关系，来确定蛋白质含量。
考马斯亮蓝法有以下几个特点：1. 敏感度高：考马斯亮蓝法对大多数蛋白质具有很高的灵敏度，可以检测到微量的蛋白质。
2. 特异性好：虽然考马斯亮蓝法可以测定多种类型的蛋白质，但对不同蛋白质的反应程度是有差别的，因此它在特异性上表现较好。
3. 操作简便：考马斯亮蓝法具有简单、快速、稳定性好等优点，非常适合大规模蛋白质含量的测定。
4. 利用范围广：除了用于测定溶液中的蛋白质含量外，考马斯亮蓝法还可用于固相蛋白质含量测定、酶联免疫吸附试验（ELISA）等领域。
1. 制备标准曲线：首先需要制备一组蛋白质浓度已知的标准溶液，常用的标准蛋白质有牛血清白蛋白、胰蛋白酶等。
将这组标准溶液分别加入少量试剂和适量去离子水，制备出一系列不同浓度的样本溶液，用吸光度计测定它们的吸光度值，并以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 取待测样本：从所需样本中挑选适量，加入量一般为10~100 μg，用去离子水稀释至一定浓度。
3. 添加试剂：向标准溶液和样品中分别加入适量的考马斯亮蓝试剂，0.5 ml的试样通常需要添加0.1 ml试剂。
4. 摇匀反应：使用磁力搅拌器或振荡器将样品和试剂充分混合，使反应达到最大化。
5. 测定吸光度：待反应结束后，用吸光度计测定样品的吸光度值，一般在595 nm波长处读数。
6. 读取浓度：根据标准曲线，将测出的吸光度值与标准曲线上对应浓度值对照，就可以推测样品中蛋白质的含量。
需要注意的是，考马斯亮蓝法本身也有一些缺陷。
例如，不同蛋白质的反应程度有差别，容易受到其他物质的影响而产生误差。
此外，在测定含有其他物质的样品中，需要对反应条件进行优化和校正，才能更准确地测定蛋白质含量。
考马斯亮蓝法测蛋白质含量
考马斯亮蓝法测蛋白质含量实验概要bradford法是最常用的蛋白质快速定量方法。
coomassie brilliant blue g-250与蛋白质结合使染料的最大吸收峰由465 nm变为595 nm，溶液的颜色由棕色变为蓝色，595nm波长下吸光度值与蛋白含量成正比。
灵敏度比lowry法高4倍，与bca法相当。
反应迅速，2分钟即可达到平衡并在1小时内保持稳定。
操作简便，只需要一种反应试剂。
实验原理考马斯亮蓝(coomassie brilliant blue)法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。
这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。
这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
考马斯亮兰g-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰(lmax)的位置，由465 nm变为 595 nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。
通过测定595 nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。
主要试剂考马斯亮蓝g-250染色工作液： 10mg考马斯亮蓝g-250粉末溶于5ml 95%乙醇中，彻底溶解后，加入10ml 85%磷酸中，边加边搅拌（市售液体磷酸（h3po4）的质量分数≥85.0%，稠状透明液体，可直接使用，对皮肤有很强的腐蚀作用，建议使用5ml移液枪缓慢吸取使用）蒸馏水稀释至100ml。
后经滤纸过滤后储存于棕色试剂瓶中，避光保存。
长时间不用，可放置于4℃冰箱中保存1年，再次使用还需过滤，加入反应管前需要升至室温，否则虽不影响精度，但测得的od值较低，对仪器要求较高。
标准牛血清白蛋白（bsa）：精确称取4mg bsa粉末，溶于1ml 0.15mol/l nacl溶液配制成4mg/ml标准蛋白溶液，-20℃保存。
（如用1cm比色皿测定，建议精确称取40mg bsa 粉末，溶于10ml 0.15mol/l nacl溶液配制成4mg/ml标准蛋白溶液，分装成小管，-20℃保存。
考马斯亮蓝测蛋白实验报告
考马斯亮蓝测蛋白实验报告Document serial number【UU89WT-UU98YT-UU8CB-UUUT-UUT108】实验二：分光光度计的学习之考马斯亮蓝G-250法（Bradford法）测定蛋白质含量定一实验目的学习分光光度计的基本原理和使用方法，并使用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量。
