(019)初始污染菌检验规程
初始污染菌检验规程
初始污染菌检验规程初始污染菌检验规程1、准备工作1）与供试液接触的所有器具应采用可靠方法灭菌，置压力蒸汽灭菌器内121℃30min。
2）采样数量：每批产品随机抽取10件样品.3）检测标准《GB 15980-1995一次性使用医疗用品卫生标准》：≤100cfu/件次。
4）洗脱液、稀释液采用0.9％无菌氯化钠溶液。
2、试验步骤：1）用无菌手续取出10个样品，分别放入10支装有10ml0.9％无菌氯化钠溶液的试管中，将每个采样管震打80次，混匀，分别吸取1ml放入灭菌平皿，用普通琼脂培养基作倾注培养，置37℃温箱培养48±2h观察结果。
2）用肉眼直接计数，然后用5-10倍放大镜检查，有否遗漏。
若培养皿上有2个或2个以上的菌落重叠，可分辩时仍以2个或2个以上菌落计数。
3）计算公式为：菌数/件次=平均菌数×稀释倍数/件次。
阴性对照试验：将使用的0.9％无菌氯化钠溶液吸取1ml放入无菌平皿中，注入培养基，凝固，倒置培养。
制备2个平板均不得有菌生长。
3、注意事项：1）在无菌操作台上做试验，防止环境对样品的再次污染，采取一切措施防止人为对样本的污染。
2）由于细菌种类繁多，差别甚大，计数时一般用透射光于培养皿背面或正面仔细观察，不要漏计培养皿边缘生长的菌落，并须注意细菌菌落与培养基沉淀的区别，必要时用显微镜鉴别。
编制：审核：批准：ZC-14-8初始污染菌监测操作规程1范围适用于对刚包装好的外科手套和检查手套的初始污染菌的监测和对新购进的小包装（接触手套的小包装）的监测。
第一个月每周进行一次监测，如果监测结果是稳定的以后每个月监测一次，如果3个月都稳定，监测周期改为每季度一次。
2职责质管部负责取样、按ISO 11737进行试验、如试验结果初始污染菌超过6 cfu/cm2,要及时查找原因，提出改进措施，包括工艺中产品防护和进行环境消毒。
3生物负载测定方法A.1概要A.1.1生物负载测定，可使用不同的方法内容。
初始污染菌检测指导书
初始污染菌检测指导书一、引言在日常生活和工业生产中，微生物污染是一个不可忽视的问题。
特别是在食品加工、制药、卫生保健和医疗设施等领域，微生物污染可能对人体健康造成严重影响。
因此，对于这些领域中的设施和设备进行初始污染菌检测至关重要。
本指导书旨在提供一份详细的指南，以帮助进行有效的初始污染菌检测。
二、定义1. 初始污染菌：指在设施和设备投入使用之前，存在于环境中的微生物菌群，可能对人体健康产生影响的细菌、真菌、病毒等。
2. 初始污染菌检测：是通过采集、分离和鉴定设施和设备表面的微生物来评估其是否受到初始污染的检测方法。
三、初始污染菌检测的步骤1. 准备工作在进行初始污染菌检测之前，需要做好以下准备工作：- 确定检测的目标区域：根据需要，确定需要检测的设施和设备区域。
- 收集必要的工具和材料：包括培养基、采样棉签、橡胶手套、消毒剂等。
- 清洁检测区域：确保待检测的区域清洁整齐，以减少外界污染的干扰。
2. 采样- 选择合适的采样方法：根据不同的设施和设备，选择合适的采样方法，常见的包括印迹法、刷子法、划线法等。
- 采样过程中的注意事项：确保采样过程中的卫生条件，佩戴橡胶手套，并在每个采样点上更换新的采样棉签，以避免交叉污染。
- 采样点的选择：根据设施和设备的特点，选择具有代表性的采样点，如接触频繁的表面、接口和难以清洁的区域。
3. 分离与鉴定- 样品处理：将采集到的样品，按照合适的程序进行处理，包括加入适量的培养基，进行可行菌总数的分析。
- 培养与鉴定：将样品在适当的温度和湿度条件下进行培养，待细菌或真菌生长形成菌落后，再通过各种常见鉴定方法（如形态学观察、生化试验、分子生物学技术等）来鉴定菌落的种类。
- 数据记录与分析：将分离鉴定得到的数据记录下来，进行统计和分析，了解初始污染的菌群组成和水平。
四、初始污染菌检测结果的评估与应对1. 结果评估根据初始污染菌检测结果，可以对设施和设备的初始污染情况进行评估。
产品初始污染菌检验操作规程
初始污染菌检验操作规程文件编号：版本：编制/日期：审核/日期：批准/日期：受控状态:8批准实施1 目的为了规范产品初始污染菌检验操作，编制本规程。
2 适用范围本规程适用于产品初始污染菌检验操作。
3 职责3.1 检验室负责对产品初始污染菌检验操作的取样和化验，并填写检验报告；3.2 品管部经理负责签发检查报告。
4 工作程序（《中国药典》2020年版）4.1 供试品数量成品：灭菌前产品至少取3个单位以上。
4.2 供试液制备和接种4.2.1 取样品至少10个，以无菌操作方法移入灭菌的50ml 0.9%NaCl震摇洗脱备用。
4.2.2 用无菌吸管取上述样品洗脱液混合物2ml，分别注入两个灭菌平皿内，每平皿1ml。
另取1ml 注入到9ml灭菌洗脱液中，用手振荡80次充分混匀，使成1:100稀释液，另取一支吸管吸取2ml，分别注入两个灭菌平皿内，每平皿1ml。
