对活性氧与植物细胞程序性死亡关系的研究进展

对活性氧与植物细胞程序性死亡
摘要细胞程序性死亡( PCD)发生在许多植物生长发育过程中和非生物的逆境条件下，是由细胞自身基因编码的、主动的、有序的细胞死亡形式。

在植物细胞中，线粒体ETC的复合物I和III 是ROS产生的主要部位。

大量证据表明，活性氧(ROS)在植物的生长、发育和对外界生物和非生物环境刺激的反应及细胞程序性死亡等调控过程中是一个重要的信号分子。

而线粒体处于PCD调控的中心位置。

本文综述了ROS的产生、ROS在植物抵御环境胁迫中的作用以及存在的问题与展望。

关键词细胞程序性死亡( PCD) 活性氧(ROS) 信号转导
Reactive Oxygen Species and Programmed Cell Death in Higher Plants
Abstract This paper discribed plant programmed cell death (PCD) , generally occuring during many developmental processes and abiotic stress conditions, is a driving cell death process regulated and controlled by gene.In plant cells, complexes I and III of mitochondrial electron transport chain(ETC) are major sites of reactive oxygen species(ROS) production.A lot of evidence suggested that ROS can act as ubiquitous signal molecules during Plant Growth and Development ,environmental stimuli responsed and programmed cell death(PCD) regulated in plants. Mitochondrion plays a role of central postiton.
Keywords programmed cell death (PCD) reactive oxygen species (ROS) signal transduction 前言
植物细胞程序性死亡(p rogrammed cell death,PCD)普遍存在于植物生长发育及环境相互作用过程中,是由基因调控的、主动的细胞死亡过程[1]。

大量研究已证明,在逆境胁迫因子如病原体、盐害、低氧、低温、热激、金属离子等作用下，植物为了抵御不良环境的侵害，诱导植物体的特定部位发生PCD，形成细胞主动性死亡，从而避免逆境对其他组织进一步伤害，并使植物获得对不良环境的适应性。

近年来，植物对各种环境胁迫的反应已在生化和分子水平上进行了广泛的分析。

越来越多的证据表明活性氧(ROS)在植物适应不同的环境胁迫的生命过程中起着重要的作用。

植物中的活性氧ROS最初被认为是氧化代谢的有毒的副产物，能被各种抗氧化剂和抗氧化酶清除。

近年来才慢慢发现ROS在植物在生长、发育、对外界生物和非生物环境刺激的反应,细胞程序性死亡等调控过程中是一个重要的信号分子。

在植物细胞中线粒体是产生活性氧的主要部位[2]。

ROS既可通过电子传递过程产生，也可通过代谢产生。

当出现环境胁迫时ROS的产生与清除将失去平衡, 产生氧胁迫[3]。

这时会产生过量的ROS，如超氧阴离子自由基( O2-) 、过氧化氢(H2O2) 、羟自由基(·OH)、一氧化氮( NO) 等，通过与细胞内生物大分子反应，导致DNA、蛋白质的损伤和膜脂质的过氧化。

自从1923年Allen和1961年Leopold对植物细胞死亡进行研究，并引入了细胞程序性死亡的概念以来，植物PCD 的研究逐渐引起植物学家的关注[4]。

目前人们普遍认为，ROS与植物细胞的程序性死亡有关；在植物的PCD过程中ROS可能起到三方面的作用: 一是低浓度时作为信号分子传递环境胁迫信号；二是中等浓度时能诱导细胞发生PCD；三是高浓度时细胞发生坏死[3]。

1.环境胁迫下植物ROS的生成
ROS的生成是与环境胁迫相关的,主要为超氧阴离子( O2-)、过氧化氢(H2O2 )和羟自由基(·OH)等。

ROS通常在植物光合作用和光呼吸作用的需氧相中产生[5]。

在细胞凋亡中ROS的积累主要来自于过氧化物酶、胺氧化酶和NADPH氧化酶活性的增强和细胞内ROS清除能力的降低[6]。

植物中,叶绿体被认为是ROS产物新陈代谢的中心，它是O2-和H2O2主要生产者，并
包含一系列的ROS清除机制[7]。

线粒体可能也是重要的反应中心，需氧生物中大部分的氧被线粒体用来氧化底物和生产A TP，ROS稳态的转变激发了线粒体的转运孔的开放和形态学的变化将细胞色素C从线粒体中释放出来[8]。

2.ROS在植物抵御环境胁迫中的作用
2.1ROS的双重作用
ROS在植物PCD中作为信号分子的最早实验证据是在细胞的悬浮培养中，H2O2诱导的细胞死亡能被放线菌酮和蛋白酶抑制剂所阻碍[9]。

