吲哚乙酸氧化酶活性的测定

植物生理学模块实验指导

李玲主编

科学出版社

吲哚乙酸氧化酶的测定方法

【实验目的】

学习用比色皿法测定吲哚乙酸氧化酶

【实验原理】

吲哚乙酸在吲哚乙酸氧化酶懂得作用下，被氧化破坏失去活性。吲哚乙酸氧化酶活力的大小可通过其破坏吲哚乙酸的速度表示，用比色法测定吲哚乙酸的含量。

【器材与试剂】

1.实验仪器与用具

分光光度计、离心机、恒温水浴锅、天平、研钵、试管、移液管、烧杯

2.实验试剂

1mmol/L 2,4-二氯酚：称取16.3mg 2,4-二氯酚，用蒸馏水溶解并定容至100ml。

1 mmol/L氯化锰：称取19.8mg MnCl2·4H2O，用蒸馏水溶解并定容至100ml。

1 mmol/L吲哚乙酸：称取17.5mg IAA，用少量乙醇溶解，用蒸馏水定容至100ml。

吲哚乙酸试剂：10ml 0.5 mol/L FeCl3，500ml 35% 过氯酸，使用前混合即可，不光保存。用时将1ml样品加入2ml试剂。

20 mmol/L磷酸缓冲液（pH6.0）

3.实验材料

同过氧化氢酶

【实验步骤】

1. 称取植物组织材料鲜重1.0g，置于研钵中，加5ml预冷的磷酸缓冲液研磨成匀浆，再加入1ml磷酸缓冲液稀释，4000r/min离心20min，上清液为粗酶提取液。

2. 取试管2支，于1支试管中加入氯化锰1ml、2,4-二氯酚1ml、IAA2ml、粗酶提取物1ml、磷酸缓冲液5ml，混合。

3. 吸取反应混合液2ml，加入吲哚乙酸试剂4ml，摇晕。在黑暗条件下，置于30℃恒温水浴中20min，使显色。

4. 将显色的反应液与分光光度计中测定530nm处的OD值。根据读数从标准曲线上查出相应的吲哚乙酸残留量。

5. 配制浓度从0~30μg/ml的吲哚乙酸浓度，按照上述方法，分别测定OD值，绘制标准曲线或计算直线回归方程。

【实验报告】

按照下列公式，计算不同处理的材料吲哚乙酸氧化酶的活力（μg IAA/g鲜重·h）。

式中，C1为反应液中残留的酶IAA量（μg/ml）；C2为无酶提取液中的IAA量（μg/ml）；V1为样品制得的粗酶提取液体积（ml）；V为反应液中粗酶提取物体积（ml）；W为测试材料鲜重（g）；t为反应时间；10为反应液体积（ml）。

【注意事项】

制作标准曲线时，OD值在0.2~0.6时，测量的误差最小，所以当反应液浓度测定的OD 值大于0.6且接近1时，需要稀释后才能进行测定。

【思考题】

反应混合液与吲哚乙酸试剂混合后，为什么要在暗条件下对IAA进行显色反应？