4.2.3 将熔化并冷却至45℃左右的大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）倾注于平皿内，每平皿约15ml，另倾注一个不加样品的灭菌空平皿，作空白对照。
随即转动平皿，使样品与培养基充分混合均匀，待琼脂凝固后，翻转平皿，在37±1℃恒温培养48小时，观察结果。
4.3结果观察4.3.1 先用肉眼观察计数菌落，然后再用5-10倍放大镜检查，以防遗漏。
记下各平皿的菌落数后，求出同一稀释度各平皿生长的平均菌落数。
若其中一个平板有较大片状菌苔生长时，则不应采用，而应以无片状菌苔生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。
若片状菌苔的大小不到平板的一半，而其余的一半菌落分布又很均匀时，则可将此一半的菌落数乘2以代表全平板的菌落数，然后再计算该稀释度的平均菌落数。
4.3.2 首先选取平均菌落数在30—300之间的平板，作为菌落总数测定的范围。
当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，即以该平皿菌落数乘其稀释倍数。
4.3.3 若有两个稀释度，其平均菌落数在30—300之间，则应求出两者菌落总数之比值来决定。
初始污染菌检测
2019年5月
10
第十页
细菌形态特征
金黄色葡萄球菌的单个菌落在Baird-Parker琼脂平板上呈圆形,外表光滑、凸起、 湿 润,直径2～3mm。灰黑色至黑色,有光泽,常有浅色(非白色)的边缘,周围绕以不 透明圈 (沉淀),其外常有一清晰带。当用接种针触及菌落时具有黄油样粘稠感。
2019年5月
11
•菌种保藏方法
方法
主要原理
琼脂斜面低温保藏法 液体石蜡保藏法
低温（4℃） 低温，缺氧
干燥（砂土）保藏法 干燥，无营养
冷冻真空干燥法
干燥，缺氧、低 温
液氮超低温保藏法
超低温
选择保藏方法
适用的微生物 广泛 广泛
产孢微生物
广泛
广泛
包藏时间 1～期检查
特点 简便 简便 简便有效 复杂但有效 复杂但有效
•划线别离法
组段间接种环的灭菌、冷却！
分段划线法
2019年5月
27
第二十七页
无菌技术
•金黄色葡萄球菌的保藏
增菌性培养
选择性培养基别离菌种。
2019年5月
一般为冻干粉剂，安瓿瓶 密封包装。
选择性培养基别离菌种。
斜面接种、培养
低温保藏
28
第二十八页
无菌技术
•无菌器材
实验器材 灭菌器材 消毒器材
但凡检验中使用的器材，能灭菌处理的，必 须灭菌处理。如：玻璃器皿、吸管、培养基、 稀释剂、无菌衣、口罩等，在使用前必须经 过适当方法灭菌，并在较洁净的环境中保存 备用。
加均呈正相关性。
衰亡期：稳定期后如再继续培养，细 菌死亡率逐渐增加，以
致死亡数大大超过新生数，群 体中活菌数目急剧下降，出现 了“负生长〞，此阶段叫衰亡期。
初始污染菌检验规程
初始污染菌检验规程1. 目标检测产品、原料、辅料实际带菌（活微生物群）数目。
2. 适用范围适适用于本企业产品、原料、辅料初始污染菌检测。
3.职责由质检部负责实施实施。
4.技术要求产品、原料初始污染菌数：≤100cfu/g5.引用标准GB 15979- _一次性使用卫生用具卫生标准中国药典（）GB/T 14233.2- 医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分：生物学试验方法6.试剂和培养基6.1洗脱液0.9%Nacl称好9gNaCl溶于1000ml蒸馏水中，充足搅拌直至完全溶解，灭菌备用。
6.2胰蛋白胨大豆琼脂培养基取胰蛋白胨大豆琼脂培养基38g，加入1000ml蒸馏水中，微温溶解后，调整PH 为7.3±0.2，灭菌分装。
6.3玫瑰红钠琼脂培养基玫瑰红钠琼脂培养基31.5 g，加入1000ml蒸馏水中，微温溶解后，调整PH为6.0±0.2，灭菌分装。
7.仪器设备锥形瓶量筒高压灭菌锅试管灭菌培养皿灭菌刻度吸管超净工作台酒精灯恒温培养箱洗耳球8.操作方法8.1样品处理8.1.1无菌称取10g能够破坏性类供试品,放入100ml灭菌生理盐水中充足振荡，保温于45℃水浴中5～10min，作为1：10供试液。
8.1.2对供试品不能采取破坏性取样可用浸有没有菌生理盐水拭子涂抹采样，被采表面积100cm2.加入灭菌生理盐水100ml。
保温于45℃水浴中5～10min，不时振摇，作为1：10供试液。
8.2接种8.2.1需厌氧菌取制备好供试液接种于有胰蛋白胨大豆琼脂培养基培养皿中，每支平皿接种1ml供试液，接种3支。
取一支有培养基空白平皿做阴性对照。
8.2.1霉菌取制备好供试液接种于有玫瑰红钠琼脂培养基培养皿中，每支平皿接种1ml供试液，接种2支。
取一支有培养基空白平皿做阴性对照。
8.3培养需厌氧培养基置于37℃培养3d ，霉菌培养置于28℃培养5d9.观察计数达成培养时间后，观察阴性对照，若阴性对照有菌，则试验失败，应重新进行；阴性对照无菌，则可取出平皿计数，统计每个平皿菌落数10.结果计算和汇报10.1公式污染菌总数＝平均菌落数×稀释倍数/克重10.2菌落计数基础规则选择平均菌落数在30～300之间稀释级作为汇报菌落数测定范围。
