【精品课件】紫杉醇的生物合成
紫杉醇的合成
2.重组菌的构建及影响
图1.在下游途径恒定的情况下改变上游途径的强度对紫杉二烯积累的影响
图2.在恒定的上游途径下依赖于下游途径的紫杉二烯的变化
图3.在两个不同的下游途径表达（31和61个任意单位）及菌株1724的上游途径高度过表达时紫杉二烯的变化；
图4.通过增强启动子使两个不同的下游途径表达（31和61个任 意单位）来调整上游途径基因的整合
补料分批式培养的基因工程菌在1l发酵罐中的发酵情况?通过跨膜转运工程tm和cyp450酶类嵌合体的产生使某些植物的cyp450和细胞色素还原酶cpr已可在大肠杆菌中表达为生物合成的功能性分子构建了嵌合体酶at24t5aohttcpr使第一步氧化反应能高效地进行导致至少98的紫杉二烯转化为紫杉二烯5醇并有少量环己烷产生嵌合体酶at24t5aohttcpr产生紫杉二烯5醇的能力提高了两倍以上达到了21mgl嵌合体酶的的表达功能可变如可构建为at8t5aohttcprat24t5aohttcpr及at42t5aohttcpr导致出现了复杂的结构重排使紫杉二烯被环醚化
E.重组大肠杆菌K12MG1655 DrecADendA；EDE3-重组大肠杆 菌K12MG1655 DrecADendA在 RNA聚合酶的作用下将DE3 T7启 动子结合；MEP, dxs-idi-ispDF 启 动子; GT, GPPS-TS 启动子; TG, TS-GPPS启动子; Ch1,染色体1个拷 贝; Trc, Trc启动子; T5, T5启动子; T7, T7 启动子; p5, pSC101 质粒; p10, p15A 质粒; p20, pBR322 质粒
Author: Parayil Kumaran Ajikumar, Wen-Hai Xiao, Keith E. J. Tyo, et al
《紫杉醇的生物合成》课件
02
紫杉醇生物合成途径
前体物质的合成
葡萄糖磷酸化
葡萄糖在己糖激酶的催化下磷酸化生成6-磷酸葡萄糖。
磷酸戊糖途径
6-磷酸葡萄糖在磷酸戊糖异构酶的作用下生成5-磷酸核酮糖，再经过一系列反 应生成5-磷酸木酮糖和5-磷酸核糖。
紫杉二烯的合成
甲羟戊酸途径：5-磷酸木酮糖在酮糖 基转移酶的催化下生成4-丙二醇焦磷 酸，再经过一系列反应生成法呢烯焦 磷酸，最后生成牻牛儿基牻牛儿酯。
紫杉二烯合成酶
负责将前体物质转化为紫杉二烯，是紫杉醇生物合成的关键酶之一。
基因克隆与鉴定
通过基因克隆和鉴定，了解紫杉二烯合成酶的结构和功能，为人工合成紫杉醇提 供理论依据。
紫杉醇合成酶与基因
紫杉醇合成酶
负责将紫杉二烯进一步转化为紫杉醇，是紫杉醇生物合成的最后一步。
酶活性调节
研究紫杉醇合成酶的活性调节机制，探索如何提高紫杉醇的产量。
牻牛儿基牻牛儿酯在细胞色素P450酶 系的作用下生成紫杉二烯。
紫杉醇的合成
01
紫杉二烯在细胞色素P450酶系的 作用下生成5α-柯巴基焦磷酸，再 经过一系列反应生成巴卡亭Ⅲ。
02
巴卡亭Ⅲ在巴卡亭酶的作用下生 成巴卡亭Ⅳ，再经过一系列反应 生成紫杉醇。
紫杉醇的修饰与转运
紫杉醇在细胞色素P450酶系的作用下经过氧化、还原、水解等反应生成多种具有抗癌活性的代谢产 物。
代谢工程
对微生物的代谢网络进行改造，优化紫杉醇的合成途径。
利用合成生物学技术构建紫杉醇生产菌株
构建基因编辑工具
利用CRISPR-Cas9等基因编辑技术，实现对紫杉醇生产菌株的精 准编辑。
构建高产菌株
通过基因工程技术，将紫杉醇合成相关基因导入到高产菌株中，构 建出具有高生产能力的紫杉醇生产菌株。