从那时起,越来越多的证据表明在激发PCD 中ROS起着关键的作用。

ROS根据积累水平的不同起着双重作用。

高浓度的ROS能导致不可逆转的伤害和细胞死亡。

在高浓度下(氧胁迫) ,各种ROS表现为十分活跃的分子。

它们几乎杂乱的和细胞内所有组分发生反应,破坏蛋白质结构、诱变DNA链断裂、氧化嘌呤等[10] 。

此时,生物膜发生了脂质过氧化,这不仅直接影响正常细胞的功能,也使脂质衍生的有毒产物进一步加重了氧化胁迫。

尽管ROS的性质和活性使它们对细胞是有害的,但植物利用它们在不同的生命过程(细胞分裂、趋向性生长、细胞死亡和防御机制等)中的信号转导级联中充当第二信使[11]。

现已广泛接受ROS的积累在植物发育和防御机制中起着关键的作用。

一个瞬时的氧爆发和接下来的瞬时的细胞内氧化还原状态的改变是在生物和非生物胁迫反应中却是普遍存在的。

植物细胞具有高效的ROS清除机制,使细胞免受ROS的毒害，并能使这些具有短暂活性的分子作为信号转导因子的作用。

ROS能被很多酶所清除,包括超氧化物歧化酶(SOD)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、过氧化氢酶(CA T)、谷胱甘肽过氧化物酶(CA T)，还能被非酶抗氧化化合物VC、VE、谷胱甘肽和β-胡萝卜素清除。

2.2活性氧在植物防适反应中的信号分子作用
最近的研究表明, 在超敏反应( Hypersensitive response, HR)中，小GTP结合蛋白Rac(动物NADPH 氧化酶调节因子) 能介导依赖于ROS的HR的发生[12].。

推测在HR反应中，ROS跃升很可能是由NADPH氧化酶的活性所致。

PCD是受遗传控制的，具有动物细胞中细胞凋亡(apoptosis) 的特征：细胞皱缩、细胞质和细胞核浓缩，异染色质增加，细胞质空泡化以及DNA片段化等[13]。

有结果显示ROS可能参与了植物生长发育中的PCD。

在植物胚芽形成的晚期迸行干旱处理，超氧化物歧化酶( superoxide, SOD) 和过氧化氢酶( catalase, CA T) 首先在胚芽中大量表达，可能是为了防止ROS的产生[14]。

最近，在莴苣叶子的导管细胞中发现有O2-和H2O2 等ROS积累。

在百日菊的TE分化中也发现有Ca2+、G蛋白和细胞外源蛋白酶的参与。

1994年Demura和Fukuda发现百日菊的叶肉细胞被诱导分化成导管时，在NADPH氧化还原酶作用下产生了大量的O2-和H2O2，从而诱导了PCD发生。

但也有实验表明，H2O2在TE分化中诱导了坏死或ZRNasel( TE 细胞特异死亡基因)的表达而不是PCD，且Diphenyleneiodonium(NADPH 氧化酶抑制剂) 对TE的PCD 过程并无抑制作用，显示木质部分化的过程中并没有活性氧爆发的现象。

环境胁迫诱导PCD的产生是通过一系列信号分子介导的，这些信号分子包括ROS、乙烯、Ca2+、水杨酸(SA)和NO等。

由于ROS具高度的活泼性，能造成细胞和细胞器的伤害，因此常被认为是有害的甚至是致命的。

然而最近的研究表明ROS很可能作为信号转导途径的重要组成物质来影响PCD及其保护系统的表达。

这些保护系统的防御反应包括活性氧的产生、过敏反应、防御屏障(如木质素和富含羟脯氨酸的细胞壁蛋白质)的形成、病程相关蛋白和其它防御相关蛋白的合成、植保素的合成等。

最近的研究结果表明活性氧在植物防御机制中可能起关键作用。

环境胁迫因子如O3、冷害、高光照、重金属、机械损伤、干旱、UV以及病程反应都是通过ROS产生而起作用，且这些产生氧胁迫的刺激因子都能诱导某种保护基因(如GST1、GPX、PR1)的表达，并启动一种O3或H2O2特异性PCD途径。

ROS能使病原-植物产生
不亲和性从而诱导过敏反应，ROS既可作为毒性分子直接杀死病原，也可通过引起细胞壁木质化、富羟脯氨酸细胞壁结构蛋白的氧化交联、胼胝质合成等加固细胞壁结构，阻碍病原的继续侵入。