初始污染菌检验规程
A.3.1接触板
A.3.1.1接触板或玻璃片可用于将凝固的培养基放在样品表面上，使存活微生物能附着在培养基表面，然后再培养接触板或玻璃片，至形成可以计数的菌落。
A.3.1.2该系统的优点在于易于使用，结果与凝固的培养基的接触表面直接相关。
A.3.1.3表面上天然集聚的细胞群、菌落在琼脂介面散布、琼脂干燥、可能存在的厌氧菌等都是潜在的不利因素。
A.2.1.6有些处理方法可能会分解待测产品(例如碎解、袋蠕动和涡旋)。分解的材料会给微生物计数造成困难，这时则需要进行其他处理，如将分解的材料从洗提液中分离出来。应注意保证所得到的计数具有代表性。
A.2.1.7应尽力尽快将试验样品移至试验室。如果必须要推迟转送，试验样品的保存条件应能避免微生物的丢失或改变。应规定贮存的最长时间。干燥可能是微生物数量减少的重要原因，所以在选择贮存条件和贮存时间时应加以考虑
A.4.2.2通常需要一真空或正压(有些情况下)源。应注意避免负压过大，这会引起滤膜变形或损坏。
A.4.2.3进行培养时，滤膜可以放在琼脂表面或放在浸泡了营养媒介的吸水纱布垫上。滤膜表面上形成的菌落可以计数，也可从滤器上分离出来进行定性。A.4.2.4膜过滤尤其适用于微生物浓度较低的悬液。
A.4.2.5从洗提液中取出微生物时，当怀疑液体基质中含有杀灭或抑制微生物时，膜过滤特别适用，先将洗提液中的微生物过滤出来，并可在培养前对滤膜上的微生物进行冲洗。但是有些类型的膜滤器可以吸收或释放抑制微生物生长的物质，所以只使用那些适于给微生物计数的滤膜是很重要的。滤膜和洗提液应相容。
0,1%蛋白胨peptone通用
林格氏溶液
Balgon Ringer1/4强度溶解藻酸钙棉拭
Dissolution of BalBium alginate swaAs
初始污染菌检验操作规程
初始污染菌检验操作规程1.目的测定样品细菌总数可用来判明样品细菌污染的程度，以及生产单位工具设备、工艺流程、生产人员的卫生状况，是对样品进行卫生学评价的综合依据，确定灭菌前产品中微生物的数量和性质，为下一步灭菌提供参考依据。
2.适用范围适用于所有需要消毒灭菌前的产品、洁净车间3．作业条件：3.1无菌检测在洁净度为100级单向流空气区域内进行，严格遵守无菌操作，避免污染。
3.2超净台及工作台面，必须进行洁净度验证。
4．作业方法与步骤4．1制作营养琼脂培养基（参见《培养基制作作业指导书》），培养基需按要求培养16-18H 后，检查无菌生长方可使用。
4．2无菌室洁净度验证4．2．1取3只培养皿在超净工作台平均位置打开上盖，暴露30min后盖好置30～35℃培养48h后检查，3只培养皿上生长的菌落数平均应不超过1个4．3产品采集与样品处理（制备供试液）4.3.1用无菌手续称取10g可以破坏性类供试品,放入100ml灭菌生理盐水中充分振荡，保温于45℃水浴中5～10min，不时振摇。
作为1：10供试液。
4.3.2对供试品不能采用破坏性取样可用浸有无菌生理盐水拭子涂抹采样，被采表面积100cm2.加入灭菌生理盐水100ml。
保温于45℃水浴中5～10min，不时振摇。
作为1：10的供试液。
4.3.3采样数量：各类产品每批随机抽取10件样品。
4.3.4供试液10倍递减稀释4.3.5待上述供试液自然沉降后取上清液1ml，加入9ml生理盐水，制备1：100的供试液。
制备过程中尽量避免碎片等杂物的混入。
4.4接种检验4.4.1取上述供试液上清液作初始污染菌数检测，取4个培养皿，每个稀释级各吸取1ml至每个灭菌平皿，每个稀释级注2个平皿。
4.4.2经灭菌完毕的营养琼脂培养基冷却至45-50 ℃时，倾注上述各个平皿15ml，另倾注一个不加样品灭菌空平皿作空白对照。
以顺时针或逆时针方向快速转动平皿，使供试液与培养基充分混匀。
初始污染菌检测
随着时间的推移，相关法规与标准可能会发生变化。检测机构应关注法规与标准的更新 动态，及时调整自己的检测方法和操作规程。
提高检测效率的建议
优化实验流程
采用自动化设备
加强团队合作
通过合理安排实验流程，减少不必要 使用自动化设备进行初始污染菌检测，
的环节和操作，提高检测效率。例如， 可以大大提高检测效率和准确性。例
培训方式
02
采用理论教学和实践操作相结合的方式，确保采样人员能够熟
练掌握相关技能。
培训考核
03
对完成培训的采样人员进行考核，确保其具备从事初始污染菌
检测工作的能力。
03
检测操作流程
采样
采样点选择
根据检测目的和要求，选择具有代表性的采样点，如食品生产车 间、食品加工设备、食品接触表面等。
采样量控制
在实施过程中，持续监测污染菌 的情况，评估措施的有效性，并 根据需要进行调整和改进。
05
注意事项与建议
保证检测的准确性
选择合适的检测方法
根据不同的污染菌种类和检测目的，选择合适的检测方法， 确保准确性和可靠性。
严格控制实验条件