紫杉醇生物合成途径的关键缺失酶
紫杉醇生物合成途径的关键缺失酶紫杉醇是一种在抗癌药物中应用广泛的有效成分，广泛应用于治疗卵巢、乳腺和前列腺等多种癌症。
其药效显著，但由于紫杉醇在天然来源中含量较低，而化学合成成本高昂，因此人们开始关注紫杉醇的生物合成途径。
紫杉醇的生物合成途径中有一些关键的酶缺失，这限制了其高效生物合成的实现。
本文将从紫杉醇的生物合成途径、关键缺失酶以及可能的解决方案等方面进行探讨。
一、紫杉醇的生物合成途径紫杉醇的生物合成途径主要包括二萜醇、喹啉和紫杉醇三个关键中间体的合成。
其中二萜醇主要通过异戊二烯二醇合成酶（GGPPS）和色胺酸脱羧酶（TDC）催化合成，喹啉则通过二萜醇氧化酶（T5OH）和喹啉合酶（DBAT）合成，最后通过紫杉醇合酶（TS）合成紫杉醇。
这一生物合成途径中的关键缺失酶主要是喹啉合酶（DBAT），其功能是将二萜醇氧化酶（T5OH）合成的喹啉与GPP（异戊二烯二磷酸）反应形成紫杉醇的前体酮氧化环辛烯烷酮。
二、关键缺失酶DBATDBAT是紫杉醇生物合成途径中的关键酶，其缺失导致了紫杉醇生物合成的受阻。
DBAT的缺失主要表现在以下两个方面：1.缺乏高效的DBAT酶目前已知的DBAT酶在催化喹啉合成环辛烯酮的过程中效率较低，而且受底物抑制的影响较为显著。
由于DBAT酶的低效率和受抑制作用，导致紫杉醇的生物合成效率较低，制约了其在医药领域中的广泛应用。
2.缺乏功能稳定的DBAT酶基因在紫杉醇的生物合成途径中，对DBAT酶基因的缺失限制了人们通过基因工程技术来提高DBAT酶的活性和稳定性。
缺少功能稳定的DBAT 酶基因限制了对紫杉醇生物合成途径的深入研究和应用。
三、解决方案针对DBAT酶的关键缺失，可以从以下几个方面来解决：1.发现高效的DBAT酶目前，科研人员可以通过对微生物和植物中进行广泛筛选，以寻找具有较高活性和稳定性的DBAT酶。
通过对这些酶的深入研究和改良，可以为紫杉醇的生物合成途径提供更多的选择。
紫杉醇的生物合成路线
紫杉醇的生物合成主要通过以下步骤进行：
1. 鲨鱼烯的合成：鲨鱼烯是一种二十碳五烯，是紫杉醇生物合成的前体物质。
在生物合成过程中，鲨鱼烯通过一系列的酶促反应转化为紫杉醇。
2. 环合反应：鲨鱼烯在环合酶的催化下，形成紫杉烷环。
这一步是紫杉醇生物合成的关键步骤，环合酶的活性和特异性对紫杉醇的产量和质量具有重要影响。
3. 侧链的添加：在紫杉烷环形成后，通过一系列的酶促反应，将侧链添加到紫杉烷环上。
这些侧链包括乙酰基、羟基、甲基等，对紫杉醇的生物活性具有重要影响。
4. 氧化的修饰：在紫杉醇生物合成的最后阶段，通过氧化酶对紫杉醇进行氧化修饰，形成紫杉醇。
紫杉醇及其衍生物的研究ppt课件
紫杉醇的改造及其衍生物
三尖杉宁碱( cephalomannine,2) [3]和紫杉醇结构十分相似, 仅在侧链部分有 细微的区别, 且其在红豆杉中的含量仅次于紫杉醇。以三尖杉宁碱为原料, 通 过对其侧链双键的催化氢化及环氧化反应, 分别得到两对非对映异构体, 制备 HPLC分离得到四个化合物, 通过NMR及CD谱确定化合物的立体结构, MTT实验 表明四个化合物对某些肿瘤细胞株的抑制活性优于紫杉醇。合成化合物的稳 定微管活性研究正在进行中。
紫杉醇及其衍生物的研究来自目录1、红豆杉介绍 2、紫杉醇的研究 3、紫杉醇开发途径和合成方式 4、紫杉醇的改造和衍生物 5、对紫杉醇的展望
