原代细胞培养

鸡胚原代细胞的培养

[实验目的]

掌握鸡胚原代细胞培养操作的基本程序，观察单层细胞生长情况。

[实验材料]

9~10日龄鸡胚，Hank`s液（已含0.5%乳蛋白水解物），0.25%胰蛋白酶，NaHCO

，双抗，

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牛犊血清，手术剪，眼科镊，培养皿，细胞瓶，三角瓶，玻璃珠（置于三角瓶内），漏斗，纱布（置于漏斗中），30ml注射器，10ml注射器，塞子若干，蛋座，水浴锅。[实验内容及操作程序]

1、配液在Hank`s液中加入青、链霉素，使其含量为青霉素1000IU/ml，链霉素

100ug/ml。胰蛋白酶用含有青链霉素的Hank`s液（简称H液）按1:9比例稀释。用

7.5%NaHCO

调整pH至7.2~7.4（玫瑰红色）。

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2、取胚及剪碎将胚蛋气室端向上竖直于蛋座上，用碘酊消毒气室，以镊子击破卵壳并

弃之，注意不能让蛋壳碎屑掉入气势内，撕破卵膜并揭之，继撕破绒尿膜、羊膜，用镊子夹住或勾住鸡胚脖子部位，取出胚胎于平皿中。剪去头部、翅爪及内脏，用H 液洗去体表血液。用灭菌剪刀剪碎鸡胚，使其成为约1mm3大小的碎块，用H液小心洗涤2次。

3、消化将洗涤好的胚胎碎块转移入三角瓶中，尽量不要让组织块沾到平皿壁上，按组

织块量约3~5倍胰酶，加上瓶塞，37℃水浴约20min左右，每隔5min轻轻摇动1次。

待液体变混而稍稠，中止消化。

4、分散取出三角瓶后静置1min，让组织块下沉后轻轻倒去胰酶，塞好瓶塞，用力振

摇三角瓶，以使细胞分散下来。加入H液，轻轻振荡，待组织块下沉后，通过漏斗中的纱布将H液过滤于细胞瓶中，小心不让组织块一并倒出。继续用力振摇三角瓶，加H液过滤，重复两次，最后一次连同组织块一起倒入漏斗。

5、加入血清在过滤好的细胞悬液中加入牛犊血清，使血清含量为10%。塞好瓶塞，轻

摇细胞瓶混匀。

6、分装将加入血清的细胞悬液分装至各个细胞瓶中，约占细胞瓶容积的10%左右。塞

紧瓶塞，将细胞瓶横卧，瓶上注明组别、日期，置37℃温箱培养。4h后细胞可贴附于瓶壁，每隔24h观察一次，24~36h生长成单层细胞，此时可吸取培养液，更换维持液，并接种病毒。

附：[主要试剂配制]

1、Hank`s 液

原液A

先将固体成分加于800ml 双蒸水中，加温到50~60℃溶解，再加入 CaCl 2溶液，最后加双蒸水补足到1000ml 。加氯仿2ml ，摇匀后4℃贮存。

原液B

将上列各物混合后使其溶解，加氯仿2ml ，摇匀后4℃贮存。

Hank`s 工作液

2、0.4%酚红溶液配制

酚红

0.4g 0.1%NaOH 溶液 11.28ml

将酚红置于研钵中，边研磨边缓缓加入NaOH 溶液，直到所有颗粒完全溶解，置于100ml 两杯中，最后加双蒸水至100ml ，摇匀后，保存于4℃冰箱备用。

3、O.5%乳蛋白水解物溶液配制

NaCl 8g MgSO 4·7H 2O 2g KCl 8g Mg Cl 2·6H 2O 2g 2.8%CaCl 2 100ml 双蒸水 加至100ml

Na 2HPO 4·12H 2O 1.2g KH 2PO 4·2H 2O 1.2g 葡萄糖 20g 0.4%酚红 100ml 双蒸水 加至100ml

水瓶中，每瓶95ml，115℃灭菌10min，保存于4℃冰箱内备用。