确保实验室环境、设备、试剂等符合相关标准和规定，避 免交叉污染和误差。
定期校准和验证
对检测设备、仪器进行定期校准和维护，确保其准确性和 可靠性。同时，对检测方法进行验证，确保其符合预期的 检测要求。
遵守相关法规与标准
熟悉相关法规与标准
在进行初始污染菌检测时，应熟悉并遵守国家或地区的相关法规与标准，确保检测合法 有效。
遵循操作规程
按照规定的操作规程进行检测，确保数据的准确性和可靠性，同时避免违反相关法规与 标准。
合理安排样品的处理、培养、观察等 如，自动化细菌分离、鉴定设备等。
初始污染菌检查
初始污染菌检测
供试液制备
•推荐的制备方法
样品制 备
用灭菌剪刀将纱布剪成小块，称取
10g，移入100ml灭菌生理盐水中， 不时振摇。作为1：10供试液。
纱布模拟
供试液制备
供试液10倍递减稀释。 尽量避免丝线等杂物的混入。
梯度稀释 加样
培养
（1）每个稀释级各吸取1ml至每个灭 菌平皿，每个稀释级注5个平皿。
计算公式
菌数/m3= 50000 N AT
式中： A——平板面积，cm2； T——平板暴露时间，min； N——平均菌落数。
标准限值：灭菌和消毒产品分别≤500和 ≤2000cfu/m3
物体表面和生产人员手细菌总 数检测方法
采样方法:
将内径为5cm×5cm的灭菌规格板，放在被检物体表 面，根据物体表面积大小，采平行样1～4个，用浸 有灭菌生理盐水的棉拭子，在规格板内涂抹10次 （往返计为1次），将棉拭子放入10ml灭菌生理盐水 的采样管中。
Ⅱ
Ⅲ
Ⅳ
Ⅴ 菌落均值
阴性 对照
菌பைடு நூலகம்计数基本规则
1、选取平均菌落数在30～300之间的稀释级作为报告菌落数测定范围。 如只有1个稀释级平均菌落数在30～300之间，则将稀释级的菌落数乘以稀 释倍数报告。
2、如有两个相邻稀释级的平均菌落数在30～300之间，则先计算两稀释级菌落 数的比值。 高稀释级的平均平板菌落数×稀释倍数
菌数/cm2=
平均菌数 稀释倍数 采样面积c（ m2）
菌数/每只手=平均菌数×稀释倍数
谢谢
（2）经灭菌完毕的营养琼脂培养基冷却至 45-50 ℃时，倾注上述各个平皿15ml，另 倾注一个注入1ml稀释液（灭菌生理盐水） 灭菌空平皿作阴性对照。按一个方向快速 转动平皿，使供试液与培养基充分混匀。
初始污染菌检验规程
初始污染菌检验规程1、准备工作1）与供试液接触的所有器具应采用可靠方法灭菌，置压力蒸汽灭菌器内121℃30min。
2）采样数量：每批产品随机抽取10件样品.3）检测标准《GB 15980-1995一次性使用医疗用品卫生标准》：≤100cfu/件次。
4）洗脱液、稀释液采用0.9％无菌氯化钠溶液。
2、试验步骤：1）用无菌手续取出10个样品，分别放入10支装有10ml0.9％无菌氯化钠溶液的试管中，将每个采样管震打80次，混匀，分别吸取1ml放入灭菌平皿，用普通琼脂培养基作倾注培养，置37℃温箱培养48±2h观察结果。
2）用肉眼直接计数，然后用5-10倍放大镜检查，有否遗漏。
若培养皿上有2个或2个以上的菌落重叠，可分辩时仍以2个或2个以上菌落计数。
3）计算公式为：菌数/件次=平均菌数×稀释倍数/件次。
阴性对照试验：将使用的0.9％无菌氯化钠溶液吸取1ml放入无菌平皿中，注入培养基，凝固，倒置培养。
制备2个平板均不得有菌生长。
3、注意事项：1）在无菌操作台上做试验，防止环境对样品的再次污染，采取一切措施防止人为对样本的污染。
2）由于细菌种类繁多，差别甚大，计数时一般用透射光于培养皿背面或正面仔细观察，不要漏计培养皿边缘生长的菌落，并须注意细菌菌落与培养基沉淀的区别，必要时用显微镜鉴别。
编制：审核：批准：ZC-14-8初始污染菌监测操作规程1范围适用于对刚包装好的外科手套和检查手套的初始污染菌的监测和对新购进的小包装（接触手套的小包装）的监测。
第一个月每周进行一次监测，如果监测结果是稳定的以后每个月监测一次，如果3个月都稳定，监测周期改为每季度一次。
2职责质管部负责取样、按ISO 11737进行试验、如试验结果初始污染菌超过6 cfu/cm2,要及时查找原因，提出改进措施，包括工艺中产品防护和进行环境消毒。
3 生物负载测定方法A.1 概要A.1.1 生物负载测定，可使用不同的方法内容。
初始污染菌检查课件
阳性结果
在培养基上观察到菌落生长，表 明样品中存在污染菌。根据菌落 的形态、颜色、大小等特征，可
初步判断污染菌的种类。
可疑结果
培养基上观察到的菌落特征不明 显或难以辨认，需要进行进一步
的鉴定。
结果解释与报告
解释污染菌的来源
根据检测结果，分析污染菌可能来自生产环境、操作人员、 原材料等环节，提出相应的改进措施。
在实验过程中，注意个人防护和实验 室安全，避免交叉感染和意外事故的 发生。
实验结束后，按照实验室规定正确处 理废物，保持实验室的清洁卫生。
实验误差控制
严格控制实验条件和操作过程，减小 误差对实验结果的影响，确保实验结 果的准确性和可靠性。
01
初始污染菌检查的 结果分析