红豆杉属植物是一类古老的植物类群，全世界有11种，分布于 北半球的温带至热带地区。除澳洲的Austrotaxus Spicata一种产 于南半球之外，其余红豆杉均产于北半球。从红豆杉的地域分 布上看，美国、加拿大、法国、印度、缅甸和中国等地都有分 布，但属亚洲的储量最大，其中，中国境内的红豆杉就占全球 储量的一半以上。中国有4种1变种，黑龙江省只有东北红豆杉1 种，天然分布很少。不过东北红豆杉主要分布在吉林省长白山 和黑龙江一带，辽宁东部山区也有少量分布。其分布特点是： 分布区域狭窄，面积小，并呈间断分布，散生在其它群落中， 天然更新少，在绥阳林业局紫杉分布相对较密的林地约3600公 顷，主要分布在寒葱河、青山、三岔河、细鳞河等林场。云南 红豆杉主要分布在 滇西与地州16个县总面积约9万平方公里， 其特点是分布广， 生长分散，无纯林，多为林中散生木。南方 红豆杉主要分布在滇东、滇西南、滇东纯林，多为林中散生木。 湖南省邵阳市绥宁县朝仪乡老湾村、永州市双牌县阳明山绞车 庙村、安徽省黄山市黄山区等地分布大量天然红豆杉。
紫杉醇的改造及其衍生物
紫杉醇有机全合成PPT课件
❖ ② 完成了紫杉烷骨架的构建； ❖ ③ 首次合成紫杉烷类化台物taxtusin； ❖ ④成功地半合成紫杉醇，并用于工业化生产； ❖ ⑤发展了可定量转化的环氧醇裂解反应，用于合成
种种含双环[5、3、1]骨架的有机分子 D]；@完善 并丰富了Chart重排反应和Dieckmann环化反应。
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二、Nicolaou全合成路线(1994)
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verhenon
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五、 Kuwajima全合成路线(1998)
日本东京科技研究院Isao Kuwajima教授领导 的紫杉醇全合成研究小组采用了A+c—Ac—ABc —ABcD的会聚法合成路线 ∞ ，其类似于Nico— laou法和Danishefsky法。由
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由炔丙醇(propargyl alco—ho1)为起始物经过 16步反应制备了含A环体系的化合物39，再与含 c环结构的化合物4O偶合得到含AC环的化合物4l、 42，化合物42通过一个新颖的环化反应完成八元 B环的构建从而得到含ABC环骨架的化合物43， 进一步反应可得到化合物44、45，通过环丙烷中 问体在化合物45中引人C一8位甲基得到化合物 46，在通过一系列引人保护基团完成c一1O位乙 酰化得到化合物47，再通过臭氧化等反应完成含 氧D环的合成。最终制备出baccatin III(2)和紫杉 醇(1)(图8)。
植物组织细胞培养生产紫杉醇的研究进展PPT课件
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2021
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筛选出高产的细胞株系
• • •
紫杉醇含量 高的外植体
诱导
•
愈伤组织
变异
高产细胞 • 植株
细胞克隆技术筛选
• 目前，主要运用现代生物基因工程的方法来获得高产 细胞系
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问题与前景
①红豆杉属植物组织细胞培养中的褐化现像，尚无 良好的解决办法【8】