二实验原理考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
考马斯亮蓝G-250 在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm 波长下有最大光吸收。
其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合在2min 左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h 内保持稳定。
该法是1976年Bradford 建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry 法还高4 倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
三实验材料1. 实验材料：未知浓度的牛血清样品2. 主要仪器：试管、移液枪、分光光度计等。
3. 试剂：蛋白试剂考马斯亮蓝G-250 的配制：称取100mg 考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1 000mL。
此溶液在常温下可放置一个月。
四实验步骤标准曲线制作：取6 支10mL 干净的试管，按表1 取样。
摇匀后放置2min ，用1cm 光经的比色杯在595nm 波长下比色，记录测定的光密度OD595nm，并做标准曲线。
表1 低浓度标准曲线制作上图数据标准曲线如下：拟合标准方程：y=+2．未知蛋白质浓度的测定另取2 支10mL 试管，按下表取样。
吸取测定液，蒸馏水 mL放入试管中，加入5mL 考马斯亮蓝G-250 蛋白试剂，充分混合，放置2min 后用1cm 光径比色杯在595nm 下比色，记录光密度OD595nm，并通过标准曲线查得待测品提取液中蛋白质的含量X（μg）。
Bradford法测蛋白质浓度
Bradford法测蛋白质浓度一、实验目的配制一组浓度分别为0.10mg/ml ，0.08mg/ml，0.06mg/ml ，0.04mg/ml ，0.02mg/ml，0 mg/ml 的牛血清蛋白（BSA）溶液，测定这组溶液的吸光度，得到蛋白质浓度对吸光度的一条标准曲线。
测定未知蛋白质浓度样品的吸光度，根据标准曲线得到蛋白质的浓度。
二、实验原理考马斯亮蓝（CBB）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
考马斯亮蓝在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质—色素结合物在595nm波长下有最大该法试EP管中，再分别加入900ul，920ul，940ul，960ul，980ul的磷酸缓冲溶液（PBS）配成1ml的溶液，震荡使溶液混合均匀。
得到一组浓度分别为1.0mg/ml ，0.8mg/ml，0.6mg/ml ，0.4mg/ml ，0.2mg/ml 的BSA溶液。
移液枪分别移取100ul刚配好的一组BSA溶液，置于1.5ml的EP管中，各加入900ul的PBS 溶液，震荡使溶液混合均匀。
得到一组浓度分别为0.10 mg/ml ，0.08mg/ml，0.06mg/ml ，0.04mg/ml ，0.02mg/ml的BSA溶液。
另外量取1ml的PBS溶液（BSA溶液浓度为0 mg/ml）作对照试验。
用移液枪分别移取50ul配好的一组BSA溶液，滴加到孔板中，再分别加入200ul的考马斯亮——仅供参考蓝（CBB）。
静置10min后，用酶标仪测得这组BSA溶液的吸光度。
四、实验数据及处理测得的BSA溶液的吸光度如下：用orgin作出吸光度对BSA浓度的关系曲线。
五、实验结果分析得到的吸光度对BSA浓度的关系曲线为y=3.09x+0.6807，R2=0.9541。
可以看出吸光度—浓度——仅供参考。
考马斯亮蓝法(Bradford法)测定蛋白质含量doc
在一定蛋白质浓度范围内 (1～1000µg/ml）, 蛋白质－染料复合物在595nm处的光吸收与蛋白 质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。
由于蛋白质－染料复合物具有很 高的消光系数，因此大大提高了蛋白 质测定的灵敏度（最低检出量为 1µg）。
【器材与试剂】
（一）器材 1. 可见光分光光度计 2. 刻度移液管 3. 移液枪
朗伯—比尔定律:
A=lg(1/T)=Kbc
A为吸光度; T为透光度,是透射光强度比上入射光强度（I/I0); c为吸光物质的浓度; b为吸收层厚度(光程）.