结果判读
阴性结果
在培养基上未观察到菌落生长， 表明样品中未检测到污染菌。
01
初始污染菌检查的 实验操作
实验前的准备
实验器材
准备实验所需的所有器材 ，如培养皿、接种环、酒 精灯等，确保其清洁和无 菌。
实验试剂
根据实验要求准备适量的 培养基、生理盐水等试剂 ，确保其质量和有效性。
实验样品
确保样品来源可靠，采集 过程规范，避免交叉污染 和外界污染。
实验操作流程
实验操作步骤
自动化检测技术
自动化检测技术将进一步提高初始污染菌检查的 效率和准确性，减少人为误差。
生物传感器技术
生物传感器技术可用于快速、准确地检测初始污 染菌，具有广阔的应用前景。
应用领域的拓展
食品安全领域
初始污染菌检查在食品安全领域的应用将进一步拓展，涉及食品 生产、加工、储存、运输等各个环节。
医疗领域
初始污染菌检查在医疗领域的应用将更加广泛，涉及医疗器械、药 品、手术室等环境的消毒和灭菌。
(环境管理)初始污染菌检验规程
初始污染菌检验规程1、准备工作1）与供试液接触的所有器具应采用可靠方法灭菌，置压力蒸汽灭菌器内121℃30min。
2）采样数量：每批产品随机抽取10件样品.3）检测标准《GB 15980-1995一次性使用医疗用品卫生标准》：≤100cfu/件次。
4）洗脱液、稀释液采用0.9％无菌氯化钠溶液。
2、试验步骤：1）用无菌手续取出10个样品，分别放入10支装有10ml0.9％无菌氯化钠溶液的试管中，将每个采样管震打80次，混匀，分别吸取1ml放入灭菌平皿，用普通琼脂培养基作倾注培养，置37℃温箱培养48±2h观察结果。
2）用肉眼直接计数，然后用5-10倍放大镜检查，有否遗漏。
若培养皿上有2个或2个以上的菌落重叠，可分辩时仍以2个或2个以上菌落计数。
3）计算公式为：菌数/件次=平均菌数×稀释倍数/件次。
阴性对照试验：将使用的0.9％无菌氯化钠溶液吸取1ml放入无菌平皿中，注入培养基，凝固，倒置培养。
制备2个平板均不得有菌生长。
3、注意事项：1）在无菌操作台上做试验，防止环境对样品的再次污染，采取一切措施防止人为对样本的污染。
2）由于细菌种类繁多，差别甚大，计数时一般用透射光于培养皿背面或正面仔细观察，不要漏计培养皿边缘生长的菌落，并须注意细菌菌落与培养基沉淀的区别，必要时用显微镜鉴别。
编制：审核：批准：ZC-14-8初始污染菌监测操作规程1范围适用于对刚包装好的外科手套和检查手套的初始污染菌的监测和对新购进的小包装（接触手套的小包装）的监测。
第一个月每周进行一次监测，如果监测结果是稳定的以后每个月监测一次，如果3个月都稳定，监测周期改为每季度一次。
2职责质管部负责取样、按ISO 11737进行试验、如试验结果初始污染菌超过6 cfu/cm2,要及时查找原因，提出改进措施，包括工艺中产品防护和进行环境消毒。
3 生物负载测定方法A.1 概要A.1.1 生物负载测定，可使用不同的方法内容。
成品初始污染菌检测操作规程.
成品初始污染菌检测操作规程1、目的:对产品初始污染菌检测的方法做出指导,正确操作以保证实验结果的可靠性和准确性。
2、试用范围:用于检测产品的成品、半成品、部件、原材料、及其内包装袋上的活菌数。
3、职责:实验室操作人员负责操作。
4、试验前准备4.1 按包装说明营养琼脂培养基的配制;4.2与供试液接触的所有器具及制备好的营养琼脂培养基一并放入高压蒸汽灭菌器115℃持续30min,待灭菌器冷却后连同抽取的供试品一并放入无菌室内,启动工作台风机,开紫外线灯30min.4.3环境及人员要求无菌检查应在环境洁净度10 000级下的局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔离系统中进行,其全过程必须严格遵守无菌操作,防止微生物污染,防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室(区悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。
隔离系统按相关的要求进行验证,其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。
无菌检查人员必须具备微生物专业知识,并经过无菌技术的培训。
还应该具有高度的责任心和严谨细致的工作作风。
检验方法55 1胨10g 氯化钠5g 琼脂15-20g 肉浸液1000ml5 2取牛肉浸膏3 g加水1000 ml调节PH为7。
29 mm的细菌培养皿中15-20ml/每个平皿于4。
C保存备用。
5 3从每个清洗批次的产品中随机抽样。
同一批次产品数<503批次产品数为50~1005>10010件。
5 3取样1ml5提液。
5 4接种皿表面在超净止放置至培养皿表面浸液十后进入下一步操作。
5 5培养接37。
C培养48暗时后观察结果。
56结果判定依据GB15980-1995<10cfu/。
初始污染菌检测