②紫杉醇本身是一种细胞生长的毒性物质,其量的 积累愈多,对细胞增殖的抑制越强.,即使添加真菌 诱导子及生物合成前体,组织细胞培养生产紫杉醇 也难以达到产业化应用水平【10】,
学,Journal of Anhui Agri.Sci.2006,34(2):257-258 • [5]邢建民,查丽杭,李佐虎,刘大陆.植物细胞培养生产紫杉醇的研究进展.植物学通报,1997,14(3):22～
29 • [6]Fett-Neto A.G.et al.1994a Biotechnol.Bioeng.44P205～210 • [7]胡凯,何颖,祝顺琴,谈锋,唐克轩.红豆杉细胞悬浮培养生产紫杉醇的研究进展.《天然产物研究与开
taxoids production: a literature survey.Plant Cell Tuiss. Org.Cult.,1996;46:59-75 • [11]周忠强,梅兴国.红豆杉细胞培养生产紫杉醇的研究进展.中南民族大学学报(自然科学
版)Journal of South-Central University for Nationalities(Nat.Sci.Edition).第23卷第1期2004年3月 • [12] Wickerenesinhe E.R.M.andR.N.Artac.1994.J.Plant physil.144:183~193 • [13]李丽琴,余龙江,高产红豆杉细胞系的建立与评价
有机合成课件——Chapter紫杉醇和青蒿素的全合成分析36页PPT
71、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。——康德 72、家庭成为快乐的种子在外也不致成为障碍物但在旅行之际却是夜间的伴侣。——西塞罗 73、坚持意志伟大的事业需要始终不渝的精神。——伏尔泰 74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。——屈原 75、内外相应，言行相称。——韩非
有机合成课件——Chapter紫杉醇和青 蒿素的全合成分析
21、静念园林好，人间良可辞。 22、步步寻往迹，有处特依依。 23、望云惭高鸟，临木愧游鱼。 24、结庐在人境，而无车马喧；问君 何能尔 ？心远 地自偏 。 25、人生归有道，衣食固其端。
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紫杉醇的生物合成
紫杉醇的生物合成吴雪琼田朝霞梅兴国(华中理工大学生物系,武汉430074关键词紫杉醇生物合成1.引言紫杉醇(Paclitaxel,商品名为T axo l,是从紫杉树皮中分离提取到的一种天然抗肿瘤物质。
1992年,美国FDA已批准将其用于治疗难治的卵巢癌和转移性乳腺癌。
紫杉醇独特的抗癌活性机制在于它属于有丝分裂抑制剂或纺锤体毒素,不但能抑制细胞的有丝分裂、纺锤体和纺锤丝的形成,从而阻止癌细胞的繁殖,而且能通过诱导和促进微管蛋白的聚合和装配,阻止微管发生解聚,使微管稳定,因而对于许多耐常规化疗药物的肿瘤有活性,应用前景十分广阔。
现在,随着紫杉醇应用范围的不断扩大,该药的需求量远远大于供应量,药源短缺这一矛盾不断深化。
为解决这一矛盾,国内外正积极发展相关技术以期开发紫杉醇的新来源,如化学全合成法、半合成法、人工栽培繁殖法、组织细胞培养法等等。
其中,生物合成紫杉醇或利用生物转化方法对其结构进行修饰与改造以获取“第二代紫杉醇类抗癌药”将是最有希望的一条解决途径。