此外ROS还可诱导某些产物如植保素、水解酶(几丁质酶、β-葡聚糖酶等)、蛋白酶抑制剂等的合成以抵御入侵的病原。

这种过敏性反应与动物组织中的发炎和吞噬作用非常相似。

继过敏之后，植物会产生一种对各种再次入侵的病原广谱且较为持久的周身抗性，称为系统获得性抗性。

许多证据显示，在这种非特异性反应中，H2O2可能作为信号分子，参与信号传导、诱导植物防御基因的表达。

病原菌入侵时植物体内不亲和的R基因诱导细胞致死前，大量ROS在细胞内迅速产生并积累。

含细菌或真菌A vr基因的培养基中培养的细胞内活性氧含量增加。

在该体系中，有两个活性氧产生高峰，第一个峰在1h内产主, 而第二个峰在4-5h后产生，且较为稳定。

少量活性氧能诱导抗氧化酶如谷胱甘肽氧化酶、谷胱甘肽转化酶等的表达，而活性氧的大量产生则能迅速诱导R基因诱导的PCD。

这说明ROS可诱导被感染的细胞发生PCD, 又扩散至其周围细胞诱导其体内保护系统的表达。

近来的研究表明ROS 在PCD中执行两种重要功能:首先在PCD初期作为一种可选择性诱导信号分子；其次在PCD 后期，作为线粒体膜透性改变的一种共同结果，最终导致细胞解体[15]。

在拟南芥突变体lsd1 中，大剂量ROS直接参与植物细胞的原位“自杀”作用, 而低剂量的ROS则作为一种信号，诱导细胞凋亡。

突变体lsd1常在细胞间积累过氧化物，lsd1细胞对胞间过氧化物很敏感，诱导细胞发生PCD。

野生型LSD1可看作一个调节细胞死亡的变速箱，在高信号水平时启动细胞死亡，低信号水平时则阻止细胞死亡。

因此ROS的生物学效应具双重性。

虽然越来越多的事实证明活性氧在诱导和启动HR中起作用，也有一些研究显示活性氧没有参与HR诱导死亡。

细菌引起的活性氧爆发有两个阶段,其中阶段II能引起HR，但这个阶段在烟草中也能被突变细菌诱导但没有HR。

另外虽然H2O2在某些情况下能引起细胞死亡，但当死亡因子C. fulvum 菌存在时，它并不能诱导烟草的死亡。

可能象哺乳动物一样，它需要与氮氧化物共同起作用。

在大豆和玉米中发现HR过程中NO合成酶活性上升。

NO本身并不能引发细胞死亡，但它可能协同ROS引发细胞死亡及调节相夫的由ROS调节的防卫基因的表达。

ROS诱导HR的情况可能因不同植物不同情况而有所不同。

H2O2是一种相对稳定的代谢物，而且在细胞内存话时间较长，可以从产生位点扩散到细胞中的各个部位。

因此，可被认为是第二信使, 是目前研究较为深入的氧化胁迫的一个刺激子。

作为信使的活性氧，其作用位点可能位于信号传递途径中的不同层次：它可以氧化质膜受体上的巯基，便受体活化；它可以活化或抑制信号级联反应中的重要酶类，例如H2O2可以活化酪氨酸激酶、蛋白激酶C或抑制酪氨酸磷酸化酶；H2O2可以活化基因应答元件( response element ) 。

2.3ROS在诱导细胞程序性死亡中与其他信号分子的作用
在植物发生PCD过程中也存在着ROS和其他信号分子紧密的相互作用。

2.3.1与水杨酸和乙烯的交互作用
研究表明依赖H2O2的PCD与水杨酸SA和乙烯水平的增长相关联。

潘秋红[16]等在高温锻炼( 37℃，2h)过程中,豌豆叶片H2O2和游离态SA含量都有一个高峰，H2O2的迸发早于游离态SA的积累。

王弋博[17]等发现UV-B能诱导玉米幼苗活性氧和乙烯的产生，其中ROS参与了UV-B 胁迫诱导的乙烯的产生。

Danon et al[18]等发现在拟南芥乙烯突变体中一种SA降解酶(儿茶酚)的过量生成来缓解植物发生PCD,表明在ROS依赖的细胞死亡中乙烯和SA起着正反馈循环的作用。

2.3.2与NO的协同作用
近年来，NO被认为是在逆境下通过多种途径与ROS相互作用的主要的信号分子。

NO 与H2O2相互关系的典型例子是在植物抵抗病原菌的入侵中，尤其发生在植物过敏反应过程中(HR)。

在HR反应中，随着活性氧的爆发NO的生成也在NO合酶活性增强的情况下达到高
峰[19]。

在动物模型中，NO和ROS对细胞的毒性是由于NO与O2-反应形成过氧亚硝酸盐阴离子ONOO- ,其能够造成氧化损伤和蛋白质变形如酪氨酸的硝化和巯基残基被氧化等[20]。