初始污染菌检测⼀、⽬的检测产成品初始污染菌是否符合要求⼆、适⽤范围适⽤于⾮灭菌的产成品检验三、职责化验室化验员按标准操作规程检测四、仪器、设备⽣化培养箱、洁净⼯作台、电⼦天平、PH 计、压⼒蒸汽灭菌器、4℃冰箱、酒精灯、250Ml 的三⾓烧瓶、30Ml 试管、⽆菌镊⼦、⽆菌剪⼑、试管架、90mm 玻璃培养⽫、放⼤镜。
五、检验⽅法1.普通⾁汤琼脂培养基的制备 1.1所⽤试剂胨10g 氯化钠5g 琼脂15-20g ⾁浸液1000ml2.产品采集与样品处理于同⼀批号的三个运输包装中⾄少抽取200个最⼩销售包装样品，1/4样品⽤于检测，1/4样品⽤于留样，另1/2样品（可就地封存）必要时⽤于复检。
抽样的最⼩销售包装不应有破裂，检验前不得启开。
在100级净化条件下⽤⽆菌⽅法打开⽤于检测的⾄少10个包装，从每个包装中取样，准确称取25g ±1g 样品，剪碎后加⼊到225ml 灭菌⽣理盐⽔中，充分混匀，得到⼀个⽣理盐⽔样液。
液体产品⽤原液直接做样液。
如被检样品含有⼤量吸⽔树脂材料⽽导致不能吸出⾜够样液时，稀释液量可按每次50倍递增，直到能吸出⾜够测试⽤样液。
在计算细菌菌落总数与真菌菌落总数时应调整稀释度。
⽂件号: QS/CKL03B-ZJ-26-A/0 受控状态⽂件名称：初始污染菌检测SOP 版本号编制时间修改状态：审核时间⽣效⽇期批准时间发放号六、细菌菌落总数与初始污染菌检测⽅法本⽅法适⽤于产品初始污染菌与细菌菌落总数（以下统称为细菌菌落总数）检测。
1.操作步骤量取100 Ml的供试液，采⽤滤膜过滤法，⽤供试液冲洗滤膜表⾯，并确保供试液完全覆盖滤膜表⾯。
（滤膜孔径不⼤于0.45um ；直径50mm）取出滤膜，菌⾯朝上贴于营养琼脂培养基上，做两个平⾏对照，同时做⼀个空⽩对照。
倒置于30℃±5℃恒温培养箱内培养3天，观察并记录结果，空⽩应⽆菌⽣长，若空⽩有菌⽣长该试验则视为⽆效。
2.结果报告计算平板上菌落的平均值，再将平均值乘以相应的稀释倍数作为每克（g）/毫升(Ml)样品中平板菌落数。
(019)初始污染菌检验规程
1、目的通过检验产品的初始污染菌，了解产品在生产过程中受微生物的情况，以便更好地提高产品质量。
2、范围本方法适用于本公司生产的一次性使用静脉输液针（简称：输液针）、一次性使用无菌配药注射器带针（简称：配药注射器）、一次性使用无菌注射器带针（简称：注射器）、一次性使用输液器带针（简称：输液器）、一次性使用袋式输液器带针（简称：袋式输液器）及其配件、无菌产品初始包装等的初始污染菌的检验。
3、依据GB 15979-2002 一次性使用卫生用品卫生标准中华人民共和国药典2010版第二部GB 8368 一次性使用输液器GB/T 19973.1-2005 （ISO 11737-1:1995）医疗器械的灭菌微生物学方法第1部分:产品上微生物总数的估计GB 15980 一次性使用医疗用品卫生标准4、要求灭菌产品管道类内腔污染菌数：应≤10cfu/件次，外部应≤100cfu/件次；非管道类应≤100cfu/件次；敷料类应≤100cfu/g；消毒产品应≤1000cfu/件次或重量（g），具体见表1。
5 检验方法5.1卵磷脂、吐温80－营养琼脂培养基的配制：成份：蛋白胨 20 g牛肉膏药 3 g氯化钠 5 g琼脂 15 g卵磷脂肪 1 g吐温80 7 g蒸馏水 1000 g制法：先将卵磷脂加到少量蒸馏水中，加热溶解，加入吐温80，将其他成分(除琼脂外)加到其余的蒸馏水中，溶解。
加入已溶解的卵磷脂、吐温80，混匀，调pH值为7.1～7.4加入琼脂，121℃高压灭菌20min，储存于冷暗处备用。
5.2 样品采样数量：各类产品每批随机抽取10件样品。
5.3 供试液制备5.3.1.供试品是敷料、可以破坏性类可用无菌手续称取10g,放入100ml灭菌生理盐水中充分振荡后取样。
作为1：10的供试液。
5.3.2.供试品是液体取10ml加至100ml灭菌生理盐水中充分振荡后取样。
作为1：10的供试液。
5.3.3.对供试品不能采用破坏性取样可用浸有无菌生理盐水拭子涂抹采样，被采表面积为100cm2，加入灭菌生理盐水100ml。
成品初始污染菌检验规程
成品初始污染菌检测操作规程1、目的：对产品初始污染菌检测的方法做出指导，正确操作以保证实验结果的可靠性和准确性。
检验依据：GB/T 19973.1 EN ISO 11737-12、试用范围：用于检测产品的成品、半成品、部件、原材料、及其内包装袋上的活菌数。
3、职责：实验室操作人员负责操作。
4、试验前准备4.1 按包装说明营养琼脂培养基的配制；4.2与供试液接触的所有器具及制备好的营养琼脂培养基一并放入高压蒸汽灭菌器115℃持续30min,待灭菌器冷却后连同抽取的供试品一并放入无菌室内,启动工作台风机,开紫外线灯30min.5.供试液制备及接种5.1内腔供试液制备：气管插管、喉罩气道导管、鼻氧管、呼吸回路管等管路：在无菌条件下向每套管路的内腔注入浸提介质各20ml,作为供试液,反复荡洗5次,然后将每套管路内腔内的供试液汇集到一无菌具塞试剂瓶内,待混匀后在从瓶内各抽取1ml供试液分别加入10个无菌的空平皿内,最后在将灭了菌凉至45℃的熔化营养琼脂培养基倾注于已加入供试液的平皿中,每平皿中加入培养基量为15-20ml。