物理意义 当一束平行单色光垂直通过某一吸光物质时,其吸 光度A与吸光物质的浓度c及吸收层厚度b成正比.
思考题
1.蛋白质的测定方法有几种？比较各种方法 的优缺点。
考马斯亮蓝G-250在游离状态 下呈红色，最大光吸收在 465nm；当它与蛋白质结合 后变为青色，蛋白质-色素结 合物在595nm波长下有最大 光吸收。其光吸收值与蛋白质 含量成正比。
蛋白质与考马斯亮蓝G250的 结合十分迅速，约2min即可 反应完全，其复合物在1h内 保持稳定。
考马斯亮蓝R250与蛋白 质反应虽然比较缓慢， 但是可以被洗脱下去， 所以可以用来对电泳条 带染色。
考马斯亮蓝法（Bradford法） 测定蛋白质含量
【实验目的】 1. 掌握考马斯亮蓝染色法定量 测定蛋白质的原理与方法。
2. 熟练分光光度计的使用和 操作方法。
【实验原理】
考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于 染料结合法的一种。
考马斯亮蓝G250在酸性溶液中呈棕 红色，最大吸收峰在465nm；当它与蛋白 质通过范德华键结合成复合物时变为蓝色， 其最大吸收峰移至595nm，而且消光系数 更大。
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反应化合物在595nm处有最大光吸收，化合物颜色 的深浅在一定范围内与蛋白质浓度成正比，，因 此可通过测定595nm处的光吸收值来计算蛋白的含
量。
考马斯亮蓝染色法的优点： （1）灵敏度高（比Lowry法灵敏4倍），测 其最低蛋白质测量可达1mg。 (2)测定快速,简洁。只需加入一种试剂， 完成一个样品的测定，只需5min左右。 (3)此方法干扰物少 如干扰Lowry法的K+、 Na+、Mg+例子，Tris缓冲液、蔗糖、甘油、 EDTA等均不干扰此法。
6、根据标准曲线计算待测蛋白浓度
在标准曲线上，根据测出的待测样品的
A595值，查处试管中蛋白质浓度，再按 照计算公式： 待测蛋白质的浓度（mg/mL）=查出的浓 度×稀释倍数 计算出待测蛋白浓度，如样品稀释合理 且操作得当，待测蛋白的三个数值应具 有同一性，取其平均值作为待测蛋白浓 度，如某一吸收值落在标准曲线线性范 围外，舍弃该点。
微量进样器按下表操作，将待测蛋白
配成系列浓度。
管号 8 9
待测蛋 缓冲液 总体积 稀释倍 白质 数 （μ L ） （μ L ） （μ L ） 20 40 80 60 100 100 5 2.5
10
60
40
100
1.67
3、加入G250试剂
各试管充分混匀后，用取
样器分别加入5.0mL考马 斯亮蓝G250试剂，每加完 一管，立即混合。
2.仍然有一些物质干扰此法的测定。主要干扰物质有：
三、试剂和器材
1、试剂 （1） 考马斯亮蓝G250染料试剂 考马斯亮蓝G-250 100 mg溶于50 ml 95%乙醇中，加入120 ml 85%磷酸，用蒸馏 水稀释至1000 ml。 （2） 标准蛋白质溶液 称取BSA50mg，以0.015mol/L的PBS溶液 50mL溶解，配制成1.0mg/mL的标准蛋白质溶 液，4℃存放。
4、比色
各管室温静置2-5min后，在分光光
度计上测定595nm处的光吸收值 A595，空白对照为1号试管，标准 和待测蛋白同时比色。 注意：不可使用石英比色皿，只能 用玻璃比色皿，使用后立即用少量 95%乙醇润洗，洗去颜色。
5、制作标准曲线
以标准蛋白质浓度（mg/mL）为横坐标，
吸光度A595为纵坐标作图，得到一条 标准曲线。
七.补充
蛋白质含量测定方法比较
蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最
常用、最基本的分析方法之一。目前常用 的有四种古老的经典方法，即定氮法，双 缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法 （Lowry法）和紫外吸收法。另外还有一种 近十年才普遍使用起来的新的测定法，即 考马斯亮蓝法（Bradford法）。其中 Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外 吸收法灵敏10～20倍，比Biuret法灵敏100 倍以上。定氮法虽然比较复杂，但较准确， 往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法 的标准蛋白质。