对细胞培养中紫杉醇生物合成途径的研究,特别是对其中限速步骤的确定和调控,将大大提高细胞培养中紫杉醇的产量,使细胞培养的产业化成为可能,同时,对紫杉醇进行生物转化,以获得更高效、低毒的第二代紫杉醇类抗癌药也是十分必要的。
2.紫杉醇的生物合成2.1母核的形成在90年代以前,人们对紫杉醇的生物合成途径起始阶段几乎一无所知。
只是到近年来,科学家们才逐步揭开其神秘的面纱。
1991年N edea等通过(3R[2214C]和(3R S(5R S[523H]甲羟戊酸在T. canad ensis 植物体内的标记实验揭示了紫杉醇的母核是甲羟戊酸途径的产物[1、2]。
1995年,华盛顿州立大学C ro teau及其同事们终于确定了紫杉醇生物合成起始的一步,即紫杉醇A、B、C三环结构的形成[3]。
反应是紫杉醇前体双牛基焦磷酸的环化,形成紫杉24(5,11(122二烯(图1。
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菌株的改良
用紫外线等诱变 利用原生质体诱变 利用双亲灭活原生质体融合 基因工程技术
内生真菌生产紫杉醇的优势
• 生产的可重复性，在工业上可用发酵罐大规模进行 生产，内生真菌生长迅速，易于培养，生产周期短。
• 微生物能在简单的培养基上生长，应用的培养基相 对比较便宜，在收集紫杉酵之前，可以通过改良培 养环境、改进技术来提高产量。
1
内生真菌的分离
2
内生真菌培养测
5
紫杉醇的纯化
内生真菌的分离
• 将植物材料用70％酒精进行表面彻底消毒， 风干后，用无菌刀片切除外部组织，将修整 好的内部组织放在水琼脂培养基上，经过一 段时间的培养后，真菌便生长出来。
• 然后，将分离出的内生真菌菌丝尖端转移到 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上，室温培 养至少10d，检查真菌培养平板，不断纯化， 最终获得纯种的内生真菌，同时立即放入含 15％甘油中，-70℃保存，以备发酵使用。
工艺过程
• 细胞悬浮培养：培养基为含1ppm的2，4-D、 0.05ppm的KT及10%椰乳的B-5培养基
• 红豆杉细胞大量培养：培养基与悬浮细胞培养基相 同。在反应器中加入培养液，灭菌后冷却至室温， 接种已经培养30天的悬浮培养细胞，接种量按干细 胞1到2克每升，在25摄氏度下，培养30天，待收获 细胞。
１９９３年，民营企业云南汉德公司成立，其主要业务是从红豆杉中提 取紫 杉醇。１９９５年，汉德公司依靠中科院昆明植物研究所的技术，建成 了中 国最大的年生产能力５０公斤的紫杉醇及其系列产品生产线。１９９９ 年２ 月，该厂的产品还通过了美国ＦＤＡ认证，“顺利扫清了通向美国市场 的障 碍”。
云南省人民政府生物资源开发创新办公室的资料说，汉德公司的紫杉醇 年出 口量为２０—３０公斤（１公斤紫杉醇需用树皮１５—３０吨）。目前 ，中 美合资的汉德生物技术开发有限公司已被云南省列为生物资源开发、出 口创 汇的骨干企业，备受各方重视。２０００年底，该公司与美国签订了价 值６ 亿多元的供货合同。
• 1996年，从西藏红豆杉小枝的内皮层中分离得到的 内生小孢拟盘多毛孢，实验证明它能产生紫杉醇。
• 后来，人们发现从美国南卡罗来纳州柏树的树皮中 获得的小孢拟盘多毛孢、一种土生茜草科植物中分 离得到的内生真菌也能产生紫杉醇
• 我国科研工作者在东北红豆杉、南方红豆杉、云南 红豆杉中均找到产紫杉醇的真菌
在中国，获得紫杉醇产品开发权的还有北京协和制药厂。