作为1：1的供试液。
注气筒：每支注射器抽取灭菌生理盐水至公称容量，振摇5次，汇集到一无菌具塞试剂瓶内,待混匀后在从瓶内各抽取1ml供试液分别加入10个无菌的空平皿内,最后在将灭了菌凉至45℃的熔化营养琼脂培养基倾注于已加入供试液的平皿中,每平皿中加入培养基量为15-20ml。
作为1：1的供试液。
5.2外部供试液制备：按产品外表面积每10cm2用1mL的灭菌生理盐水冲洗，作为1：1的供试液。
用棉拭子在待检产品表面往返涂抹10次后，将棉试子放入10ml灭菌生理盐水的试管中,将试管震打80次混匀作为供试液,然后再分别取1ml供试液放入2个无菌的空平皿内,最后在将灭了菌凉至45℃的熔化营养琼脂培养基倾注于已加入供试液的平皿中,每平皿中加入培养基量为15-20ml.将所取10套供试品分别按上述方法进行供试液制备及接种。
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1、目的
通过检验产品的初始污染菌，了解产品在生产过程中受微生物的情况，以便更好地提高产品质量。
2、范围
本方法适用于本公司生产的一次性使用静脉输液针（简称：输液针）、一次性使用无菌配药注射器带针（简称：配药注射器）、一次性使用无菌注射器带针（简称：注射器）、一次性使用输液器带针（简称：输液器）、一次性使用袋式输液器带针（简称：袋式输液器）及其配件、无菌产品初始包装等的初始污染菌的检验。
3、依据
GB 15979-2002 一次性使用卫生用品卫生标准
中华人民共和国药典2010版第二部
GB 8368 一次性使用输液器
GB/T 19973.1-2005 （ISO 11737-1:1995）医疗器械的灭菌微生物学方法第1部分:产品上微生物总数的估计
GB 15980 一次性使用医疗用品卫生标准
4、要求
灭菌产品管道类内腔污染菌数：应≤10cfu/件次，外部应≤100cfu/件次；非管道类应≤100cfu/件次；敷料类应≤100cfu/g；消毒产品应≤1000cfu/件次或重量（g），具体见表1。
5 检验方法
5.1卵磷脂、吐温80－营养琼脂培养基的配制：
成份：
蛋白胨 20 g
牛肉膏药 3 g
氯化钠 5 g
琼脂 15 g
卵磷脂肪 1 g
吐温80 7 g
蒸馏水 1000 g
制法：先将卵磷脂加到少量蒸馏水中，加热溶解，加入吐温80，将其他成分(除琼脂外)加到其余的蒸馏水中，溶解。
加入已溶解的卵磷脂、吐温80，混匀，调pH值为7.1～7.4加入琼脂，121℃高压灭菌20min，储存于冷暗处备用。
5.2 样品采样数量：各类产品每批随机抽取10件样品。
5.3 供试液制备
5.3.1.供试品是敷料、可以破坏性类可用无菌手续称取10g,放入100ml灭菌生理盐水中充分振荡后取样。
作为1：10的供试液。
5.3.2.供试品是液体取10ml加至100ml灭菌生理盐水中充分振荡后取样。
作为1：10的供试液。
5.3.3.对供试品不能采用破坏性取样可用浸有无菌生理盐水拭子涂抹采样，被采表面积为100cm2，加入灭菌生理盐水100ml。
作为1：10的供试液。
5.3.4.可用破坏性方法取样供试品：（参照中华人民共和国药典2005年规定进行)
5.3.5 供试品为输液器（或袋式输液器）及注射器（或配药注射器）产品的供试液制备
5.3.5.1内腔供试液制备：每套输液器内腔注入20mL（袋式输液器注入量为280 mL）灭菌生理盐水,振摇5次，汇聚在一无菌及无热原的烧杯中。
作为1：1的供试液。
每支注射器抽取灭菌生理盐水至公称容量，振摇5次，汇聚在一无菌及无热原的烧杯中。
作为1：1的供试液。
5.3.5.2外部供试液制备：按产品外表面积每10cm2用1mL的灭菌生理盐水冲洗（可用无菌棉拭子沾无菌生理盐水在输液器表面往返涂抹10次后，将棉试子放入10ml灭菌生理盐水的试管中,将试管震打80次混匀作为供试液），汇聚在一无菌及无热原的烧杯中。
作为1：1的供试液。
5.3.6 供试品为注射针或溶药针产品的供试液制备
除去单包装，内外表面积每10cm2用10mL的灭菌生理盐水冲洗，汇聚在一无菌及无热原的烧杯中[或将1支注射针直接完全浸入10mL无菌、无热原的生理盐水中每支注射针内外表面积约5cm2）]。
作为1：20的供试液。
5.3.7 供试品为输液针产品的供试液制备
5.3.7.1内腔供试液制备：每支输液针内腔缓慢注入5 mL灭菌生理盐水，汇聚在一无菌及无热原的烧杯中。
作为1：5的供试液。
5.3.7.2 外部供试液制备：除去单包装，外表面积每10cm2用10mL的灭菌生理盐水冲洗，汇聚在一无菌及无热原的烧杯中。
作为1：10的供试液。
5.3.8 供试品为扩张器产品及无菌产品初始包装的供试液制备