值得注意的是，这后四种方法并不能在任
何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为 一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可 能得出四种不同的结果。每种测定法都不 是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方 法时应考虑：①实验对测定所要求的灵敏 度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中 存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。 考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突 出的优点，正得到越来越广泛的应用。
思考题 1.考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的原理 是什么？ 2.为什么不能用试管刷来清洗比色皿？ 3.能否将卫生纸塞入比色皿中吸干余液？
考马斯亮蓝染色法的缺点：
1. 由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含
量不同,因此 Bradford 法用于不同蛋白质时有较大的
偏差。在制作曲线时通常选用G-球蛋白为标准蛋白质，
以减少这方面的偏差。
去污剂Triton X-100, SDS和 0.1mol/L的NaOH 3.标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律 进行计算，而只能用标准曲线来测定蛋白质的浓度
五.计算 六.注意事项
1. 蛋白质反应液应该储存在棕色瓶内，可长 期使用，但如果变为绿色，则需要重配 2.比色皿只能用自来水冲洗，蒸馏水、95%乙 醇润洗，不可用试管刷或者其他物品直接 洗刷。 3.玻璃比色皿1套只有4只，可以同时使用， 严禁与其他比色皿混用。 4.分光光度计的吸光值在0.2-0.7时准确度最 高，低于0.1而超出0.1时误差较大，如未 知样品的读数不在此范围内，应将样品做 适当稀释或浓缩。
管号 1 2 3 4 5 6 7
标准蛋白 缓冲液 总体积 质（μ L） （μ L） （μ L） 0 10 20 40 60 80 100 100 90 80 60 40 20 0 100 100 100 100 100 100 100
2、将待测蛋白配成合适浓度
另取3支清洁试管，编号8、9、10，用
由于每种蛋白质与该染料的结合能力不同，故标准 品的选择非常重要，选择尽可能与待测蛋白一致的 样品做标准，能最大限度的提高该方法的准确性。
考马斯亮蓝G250有红蓝两种不同颜色的形式。在
一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色的
溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反 应迅速而稳定。经研究证明，染料主要是蛋白质 中碱性氨基酸和芳香族氨基酸残基相结合。
2．器材
（1）取样器及其架子 （2）试管及试管架
（3）漩涡混合器
（4）微量进样器
（5）VIS-7220可见分光光度计
四、操作方法
1、标准曲线的制作
（1）取7支试管，1号管为空白，2-7 号用微量进样器分别加1.0mg/mL的牛 血清白蛋白溶液10，20，40，60，80， 100μ L，各管用0.015mol/LPBS缓冲 液补充剂100μ L，详见下表，混匀待 用
蛋白质含量的测定
——考马斯亮蓝染色法 （ Bradford 法）
一、实验目的
掌握Brodford法测量蛋白质浓度的原理 和操作技术。
二、实验原理
考马斯亮蓝法是根据蛋白质与染料相结合的原理
设计的，这是一种迅速，可靠的通过染色法测定溶 液中蛋白质浓度的方法。
尽管相对于其他方法来说，此法的干扰物较少，但