从1992年到2001年，将近10年时间，云南红豆杉遭到了毁灭性的破坏，分布 在滇西横断山区中的300多万棵红豆杉，绝大部分被剥了皮（有调查数据认为 是92.5%），现正在慢慢死去。
植物细胞培养
1
愈伤组织培养
2
愈伤组织的继代培养
3
悬浮细胞培养
4
细胞大量培养
• 微生物育种和选育速度会明显高于植物细胞株。
• 增加微生物的生产能力比较容易，微生物易于通过 基因工程等方法筛选高产菌株，提高紫杉醇的产量。
• 药厂利用微生物规模化发酵生产的技术比较成熟， 其培养与发酵条件相对易于控制和掌握，即微生物 发酵法生产紫杉醇的转产风险明显小于细胞培养法 与化学合成法。
利用内生真菌生产红豆杉的过程
工艺过程
• 红豆杉外植体的处理：用自来水充分洗净，再用 70%乙醇冲洗表面后切成小块，在70%乙醇中浸泡2 分钟，再转移至0.1%升汞溶液中浸泡20分钟，然后 用无菌水冲洗4到5次，备用。
• 愈伤组织诱导及培养：将上述无菌红豆杉嫩茎小块 组织接种于含2ppm的2，4-D、0.5ppm的KT及10% 椰乳的MS培养基中，于25摄氏度的二氧化碳培养箱 中培养40天，PH5.8,即可形成小的愈伤组织块，然 后每隔30天进行一次移植继代培养。每次移植继代 培养均取一块愈伤组织，不另其混杂，如此多次移 植继代培养即可获得多个愈伤组织无性系。
• 细胞干燥及收集：每批细胞培养30天后，离心或过 滤收集细胞，用去离子水洗涤两到三次，每次抽干， 然后于30至40摄氏度低温下真空冻干，即得红豆杉 培养细胞成品。
分离纯化
1. 超临界提取 ,然后经己烷脱脂, 氯 仿萃取
2.HPLC 3.梯度洗脱
真菌发酵
发现历史：
• 1993年，美国蒙大拿州立大学的植物病理学家 Strobel和化学家Stierle在短叶红豆杉的韧皮部中发 现了一种内生真菌，它能够自主产生紫杉醇。
• 半合成方法一般以其前体10-脱乙酰浆果赤霉素Ⅲ为 原料，延长边链而成。另一种半合成方法是以10-去 乙酰巴卡亭Ⅲ为前体物来合成。
化学合成的缺陷
合成路线复杂，反应条件难以控制，产率低。
用到了剧毒的原料，仅限于实验室水平，很难进行工 业化生产。
半合成中的前体脱乙酰基浆果赤霉素仍是从红豆杉中 提取。
获取紫杉醇的途径
1
化学合成
2
红豆杉中提取
3
植物细胞培养
4
真菌发酵
化学合成
紫杉醇分子结构复杂，具有特殊的三环[6+8+6]碳架 和桥头双键以及众多的含氧取代基。先后共有30多 个研究组参与研究其全合成，经20多年的努力，于 1994年才由美国的R．A．Holton与 K．C．Nic~aou两个研究组同时完成紫杉醇的全合 成。随后，S．T．Danishefsky(1996年)、 P．A．Wender(1997年)、T．Mukaiyama(1998年) 和Kuwajima(1998年)4个研究组也完成这一工作。
从红豆杉中提取
• 紫杉醇在植物体内的含量相当低，目前公认含量最 高的短叶红豆杉树皮中也仅含0．069％
• 资源很匮乏
• 红豆杉生长缓慢， 树皮剥去后不能再生， 树木将死亡
红豆杉怀璧获罪
由于美国、加拿大等国家对红豆杉立法保护，药源地转向了中国等 国家。在 中国，８０％的红豆杉集中在云南，而且云南红豆杉的紫杉醇含量 最高。
紫杉醇的生物合成
背景介绍
紫杉醇是目前临床上最畅销的抗恶性肿瘤药物。
其特点是广谱抗癌。现为治疗卵巢癌和乳腺癌的一 线药物，对铂类等已有抗药性的顽固性卵巢癌亦有 效。此外，紫杉醇对肺癌、食管癌、膀胱癌、头颈 部癌、黑色素瘤、结肠癌和HIV引起的卡波济肉瘤 也有效。
人们已在紫杉醇结构基础上进行侧链改造，得到了 多西紫杉。