相反，植物中ONOO-并不是NO - ROS诱导细胞死亡的关键物质，它在植物细胞中未表现出特殊的毒性。

植物中ONOO- 是NO和H2O2的反应产物。

在植物HR反应的细胞死亡中，H2O2和NO能造成细胞色C从线粒体中释放并导致似caspase的信号级联反应[21]。

已经知道H2O2和NO也能反应产生单线态氧或羟自由基,而这些ROS种类也能诱导细胞死亡。

ROS和NO能够通过几种途径互相控制。

使用NO供体发现NO能通过抑制抗氧化物酶的活性来调节ROS的水平[22] 。

NO可能影响过氧化氢酶(CA T)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)和细胞色素C氧化酶(COX)等含血红素铁的酶活性来参与植物体内的生理代谢。

Clark[22]等在烟草
中发现外源NO 通过可逆抑制CA T和APX 活性而使H2O2积累。

然而，Guo[23]等发现在不能表达At - NOS1拟南芥植物，目前为止唯一鉴定的NO合酶,体内呈现出高水平的ROS，表明在某种条件下NO起着抗氧化的作用，降低细胞的损伤和衰老。

其他的研究也表明植物在抵抗生物逆境中，NO的保护作用是和NO介导的降低植物体内ROS密切相关的[24] 。

这些结果为NO在植物体内的抗氧化作用和它可能直接清除ROS提供了有力证据。

另一方面，O2-和H2O2产生的相对速率在调节NO的反应中是关键的。

已经有模型提出,如果NO -O2-的平衡有利于O2-，那么NO就在与H2O2反应前被清除。

如果这种平衡有利于NO，那么O2-就在它转变成H2O2前被清除。

然而NO和H2O2的协同作用能导致细胞的死亡,而NO和O2-的相互清除导致ONOO- 的形成，它在植物细胞中没有特殊的毒性[25]。

2.3.3与MAPKs的作用
其他重要的逆境信号分子还包括细胞分裂素活化蛋白激酶(MAPKs)。

MAPK级联反应的最简单模式由一个MAPKKK - MAPKK - MAPK组成，它们在信号转导中通过多种途径连接上游受体和下游靶分子。

MAPK模式的活化要通过其组分内激酶的顺序磷酸化来进行的，MAPKs的激活能磷酸化一系列物质包括转录因子、其他的蛋白激酶和细胞骨架蛋白等[26]。

许多MAPKs能被渗透胁迫、冷害、盐害、干旱和创伤所激活，所有的这些条件能扰乱植物氧化还原的平衡。

许多研究认为逆境诱导的MAPKs的活化是由于ROS对MAPK途径的上游起作用。

Moon等[27]发现转基因植物中增加ROS的积累能活化多种MAPKs，MAPKs能调节细胞的氧化还原态来增强植物对多种胁迫的耐受性。

拟南芥中的MPK3、MPK4、和MPK6 都能被细菌和真菌病原体诱导的ROS和相关分子所活化[28]。

与此相似的研究表明拟南芥MKK4或MKK5基因的活化表达导致H2O2 的产生和细胞死亡[29]。

而蛋白激酶抑制剂则阻碍烟草细胞的死亡、氧爆发、和抗逆基因的表达[30] 。

在非生物逆境中,臭氧能作为直接的ROS前身,对拟南芥进行臭氧处理能导致MPK3和MPK6的核转运的活化[31]。

用不同的重金属处理苜蓿叶片发现,四种不同的MAPKs蛋白在复杂的机制下被激活[32] ,这表明了MAPKs除了能提高ROS的水平，不同的重金属能通过不同的机制有选择的激活特定的MAPKs。

3总结与展望
环境胁迫对植物细胞的伤害在很大程度上是由于ROS浓度上升所致，ROS已成为环境胁迫诱导PCD的一个重要信号分子，它们在植物抵御病原菌和非生物胁迫过程中起着非常重要的作用。

目前，人们普遍认为,在植物的PCD过程中ROS可能起到三方面的作用：一是低浓度时作为信号分子传递环境胁迫信号；二是中等浓度时能诱导细胞发生PCD；三是高浓度时细胞发生坏死。

但到目前为止在分子水平上ROS通过对细胞内生化及转录的影响来杀死一些细胞、增强植物抵抗进一步胁迫的机制还不是十分清楚。

植物在与氧化还原相关的PCD中参与了多种信号分子,但是它们之间的相互调控网络的研究才处于初级阶段。

虽然不同的胁迫能导致细胞ROS的积累，但对这些逆境的最终反应是根本不同的，一个特定的ROS的种类、
它在亚细胞水平的定位、浓度、扩散性和特定的半衰期等都可能介导着不同的细胞反应。

因此，许多问题还有待进一步研究。

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