按产品外表面积每10cm2用1mL的灭菌生理盐水冲洗（可用无菌棉拭子沾无菌生理盐水在产品内表面往返涂抹10次后，将棉试子放入10ml灭菌生理盐水的试管中,将试管震打80
次混匀作为供试液），汇聚在一无菌及无热原的烧杯中。
作为1：1的供试液。
5.4 移至培养基（平板倾注法）
将每样取3份平行样，每个稀释级各吸取1ml（不超过45℃）至每个灭菌平皿，也就是每个稀释级注3个平皿。
经灭菌完毕的营养琼脂培养基冷却至45～50 ℃时，倾注上述各个平皿15ml，另倾注一个不加样品灭菌空平皿作空白对照。
以顺时针或逆时针方向快速转动平皿，使供试液与培养基充分混匀。
冷却后将已经凝固的平板倒置于37℃培养箱中，一般培养48±2h。
注：对于液体基质中含有杀灭或抑制微生物时，采用0.45µm孔径滤膜过滤，再将滤膜移至培养基平皿中，具体详见GB/T 19973.1-2005中A.4.2.6.2膜过滤法（薄膜过滤器。
国产的价格大概500元左右，全套的话可能要在1000~2000.1.供试液制备：取定量或定重的样品，浸泡至一定量的浸提液（0.9%无菌氯化钠溶液或者pH=7.0蛋白胨-氯化钠溶液）中，浸提30min，此溶液即为供试液。
2.将薄膜过滤器的薄膜用0.9%无菌氯化钠溶液浸湿，然后将浸提液无菌操作倒入过滤器中过滤，在完全滤完前，倒入一定量的0.9%无菌氯化钠溶液作为冲洗液。
3.取出滤膜，贴在营养琼脂培养基上，倒置培养。
这个主要是基本步骤，根据不同情况还有其它问题。
可以参考中国药典2005年版附录无菌检查法）。
5.5计数方法：将平板置菌落计数器或从平板的背面直接以肉眼用标记笔点计，以投射光衬以暗色背景，仔细观察，计数。
必要时可以借助于放大镜、菌落计数器。
菌落特征：⑴形态特征：常为白色、灰白色或灰色，亦有淡褐色、淡黄色（如果培养基中加入0.1%TTC试剂，菌落为红色）
⑵边缘整齐或不整齐，表面有光滑、粗糙，皱褶、突起或扁平。
⑶大小差异很大。
5.6计算公式为：
平均菌数×稀释倍数
菌数/每件次（或g）=
件次或重量（g）
6 检验规则
6.1 若每个平行样中无菌或菌落数小于或等于表1时，则报出菌数符合规定。
6.2 产品的初始污染菌是为一次/周。
6.3 产品取样应在完成整个包装过程以后，而又在灭菌前从大包装内取；对零组件取样应在流入下道工序之前取样。
7．注意事项
7.1供试品的取样必须在万级环境中100级净化条件下，无菌操作，防止污染。
7.2应严格遵守无菌操作，同时消除抑菌成份的干扰。
7.3 外部污染菌数超标一般为工人的的手污染菌数超过300cfu/只手或操作台面污染菌数超过20cfu/cm2，这时应增加工人的手消毒频次及对手消液的杀菌效果进行重新验证或对操作台面用75%酒精过行消毒。
7.4进入无菌室的控制
a、定期检查无菌环境的空气是否符合规定；
b、无菌室在使用前开启紫外线灯30～60min进行空气消毒；
c、在进行接种倾注琼脂平板均需在无菌室超净工作台或接种罩内操作;
d、检查一切进入无菌环境的器材灭菌、消毒的标志物是否完备；
e、洗手消毒：首先用肥皂涂在手上揉搓10～15s，肥皂虽不杀菌，有去污作用，然后用流水彻底冲洗，可有效除去手上大多数暂住菌，如连续洗2～3次(视手的污染程度)，使残余的微生物减少到最低水平，再用消毒液洗手，如洗必泰、苯扎溴铵、碘伏、乙醇、过氧乙酸等。
f、操作人员将手部消毒后，再穿戴无菌工作服(包括鞋、帽、口罩等)。
严格的无菌服应是戴帽套头的无扣的上衣，颈部、脸部及袖口是紧口的，以保护身体，防止污染。
一般的无菌衣是背开口，围胸部、紧扣颈部与长袖紧口的，以保护身体，防止污染。
g、在进入无菌室后，进一步用浸有消毒液的棉球或泡沫塑料物消毒手，然后可进行检验或实验操作。
7.5检验过程的控制
a、在所有操作中均不应大幅度或快速动作，以免搅动空气中尘埃微粒。
b、使用玻璃器皿应轻取轻放，避免破损，以防培养物扩散。
c、在近火焰区操作。
d、使用金属接种器具、用前、用后均需燃烧灭菌。
e、应用橡胶乳头套在吸管上端，吸吹供试液或培养液等，切勿用嘴直接吸吹吸管。
f、用注射器吸取样品、培养物时，注射器内应无空气；装卸针头时应用灭菌的镊子；从密封容器内抽取液体时，应注入无菌空气；带液体的针筒针头应向上倾斜，并用75%乙醇棉球 (挤干)保护针头根部；注射时勿用力过猛，以免内容物喷出或针头脱落使溢出液体污染灭菌器材或环境。
g、当灭菌瓶塞或试管塞掉落在工作台上，一般不宜再用，应另换无菌塞，或通过火焰处理后再用。
7.6意外事故的控制
a、假定无菌衣受污染，应脱下翻转包裹，使污染部分包在内部，送往消毒，经灭菌后，洗涤再用。
b、因偶然打破盛有培养物的器皿，致使病原性的菌毒种外溢，污染了工作室及操作者的衣物及体表时，当事人应冷静，切勿乱动以免扩大污染面。
应唤他人用浸透消毒液的毛巾或纱布覆盖于碎片上，或将消毒液倒在污染区，浸没一定时间。
先从外至内逐步清理污染源，最后将衣物彻底灭菌。
清理时应避免用手指收集玻璃碎片,以防污染皮肤，造成病原性微生物感染事故。
c、对一般小面积的污染可自行处理，较大范围的污染则请人协助。